基于免疫层析技术的时间分辨荧光免疫分析仪研究.doc

基于免疫层析技术的时间分辨荧光免疫分析仪研究第30卷第6期2009年6月仪器仪表chinesejournalofscientificinstrumentvo1.30no.6jun.2009基于免疫层析技术的时间分辨荧光免疫分析仪研究任冰强.-.黄立华r,黄惠杰(1中国科学院上海光学精密机械研究所上海201800;2中国科学院研究生院北京100039)摘要:基于时间分辨荧光免疫分析和免疫层析技术的原理,研制了一种新型的时间分辨荧光免疫分析仪.与现有的时间分辨荧光分析仪不同,它所检测的是以eu离子及其螯合物为标记物的免疫层析试纸条.通过测量免疫反应后试纸条检测带上eu螯合物的含量,参照标准浓度曲线就可以定量得到待测样品溶液的浓度.实验表明,仪器的最低检测浓度可达到ng/ml量级,测量的相对标准偏差小于3%,在510ng/ml浓度范围内具有良好的线性响应特性,相关系数r=0.9997.关键词:传感器技术;标记免疫学;时间分辨荧光免疫分析仪;免疫层析技术中图分类号:tp212.3文献标识码:a国家标准学科分类代码:460.4035time-resolvedfluorometerbasedonimmunochromatographyrenbingqiang一,huanglihua.,huanghuijie,(shanghaiinstituteofopticsandfinemechanics,chineseacademyofsciences,shanghai201800,china;2graduateuniversityofchineseacademyofsciences,beijing100039,china)abstract:anoveltimeresolvedfluorometerbasedonimmunochromatograghywasdeveloped.differentfromtheothertimeresolvedfluorometers,itteststheimmunochromatographicstripthatislabeledwithlanthanideionsandtheirchelates.thisinstrumentcanprovidearapid,quantitativemeasurementofanalytespresentedinthesampleswithoutanywashingstepsanditcanbeusedtocarryoutpoint-ofcaretest(poct).theinstrumentiscomposedofaspecificopticalsensor,ascanningstage,asignalprocessingsystemandacomputercontrolsystem.auvledwithpickwavelengthof345nmisusedastheexcitinglightsourcethatismodulatedat1khz.thetightfromtheledisfocusedontheteststripbyafocusinglensgroup.iftheeuchelatesarepresentinthesamples,thefluorescencewithpickwavelengthof613nmwillbeexited.afteradelayofsomemlcroseconds,thefluorescencewillbecollectedbytheopticalsensorandconvertedintoelectronicsignalbyaphotomuhipliertube(pmt).theconcentrationofthesamplecanbecalculatedaccordingtothestandardworkingcurveofthisinstrument.experimenttestindicatesthatthemlnimumdetectionconcentrationisatseveralng/mlleve1.therelativestandarddeviationislessthan3%andthetestlinearrangeisfrom5ng/mlto10ng/ml,withinwhichthecorrelationcoefficientris0.9997.keywords:sensortechnology;markedimmunoassay;timeresolvedfluorescenceimmunoassay;immunoehromatograghy引嗣免疫层析技术(immun0chmmat0graphy)是20世纪80年代末90年代初在免疫渗滤的基础上建立的一种快速检测技术.由于免疫层析技术不须进行结合标记物与收稿日期:20091receiveddate:2009-01自由标记物的分离,因而操作简单,快速,非常适合现场检测之用.时问分辨荧光免疫分析(timeresolvedfluoroimmu.noassay,trfia)是20世纪80年代初在传统荧光免疫分析的基础上创立的一种新型非放射性标记免疫分析技术.