第二章 紫外-可见分光光度法-1

第二章紫外 可见分光光度法 Ultraviolet VisibleSpectrophotometry 又称 紫外 可见分子吸收光谱法 Ultraviolet VisibleMolecularAbsorptionSpectrometry 2 1紫外 可见分光光度法发展简史1729年 Bouguer首先发现溶液对光的吸收与液层厚度之间的关系 1760年 Lambert就此基本定律进行了数学运算 确定了相应的关系式 1833年 Brewster在提取叶绿素及胡萝卜素的研究中 注意到有机化合物的吸收光谱 然而某些学者认为比色法起始于1852年 因为在这一年 Beer参考了Bouguer和Lambert的早期著作 提出了比色法的基本定律 硫氰酸盐法和亚铁氰化物法测定铁 Nessler法测氨 硫氰酸盐法测钼 都是19世纪中叶就已提出来的分析方法 随着对光度分析方法的不断研究和深入 人们对分析方法的灵敏度和选择性也提出了更高的要求 在经典光度法的基础上 又发展了双波长分光光度法 动力学分光光度法等 使光度分析的内容和应用范围进一步扩大 近年来 随着有机试剂的迅猛发展 使大量的有机试剂应用到分析测试领域 光度分析方法的灵敏度 选择性得到了不断提高 最初 比色测定是在比色管中进行的 19世纪末 开始使用带滤光片的目视比色计 20世纪30年代 光电比色计和分光光度计才被引入实验室 20世纪初期的分光光度计多为单光束手控型 20世纪60年代 双光束自动记录光度计问世 20世纪70年代开始 微处理机控制的分光光度计不断出现 双波长分光光度计迅速发展和商品化 2 2紫外 可见分子吸收光谱法概述1 紫外 可见分子吸收光谱法产生的本质在分子中 除了原子的核能En 质心在空间的平动能Et外 还有电子运动能Ee 原子之间的相对振动能Ev以及分子转动能Er等 分子的总能量可写为 E En Ee Ev Er Et 由于En在一般化学实验条件下不发生变化 分子的平动能Et又比较小 因此当分子能级发生跃迁时 能量的改变为 E Ee Er Ev图2 1表示双原子分子的能级图 图2 1表示双原子分子的能级图 E 总 Ee Ev Er 1 20eV0 05 1eV 0 05eV 相当于紫外 相当于红相当于红外光可见光能量外光能量甚至微波的能量 1 紫外 可见吸收光谱产生的本质 紫外 可见吸收光谱产生的本质是由物质分子中价电子的能级跃迁所产生的 电子能级跃迁时伴随振动能级和转动能级的跃迁 因此电子光谱 也称 紫外 可见吸收光谱 得到的也是由许多谱线聚集而成的谱带 2 紫外 可见光谱区域范围 紫外 可见光谱区域范围 10 400nm称为紫外区 400 800nm为可见光区 10 200nm称为远紫外区 200 400nm称为近紫外区 玻璃器皿及有关光学元件不适合作紫外分析之用 是由于玻璃对波长小于300nm的电磁波产生强烈吸收的缘故 所以 做紫外分析时 一般采用石英制件 2 紫外 可见吸收光谱中价电子跃迁的类型在有机物中 有几种不同的价电子 以甲醛为例 例 H C O a 单键 电子 b 双键 电子 H c 未成对的独对 孤 电子 n电子 图2 2各种价电子跃迁相应的能量示意图 1 根据分子轨道理论 此三种电子的能级高低次序是 n 2 共有六种跃迁类型 n n 和 其中 三种跃迁需要能量较大 吸收峰小于200nm 位于真空紫外区 而n n 和 三种跃迁需要能量相对较小 吸收峰位于近紫外区甚至可见区 对于紫外 可见分子吸收光谱分析具有重大意义 n 跃迁的区别 n 10 100L mol cm 跃迁产生的吸收峰强度低于 104L mol cm 随着溶剂极性的增加 跃迁所产生的吸收峰红移 n 跃迁所产生的吸收峰蓝移 3 除上述六种跃迁可产生紫外 可见吸收谱带外 还有两种跃迁也可产生紫外 可见吸收谱带 即电荷转移跃迁和配位场跃迁 综上所述 发生在电磁光谱的紫外和可见光区内 由于电子的跃迁或转移而引起的吸收光谱共有以上八种价电子跃迁类型 3 在有机物的紫外 可见谱解析中吸收带的分类在有机物的紫外 可见谱解析中 通常将吸收带分为以下四种类型 1 R吸收带 R带由n 的跃迁引起的吸收带 这是由CO或NO2等单一的发色团引起的 一般 max 100L mol cm 测这种吸收带需用浓溶液 随着溶剂的极性增大 会产生蓝移 紫移 