大黄总蒽醌的纯化工艺研究

大黄总蒽醌的纯化工艺研究摘要：目的：确定DM301型大孔树脂对大黄总蒽醌类成分纯化工艺的参数。方法：以大黄中总蒽醌的含量为指标，研究DM301型大孔树脂的富集、纯化大黄总蒽醌的吸附性能和洗脱参数。结果：DM301型大孔树脂对大黄总蒽醌有良好的吸附性能。以10g大孔吸附树脂为标准量，最佳纯化工艺为药液浓度0.4g生药材/mL，pH=6，最大上样量为15-20mL，洗脱剂为90%乙醇，流速为2mL/min，用90%乙醇80mL洗脱时可以达到良好的除杂效果。结论：通过DM301大孔吸附树脂富集、纯化后，大黄总蒽醌的吸附率在70%以上，洗脱率在80%以上。说明采用本法富集、纯化大黄总蒽醌是可行的。关键词：DM301型大孔吸附树脂；大黄总蒽醌；纯化工艺IStudyonPurificationProcessofTotalAnthraquinonesinRadixetRhizomaRheiAbstract：Objective：ToestablishthetechnologicalparametersofthepurifricationprocessoftotalanthraquinonesinRadixetRiftzomaRheiwithDM301MaeroreticularResin.Methods：Theadsorptivecharacteristiesandelutiveparametersoftheprocesswerestudiedbytakingthecontentoftotalanthraquinonesasmarker.Results：DM301MaeroretieularResinhasgoodpurificationprocess.TheappropriateadsorptionconditionofDM301MaeroretieularResinwasasfollows：Concentrationofchemicalis0.4g/mL，pH6.Itsstaticexchangecapacitywas15-20mL.thenwaswashedwith80mL90alcoholformacroreticularresin，flowrateof2mL/min.Conclusion：WithDM301MacroreticularResintoadsorbandpurify，theelufiveratiooftotalanthraquinonesinRadixetRhizomaRheiwasover80andtheadsorptionreachedover70SothisprocessofapplyingmacroretieularresintoadsorbandpurifytotalanthraqulnonesinRadixetRhizomaRheiisfeasible.Keywords：DM301macroporousresin；totalanthraquinone；purification目录摘要III1前言12材料与仪器32.1材料32.2仪器33方法与结果43.1大黄提取液的制备43.2供试品溶液的制备43.3对照品溶液的制备43.4大黄总蒽醌含量的测定43.5方法学考察43.6DM301大孔树脂的吸附和解吸附特性73.7验证实验134讨论14参考文献16综述18致谢2701前言大黄属蓼科植物掌叶大黄RheumpalmatumL.、唐古特大黄RheumtanguticumMaxim.exBalf.或药用大黄RheumofficinaleBaill.的干燥根及根茎，性寒味苦，是临床常用中药之一。大黄具有泻下、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、消炎等功效1，近期研究发现大黄具有保护大脑皮层神经元的作用2，对治疗肝性脑病疗效显著3。大黄中化学成分复杂，有蒽苷、芪苷、鞣苷等，其中蒽苷为最主要成分。大黄中羟基蒽醌衍生物总量约为25，分为游离蒽醌和结合蒽醌，包括大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素及其苷等4。传统分离提取大黄总蒽醌有明胶沉淀法、醇调pH值法、聚酰胺法等，大黄提取的传统方法存在着有效成分损失大，周期长，工序多，提取率低等问题。近年来，大孔吸附树脂在中药的提取、分离、富集方面广泛运用，不断受到药学研究者的关注。大孔树脂是20世纪60年代发展起来的一种新型吸附剂，既有物理吸附作用，又因多孔状结构而有筛选作用5，在中药有效成分分离提取的应用中，呈现出良好的发展势头。大孔树脂吸附纯化中药的有效成分效果受PH、上样量、洗脱剂等多方面因素的影响，因此大孔树脂在纯化有效成分必须寻找最佳的工艺参数。DM301型树脂是一种中等极性的树脂，在分离黄酮类、生物碱、蒽醌类等成分有较为明显的分离效果。DM301型树脂用于大黄中总蒽醌类物质的纯化与其工艺参数的研究却尚未见报道。本实验通过对提取液pH、提取液浓度、最大上样量、洗脱液浓度、洗脱流速、洗脱用量等方面的考察筛选出适合分离纯化大黄总蒽醌的静态和动态吸附工艺，从而为日后制备成各类剂型提供实验依据。大黄是一种多年生草本植物。我国有大黄45个品种和两个亚种，但载入药典可以药用的只有3种，即正品大黄、唐古特大黄及药用大黄的干燥根及根茎。