与传统的荧光素标记不同,它所用的示踪物是具第6期任冰强等:基于免疫层析技术的时间分辨荧光免疫分析仪研究1331有独特荧光特性的镧系元素及其螯合物,可有效排除样品自然荧光的干扰,具有灵敏度高,特异性强,稳定性好和无放射性污染等特点,在临床免疫检验和科学研究中的应用越来越广泛.本文所介绍的基于免疫层析技术的时间分辨荧光免疫分析仪,是在时间分辨荧光免疫分析仪的基础上,将时间分辨荧光免疫分析和免疫层析技术相结合,省去了繁琐的加样,洗涤步骤,试剂稳定性好,操作简单,检测速度快,灵敏度高,可广泛应用于现场定量检测,也可作为poct分析仪.2仪器原理及结构2.1镧系元素的荧光特性到目前为止,己有5种镧系元素被用于trfia,其中常用的有eu,tb和sm,而eu又是在标记抗原抗体中应用最广的元素.镧系元素在游离状态下,荧光信号很微弱,仅仅是分子间共振能级的能量传递,无辐射跃迁回基态发射荧光的机率很小,但其螯合物在紫外光源的激发下能发射荧光.与传统的荧光素标记物相比,镧系元素具有较宽的激发光谱带和较窄的发射光谱带,荧光持续时间长,且荧光光谱的stocks位移较大,利用光谱分辨技术和时间分辨技术可有效排除激发光和非特异性荧光的干扰.图1为eu的荧光光谱曲线.从图中可见,eu的峰值激发波长为337nm,峰值发射波长为613nm,stocks位移达到276nm.eu螯合物的荧光寿命较长,可达到数百微秒,而普通荧光免疫分析中荧光团的荧光衰变时间只有1100ixs,样品中的一些蛋白质荧光衰变时间也很短,仅为11os,因此可适当延迟测量时间,待背景荧光完全衰减后测定,可消除蛋白质背景荧光的干扰.图2为时间分辨荧光测量的原理示意图,其中发射荧光在延时400txs后再测量,测量时间为400ixs.1.o0.8.00.6铎0.40.2ot.k.但移bc:一.一一af一l一厂u.,i3004o0500600波长/rima吸收光谱;b激发光谱;c发射光谱图1eu荧光光谱曲线fig.1fluorescencespectraofeu54s21o越骥时间,g图2时间分辨荧光技术原理图fig.2schematicdiagramofthetimeresolvedtechnique本传感器采用eu螯合物作为标记物.2.2免疫层析试纸条免疫层析试纸条的一般结构如图3所示,主要包括样品垫,结合垫,硝酸纤维素膜,吸水垫,塑料基板等部分.在硝酸纤维素膜上固定有检测带和控制带.检测过程中,样品溶液通过毛细作用在层析条上泳动,同时样品中的待测物与检测带上针对待测物的受体(该受体标记有eu螯合物)发生高特异性和高亲和性的免疫反应,因而免疫复合物被富集或截留在层析材料的检测带上,而游离的标记物则会越过检测带.反应完成后,检测带上eu螯合物的含量与目标被检物的浓度有一定的对应关系.如果待测样品溶液中不含被检物,则检测带上就没有eu螯合物.通过测量免疫反应后试纸条检测带上eu螯合物的含量,参照标准浓度曲线就可以定量得到待测样品溶液的浓度.羊婀f笙臣累臊塑带基板控制带吸收il/卜_/i图3免疫层析试纸条fig.3immunechromatographicteststrip2.3仪器结构基于免疫层析技术的时间分辨荧光免疫分析仪采用扫描方式进行检测,主要包括几个部分:光学传感器,扫描平台及其驱动系统,信号处理系统,微机控制与管理系统等.图4是仪器的总体结构示意图.光学传感器是仪器的核心部分,主要功能是产生所需的紫外激发光,并将被检样品受激发出的荧光信号转换为电信号输出.光学传感器主要包括两部分,即紫外光激发系统和荧光接收系统.测量开始时,紫外光源打开,紫外激发光经过准直镜准直后由分色镜反射,再由聚1332仪器仪表第30卷扫图4仪器总体结构fig.4instrumentalsetupofthefluorometer焦/准直镜组聚焦到试纸条表面.照射一段时间后,紫外光源关断.eu螫合物受激发后产生的荧光信号由聚焦/准直镜组准直为平行光,经分光镜和滤光片滤除杂光,再由聚焦镜聚焦在共焦针孔光阑上,通过光阑的光由光电倍增管(pmt)转换为电信号.转换后的电信号经前置放大器放大,再由模一数采集卡转换为数字信号,由嵌入式计算机采集,存贮.由于eu螫合物的荧光寿命比较长,因此可在紫外光源关断后延时一定时间,等背景荧光消失后再测定,从而大大提高检测的灵敏度和准确性.通过嵌入式计算机控制试纸条扫描平台往返运动,实现对试纸条的扫描检测.基于特定算法对采集到的信号进行处理,计算待测样品溶液的浓度.为了获得较高的检测灵敏度和良好的精密度,采取了以下措施:1)采用紫外led作为激发光源.相对于其他紫外光源(如氘灯,氙灯),紫外led具有高发光效率,低能耗,长寿命,低成本,发热量小,体积小,功率和波长稳定等优点,可保持稳定的激发效率;同时紫外光激发系统的结构简单,易于将仪器小型化;2)聚焦/准直透镜组的数值孑乙径较大,荧光采集效率较高;3)分色镜对激发光有尽可能高的反射率,对荧光有尽可能高的透射率;滤光片对荧光窄带高透;4)在pmt前设置有共焦针孔,陔针孔与试纸条表面的紫外光照明区域共轭,只允许试纸条表面该区域发出的荧光通过;5)试纸条扫描平台的最小步距为20m,满足了连续,平滑的扫描要求.紫外led的峰值波长为345nm,与eu的峰值激发波长接近.紫外led输出功率为0.5mw,发散角为5.紫外led被调制成频率为1khz,占空比为10%的脉冲光.聚焦/准直透镜组的焦距为17.659mm,数值孔径为0.386.光电倍增管前聚焦镜的焦距为25mm.分色镜的透过率曲线如图5所示,在荧光波段的透过率大于98%,在345nm处的透过率仅为0.03%.