2 K吸收带 由 的跃迁所产生的 其特点是强度高 max 104L mol 1 cm 1 含共轭生色基的化合物的紫外谱都有这种吸收带 例如 丁二烯的K带吸收 max 21000L mol 1 cm 1 max 217nm 3 B吸收带 由苯环振动和 的跃迁重叠而引起的芳香族化合物特征吸收带 例如 苯的B带吸收在230 270nm 呈精细的振动结构 当苯环与生成基相连时 就有B和K两种吸收带 其中B带的波长位置较长 例如 苯乙烯K带 244nm 带 282nm 4 E吸收带 在苯环结构中三个乙烯键的环状共轭系统中 跃迁所产生的芳香族化合物的特征吸收带 称为E带 特点 E带可分为E1带 180nm 和E2带 200nm 它们都是强吸收带 而相应苯的B带 253nm 是较弱的吸收带 无机化合物的紫外 可见吸收光谱在溶液中无机络合物的紫外 可见吸收光谱 其吸收带往往宽而少 一般由两类形式的跃迁所产生 配位场跃迁和电荷转移跃迁 1 配位体场吸收光谱 吸收带概念 配位体场吸收谱带指的是过渡金属水合离子或过渡金属离子与显色剂 通常是有机化合物 所形成的络合物在外来辐射作用下 由于吸收了适当波长的可见光 有时是紫外光 从而获得的相应吸收光谱 机理 过渡金属络合物中 由于配位体的影响 中心离子的d轨道或f轨道能级发生分裂 当过渡金属络合物吸收了可见或紫外光区的某部分波长的光时 d电子或f电子就可以从较低的能级跃迁到较高的能级 称为d d跃迁或f f跃迁 这种跃迁一般发生在可见光区 特点 配位体场吸收光谱通常位于可见光区 强度弱 摩尔吸收系数 约为0 1L mol cm 100L mol cm 2 电荷转移吸收光谱 吸收带概念 电荷转移吸收光谱指的是许多无机物 如 碱金属卤化物 和某些由两类有机化合物混合而得的分子络合物 它们在外来辐射激发下会强烈地吸收紫外或可见光 从而获得的紫外 可见吸收光谱 机理 在这一吸收过程中 实际上是发生了一个电子从体系的一部分 称为 电子给予体 转移到体系的另一部分 称为 电子接受体 的过程 因而这样获得的吸收光谱称为电荷转移吸收光谱 类型 i 配位体 金属的电荷转移例 Fe SCN 6 3 呈深红色 在490nm附近有强吸收 这就是由于该络合物吸收了某波长的光 使一个电子从SCN 的某一轨道跃迁到Fe3 的某一轨道上 ii 金属 配位体的电荷转移产生这种电荷转移的必要条件是 金属离子容易被氧化 处于低氧化态 而配位体容易被还原 配位体具有空的反键轨道 可接受从金属离子转移出来的电子 iii 分子络合物内部电荷转移例如 在乙醇介质中 将醌与氢醌混合 就可以得到美丽的醌氢醌暗绿色结晶 它的吸收峰在可见光区 特点 电荷转移吸收光谱的最大特点是 吸收强度大 摩尔吸收系数 一般超过104L mol cm 3 两种吸收谱带的区别这类光谱一般位于可见光区 电荷迁移吸收产生的谱带较宽 吸收强度大 最大波长处的摩尔吸收系数 max可大于104L cm 1 mol 1 与电荷迁移跃迁比较 配位场跃迁产生的吸收谱带的摩尔吸收系数小 一般 max 102L cm 1 mol 1 2 3分光光度法的对比度1 对比度的概念在光度法中 对比度是指显色剂与金属离子所形成络合物 MeR 的最大吸收峰波长 MeRmax 与显色剂本身 HnR 最大吸收峰波长 HnRmax 之间的差值 对比度以 来表示 MeRmax HnRmax 一般认为 40nm时 显色反应对比度较小 40 80nm时 显色反应对比度为中等 80nm时 显色反应具有较高的对比度 一般要求显色剂与有色化合物的对比度 在60nm以上 2 对比度在实际分析测定中的意义对比度实质上表示了显色反应颜色变化的程度 反映了过量显色剂对测定体系的影响 如果显色反应的对比度大 则过量试剂对测定的影响较小 反之 对比度小 则过量试剂对测定的影响就比较大 如何选择测定波长 如果显色反应的对比度较大 则测定波长往往与络合物的最大吸收波长一致 如果显色反应的对比度较小 此时测定波长决定于 MeR HnR 的比值或 MeR HnR 的差值 因此 对比度的概念可为选择测定波长提供帮助 3 影响对比度的因素对比度的大小与显色剂的结构 反应条件 金属离子的性质及络合物的组成有关 2 4光吸收定律 朗伯 比耳定律1 朗伯 比耳定律 Lambert BeerLaw 1 定义1 A lgI I为吸光度 Absorbance 其中 I 和I分别为试样入射光强度和出射光强度 2 朗伯 比尔定律的数学表达式为 nA icili 1其中 i表示某一吸光质点 c为浓度 单位mol L l为液层厚度 单位为cm 为摩尔吸光系数 单位L mol cm 表示物质分子对某一波长光的吸收本领 称为吸收系数 与物质性质 入射光波长及温度等因素有关 该式物理意义为 物质的吸光度与物质的吸收系数和浓度的乘积成正比 吸光度具有加和性 nA A1 A2 A3 An Aii 1 当物质中只有一种吸光组分 则上式可简化为 A cl 3 定义2 若将I I0称为透光度 亦称 透射率 用T表示 T I I0则A lgI0 I lgT cl 2 朗伯 比耳定律成立的条件及其偏离该定律的因素 1 成立的条件 a 适用于极稀的溶液 一般c 0 01mol L b 电磁波辐射和所讨论的吸光成分之间的相互作用机制只是光被该成分所吸收 c 采用 单色光 d 吸收成分 分子或离子 的行为相互无关 且不论其数量和种类如何 2 偏离该定律的因素图2 3定量分析中的校正曲线 偏离朗伯 比耳定律的主要原因有 a 在实际工作中 由出射狭缝投射到被测物上的光 并非理论上所要求的单色光 而是一个有限宽度的谱带 称为光谱通带 b 散射的影响 当被测试样中含有悬浮物或胶粒等散射质点时 入射光通过试样就会因为光的散射而损失一部分 使透射率减小 而吸光度增大 导致偏离比耳定律 质点的散射强度与入射光的波长四次方成反比 因此散射对紫外区的测定影响更大 c 化学因素 若在试样中 被测组分发生离解 缔合 光化及互变异构等作用 或与溶剂发生相互作用 就会使被测组分的吸收曲线明显改变 导致偏离比耳定律 d 荧光的影响 某些物质吸收光后 会重新辐射出与入射光波长相同或波长更长的光 荧光的存在将导致比耳定律的失效 e 非平行光的影响 若入射光不垂直于吸收池的光学面 这就使得通过试样的实际光程大于吸收池的厚度 但这种影响很小 一般可忽略 3 朗伯 比尔定律的应用条件朗伯 比尔定律不仅适用于紫外光 可见光 也适用于红外光 不仅适用于均匀非散射的液态样品 也适用于微粒分散均匀的固态或气态样品 2 5紫外 可见分光光度法的分析方法1 定性 定量分析的依据物质分子结构 E 跃迁能 特征吸收谱 光吸收选择性 定性吸收谱高度或面积 定量 1 定性分析方法用紫外 可见吸收光谱来鉴定一个化合物 通常是将该化合物的光谱特征以及吸收峰的形状与纯化合物的标准紫外 可见吸收光谱图作比较 如果没有标准物 可借助紫外 可见标准图谱或有关电子光谱数据资料进行比较 常用的标准谱图有以下四种 a SadtlerStandardSpectra Ultraviolet Heyden London 1978 b R A FriedelandM Orchin UltravioletandVisibleAbsorptionSpectraofAromaticCompounds Wiley NewYork 1951 c KenzoHirayama HandbookofUltravioletandVisibleAbsorptionSpectraofOrganicCompounds NewYork Plenum 1967 d OrganicElectronicSpectralData JohnWileyandSons 1946 不能单凭紫外 可见吸收光谱数据来鉴定某一未知物 紫外 可见吸收光谱是配合红外光谱 质谱和核磁共振波谱进行有机物结构研究的一种有效的工具 2 定量分析方法a 标准工作曲线法 校正曲线法 可能存在背景干扰见图2 4 图2 4标准工作曲线 校正曲线 b 增量法 标准加入法 可消除背景干扰方法 绘制A 增量 c的校正曲线 见图2 5 图2 5增量法校正曲线 其中 OO 长度所对应的浓度Cx就是未知试样中被测组分的浓度 2 分光光度法的扩展 1 催化分光光度法 或称 催化比色法 动力学分光光度法 如果催化反应是一个显色或褪色反应 就可以用分光光度法测定催化反应的反应物或生成物之一的浓度变化 这就是催化分光光度法 反应速度在一定范围内与催化剂的用量有一定的比例关系 被测组分是催化剂 W例如 H2O2 2I 2H I2 2H2OpH一定时 d I2 dt k H2O2 I 2 W d I2 dt k W 积分得 