槲蛔图5分色镜透过率曲线fig.5transmittancecurvesofthedichroicmlrror滤光片的透射光谱如图6所示,在613nm处的透过率为82.9%.邑jlil,盈喇图6滤光片透过率曲线fig.6transmittancecurvesofthefilter2.4控制模式与数据处理基于免疫层析技术的时间分辨荧光免疫分析仪控制软件包括两个部分,即仪器控制与数据处理.仪器控制流程主要负责激发光的调制,扫描平台的运动和数据采集等工作,以得到试纸条上eu螯合物的分布曲线.数据处理完成平滑去噪,人工选定检测带和控制带,计算并输出结果等功能.为了有效去除背景荧光噪声的影响,在激发光源关断后延时400ixs后再采集数据,每个位置测量20次,取平均值作为该点荧光强度的测量值.尽管在仪器设计中考虑到了消除杂散光,暗电流等功能,但沉积在试纸条表面检测带与控制带外的少量的eu螯合物在受激发时还会产生荧光噪声.另外由于pmt灵敏度极高,外界微量自然光的干扰都会成为本仪器的噪声源.因此,在采取硬件去噪措施以外,通过不断地调试,对扫描得到的数据进行相邻数点平滑和非线性去噪处理等软件算法,以进一步降低噪声.最终的测量结果以报告单的形式给出,存储在嵌入式计算机内,三可由usb闪存驱动器(ufd)拷贝出来.仪器分析软件的界面和实物照片见图7.第6期任冰强等:基于免疫层析技术的时间分辨荧光免疫分析仪研究1333图7分析软件界面和仪器实物照片fig.7interfaceoftheanalysissoftwareandphotooftheinstrument3仪器性能测试为了验证仪器的工作性能,对eu螯合物标准浓度样品进行了检测.3.1最低检测浓度将浓度为10g/ml的eu螯合物标准样品按照10倍比例分别稀释为1ml,100rig/ml,10ng/ml,1ng/ml四种浓度,分别南移液器手工滴加在空白的试纸条上进行检测,得到的信号值如表1所示.其中,0表示未滴加样品的空白试纸条.表1不同浓度下测得的信号值table1fluorescenceintensityofeuchelatesolutionswithfourconcentrations浓度/(ng?ml)信号强度(相对值)ol10lo010oo从表中可见,浓度为1ng/ml的eu螯合物标准样品的荧光信号值是空白试纸条的15.3倍,因此仪器的最低检测浓度可达到rig/ml量级.3.2重复性检测将浓度为10ng/ml的eu螯合物标准样品滴加在空白试纸条上,在相同的测量条件下对试纸条进行多次重复检测,得到的8组数据如图8所示.计算表明,测量结果的相对标准偏差为s/x100%=0.348/17.239100%=2.01%(1)说明仪器具有很好的测量重复性.靛越憩坦测量次数图8重复性检测结果fig.8detectionresultofrepeatability3.3线性范围检测将系列浓度的eu螯合物标准样品用全自动点样仪以直线方式点样在空白试纸条上,然后用分析仪检验,所得的信号数据见图9.采用最小二乘法,对510ng/ml范围内的数据进行线性拟合,所得直线表达公式为:y=0.6656x+2.0059(2)其相关系数r=0.9997.可见,在510ng/ml的范围内,仪器具有良好的线性响应特性.遥靛罂艇心逛浓y/(ng?ml)图9不同eu浓度的荧光强度曲线fig.9fluorescenceintensitycurveofeuchelatewithdifferentconcentrations4结论本文报道了一种基于免疫层析技术的时间分辨荧光免疫分析仪.该仪器采用紫外led作为激发光源,操作简单,检测速度快,具有可靠的重复性和非常高的灵敏2他nm优1334仪器仪表第30卷度.对于eu螯合物标准浓度样品,最低检测浓度可达1o到rig/ml量级,测量的相对标准偏差小于3%,在510rig/ml的浓度范围内具有良好的线性响应特性,与最小二乘法拟合出的直线具有很高的相关性,相关系数达到0.99.该仪器可广泛应用于现场定量检测,也可作为poct分析仪.23456789参考文献赵实,范培昌.临床诊断试剂及其诊断方法研究进展j.分析科学,1999,15(2):162168.zhaos,fanpch.someprogressintheresearchofdiagnosticreagentsanddiagnosticmethodsj.journalofanalyticalscience,1999,15(2):162168.jeongds,choiey.simultaneousquantitativedeterminationofmultipleanalyteswithfluorescencetaggedprobesbyimmunochromatographyj.koreanjournalofbiologicalsciences,2003,(7):89-92.刘蕾,周蕾,黄立华,等.基于一维ccd的免疫层析试纸条检测系统j.仪器仪表,2007,28(2):246251.liul,zhoul,huanglh,eta1.ccd?baseddetectionsystemforimmunitychromatographyteststripj.chinesejournalofscientificinstrument,2007,28(2):246251.petferssonk.siitarih,hemmilai,etal_time-resolvedfluoroimmunoassayofhumanchoriogo?nadotropinj.clinicalchemistry,1983,29(1):60-64.eskolaju.nevalainentj.lovgrenntn.timeresolvedfluoroimmunoassayofhumanpancreaticphospholipasea2j.clinicalchemistry,1983,29(10):17771780.soniee,kojolah.timeresolvedfluorometerforlanthanidechelates:anewgenerationonnonisotopicimmunoassaysj.clinicalchemistry,1983,29(1):658.kahani.sensitivetimeresolvedfluorescenceimmuno.assayofsomatotropininselqlmj.clinicalchemistry,1990,36(3):503508.soinie,lovgrent.timeresolvedfluorescenceoflanthanideprobesandapplicationsinbiotechnologyj.crccriticalreviewsinanalyticalchemlstry,1987,18(2):105154.沈健,林德球,徐杰.时间分辨荧光免疫分析技术研究现状及进展j.生命科学,2004,16(1):55-59.shenj,lindq,xuj.presentsituationandprogressoftimeresolvedfluoyj.chinesebulletinoflifesciences,2004,16(1):55-59111213141516171819杭建峰,吴英松,李明.时间分辨荧光免疫分析的研究进展及应用j.热带医学杂志,2004,4(3):34o_342.hangjf,wuys,lim.researchprogressandapplicationoftimeresolvedfluoroimmunoassayji.journaloftropicalmedicine,2004,4(3):340342.张明明,郑佐娅.poct的研究进展及应用j.国际检验医学杂志,2006,27(11):10211025.zhangmm,zhengzy.researchprogressand.dpplicationofpoctj.internaljournaloflaboratorymedicine,2006,27(11):10211025.张利伟,朱立红,樊绮诗.poct的发展及临床应用j.诊断学理论与实践,2004,3(4):25-26.zhanglw,zhulh,fanqsh.developmentandclinicalapplicationofpoctj.journalofdiagnosticsconcepts&practice,2004,3(4):2526.王自正.现代医学标记免疫学m.北京:人民军医出版社,2000:1-26.wangzzh.tagimmunologyofmodernmedicinem.beijing:peoplesmilitarymedicalpress,2000:126.hemillai.eta1.lanthanidesasprobesfortimeresolvedfluorometricimmunoassaysj.scandinavianjournalofclinicalandlaboratoryinvestigation,1988,48(5):389-400.yuanjl.wanggl.lanthanidecomplexbasedfluoreseencelabelfortimeresolvedfluorescencebioassayj.journaloffluorescence,2005,15(4):559568.selvinpr.lanthanidebasedresonanceenergytransferj.ieeejournalofselectedtopicsinquantumelectronies,1996,2(4):10771087.王中民,李君文.免疫层析技术研究进展j.国外医学临床生物化学与检验学分册,2001,22(2):9697.wangzhm.lijw.researchprogressofimmunochromatographyj.foreignmedicalsciences,2001,22(2):9697.araos,matsuuras,nonomuram,eta1.measurementofurinarylactoferrinasamarkerofurinarytractinfectionj.journalofclinicalmicrobiology,1999,37(3):553-557.paeksh,jangmr,morkrs.eta1.immunochromatographicmembranestripassaysystemforasingleclassplasmalipoproteincholesterol,exemplifiedbyhighde