I2 k W t 1 根据光吸收定律 I2 A l 2 将 2 式代入 1 式得A k W t 3 3 式就是钨的动力学分光光度法测定的基础 在此式的基础上 可分为三个基本方法测定钨的浓度 预先配制一系列钨的标准溶液 在相同条件下记录吸光度A随时间t变化的动力学曲线 如图2 6所示 图2 6A t曲线 定量方法 a 固定时间法 3 式变为 A k W 作A W 图 用待测样品在t时的At值在工作曲线上求出相应的 W x值 见图2 7 a 图2 7 a A W 曲线 b 固定浓度法 3 式变为 W k t 1 W t 1测定达到某一预定A值时的时间t 绘制t 1 W 标准工作曲线 见图2 7 b 图2 7 b t 1 W 曲线 c 正切法 斜率法 由 3 式得A k W tA t k W 则 A t W 而A t即为A t关系曲线的斜率 求出每条A t曲线的各自斜率tg 再在图2 7 c 上由tg x求出相应W的未知浓度Cx 图2 7 c tg x w 曲线 2 双波长分光光度法仪器结构图见2 8 2 8 A 1 lgI1 I0 1cl AbA 2 lgI2 I0 2cl Ab 其中 I0 I1和I2分别为开始照射到吸收池的两束光强度及通过吸收池后两束光强度 Ab和Ab 为背景吸收 若 1与 2很接近 可以认为其背景吸收相同 即 Ab Ab A A 2 A 1 2 1 c l A c绘制 A c工作曲线可以测得组分含量 这就是双波长分光光度法定量分析的依据 等吸收波长法中波长选择的原则 a 干扰组分在两个波长处等吸收 b 被测组分在选定的两个波长处的 A要足够大 以便保证有足够的灵敏度 见图2 9 图2 9作图法确定 1和 2 等吸收波长法a 组分a的吸收曲线b 组分b的吸收曲线c 两组分混合后的吸收曲线 3 导数分光光度法A lgI I0 bc则 dnA d n bcdn d n 导数光谱具有以下特征 a 谱带的极值数随导数阶数的增加而增加 一个吸收带经过n次求导后 产生的极值 包括极大和极小 数为n 1个 b 零阶曲线的极大处 相应于奇阶导数 n 1 3 5 曲线过零点 零阶曲线的拐点处相应于奇阶曲线为极大或极小 c 偶阶导数 n 2 4 曲线的形状与零阶曲线较为相似 零阶曲线的极大处相应于偶阶导数曲线的极大或极小 零阶曲线的拐点相应于偶阶导数曲线通过零点 d 在导数曲线中 随着求导阶次的增加 谱带变锐 带宽变窄 二阶导数曲线的半宽度仅为零阶曲线半宽度的1 3 四阶导数曲线的半宽度仅为零阶曲线半宽度的1 5 例如 典型的高斯型吸收曲线 或称零阶曲线 及其相应的一至四阶导数光谱 见图2 10 图2 10吸收光谱与导数光谱的峰和谷的关系a 吸收光谱 b e 一至四阶导数光谱 由导数光谱进行定量测量的计算方法如图2 11所示 图2 11导数光谱的求值法 a 正切法 画一条直线正切于两个邻近的极大或极小 然后测量中间极值至切线的距离 d 作为导数值 b 峰谷法 在多组分的定量分析中多采用两个相邻极值 极大和极小 间的距离 图中的p1和p2 作为导数值 c 峰零法 极值到零线之间的垂直距离 z 也可以作为导数值 4 胶束增溶分光光度法所谓胶束增溶是指金属离子与络合剂反应时 加入离子表面活性剂 形成 胶束 它均匀地分布在体系中 可以和被测组分发生缔合或把被测组分包围起来 对缔合物起分散剂的作用 使多元离子缔合物发生胶束增溶现象 而稳定地保持在水溶液中 因而大大地提高了方法的灵敏度 5 溶剂萃取分光光度法溶剂萃取与分光光度法相配合 同样地可以大大地提高测定的灵敏度 在分光光度法中 除了用溶剂萃取分离干扰离子外 更常在萃取后的有机相中直接进行比色测定 因而使测定既快速又简便 6 示差分光光度法 differentialspectrophotometry A AS AX l cs cx 当保持cs不变时 吸光度 A 就只与被测试样的浓度 cx 有关 按所选择的测量条件 示差法有三种测定方式 高浓度测定法 低浓度测定法和高精度测定法 其中高浓度测定法是采用比试样浓度稍小的标准溶液调节透射比到100 然后测量试样溶液的吸光度 获得表观吸光度值 此时的吸光度值可处于正常的读数范围 见图2 12 2 12 7 漫反射光谱技术 diffusereflectancespectrometry 当光线照射到粗糙的物体表面时形成