神农本草经中记述：大黄，味苦寒，归胃、肝大肠经。主下淤血、血闭寒热、破症、积聚、留饮宿食、荡涤肠胃、推陈致新、通利水谷、调中化食、安合五脏。目前对大黄有效成分的药理作用研究主要集中在1蒽醌类化合物。20世纪80年代以来，国内外对中药大黄，尤其是其有效成分的药理作用进行了深入研究。大黄具有泻下作用，主要作用成分为蒽醌类化合物，其中以番泄苷的作用最强，周氏等6认为番泄苷水解后生成大黄酸蒽酮而起泻下作用；大黄对多种细菌均有不同程度的抑制作用，钱氏7用大黄醇提片治疗急性肠炎54例、急性细菌性痢疾110例，总效率95%；大黄还可治疗慢性肾衰，研究发现，大黄能改善氮质血症，影响残余肾组织代偿性肥大，降低残余肾的高代谢状态，纠正脂代谢紊乱，减少蛋白尿，抑制肾小球系膜细胞的增值8；有研究表明大黄的不同成分对细胞内游离钙水平的影响不同，直接提示了大黄对肝细胞的功能具有多种调节作用9；大黄能使损伤局部的血管收缩，血管通透性降低，从而使出血时间缩短10，达到止血的效果；大黄具有清热下火的作用，其作用机理为：大黄可以降低感染家兔第三脑室灌流液中PGE含量，影响中枢环核苷酸的水平，从而达到降温作用11，夏氏12应用大黄治疗l7例急性胰腺炎高热患者，均于3-7d体温恢复正常；倪氏等13利用实验得到大黄酸可显著抑制巨噬细胞内白三烯B4、白三烯C4的生物合成，因此认为大黄酸显著影响巨噬细胞脂类炎性介质活化过程，可能是大黄的抗炎作用机制之一；此外，大黄还具有抗肿瘤作用，主要通过抑制肿瘤细胞的增生、促进细胞凋亡，抑制细胞色素P450(CYP1A1)和抗突变作用，以及抑制N-乙酰转移酶的活性实现的14；大黄素可促进TNF-A的分泌，且大黄素也能抑制炎症反应中的NO的大量合成和释放，提示大黄素对机体的免疫功能，可能具有双向调节作用15。传统的纯化大黄总蒽醌方法有明胶沉淀法16、醇调pH值法17、聚酰胺法18，这三种方法主要用来除去大黄中的鞣质，但是不能达到很好的分离、富集作用。近年来利用大孔树脂对大黄蒽醌类成分进行纯化富集可达到良好的效果。大孔树脂是20世纪60年代发展起来的一种新型吸附剂，既有物理吸附作用，又因多孔状结构而有筛选作用。在中药有效成分分离提取的应用中，呈现出良好的发展势头19。袁倚盛等20用大孔树脂吸附法，使总蒽醌的含量达到50以上，收率较高。金波等21以大黄总蒽醌的提取率及洗脱率为考察指标，考察大黄的提取条件及2大孔吸附树脂富集、纯化大黄总蒽醌的吸附性能和洗脱参数。通过大孔吸附树脂富集与纯化，用70%乙醇洗脱，总蒽醌的洗脱收率在80以上。许汉林等22比较了D301、AB-8、X-5、NKA-2、H1020型号的5种大孔树脂对大黄总蒽醌的吸附性能；以大黄总蒽醌中的代表成分大黄素为考察指标，结果D301树脂对大黄总蒽醌的吸附性能最佳。黄园等23在研究大黄总蒽醌纯化工艺时，采用了4种方法(明胶沉淀法、醇调pH值法、聚酰胺法以及大孔吸附树脂法)对大黄提取液富集效果进行研究，结果表明大孔树脂对大黄总蒽醌的富集效果最好。王高森等24以一个含有生物碱、蒽醌、皂苷等由黄连、大黄、知母等药材组成的中药复方为样品，采用4种型号(LD605，F95-34，F95-36，F95-37型)大孔树脂进行吸附纯化工艺和特性研究。结果表明，上柱药液与上柱体积比以LD605型最高，可达10：1，其余3种树脂体积比仅为LD605型的80-90。对比4种树脂的比上柱量以可溶性浸出物计，以大黄总蒽醌计，LD605型树脂最高。刘峰群等25以D101型大孔吸附树脂分离大黄中结合型蒽醌提取物，加样吸附1h，以足够量水冲洗吸附柱，流速约lmL/min，至洗脱液几乎无色，改用50的乙醇液冲洗，采用比色法考察总提取物中结合型蒽醌类物质的含量，总收率87.6。32材料与仪器2.1材料大黄饮片（致信药业有限公司，经广州中医药大学中药鉴定教研室李薇教授鉴定）；1，8-二羟基蒽醌对照品（中国药品生物制品检定所，批号0829-9702）；DM301大孔树脂（天津市海光化工有限公司），氯仿、甲醇、硫酸、氢氧化钠、95%乙醇均购自天津富宇化学试剂厂，均为分析纯。2.2仪器紫外-可见分光光度计(SpectronicGenesysTM2)；旋转蒸发仪RE-2000（上海亚荣生化仪器厂）；TC15套式恒温器（海宁市新华医疗器械厂）；远红外辐射干燥箱（南通科学仪器厂）；三角牌电炉（中华人民共和国制造）；HHS数显恒温水浴锅；LIBRORAEG-220（日本岛津：0.1mg）、BP211D（德国赛多利斯：0.01mg）；超声仪CQ200（上海音波声电科技公司）；旋转蒸发仪RE-2000（上海亚荣生化仪器厂）；低温循环水真空泵DLS2-（巩义予华仪器有限责任公司）43方法与结果3.1大黄提取液的制备取过10目筛大黄药材粉末约40g，称定，加入12倍量的60%乙醇，加热回流提取3次，每次30min，滤过，滤液减压浓缩至无乙醇味，转移至100mL量瓶中，加水稀释至刻度，制成0.4g(相当于原药材)/mL的大黄提取液。3.2供试品溶液的制备精密移取大黄提取液10mL于100mL圆底烧瓶中，加2.5mol/L硫酸溶液10mL和氯仿10mL，水浴加热回流水解1h，放冷至室温，将溶液移至分液漏斗，回收氯仿层，酸水层用氯仿洗至氯仿层不显黄色，合并氯仿液，用水洗氯仿液至中性，氯仿液转移至250mL圆底烧瓶中，减压回收至干，残渣用0.5%醋酸镁-甲醇溶液溶解并定容至10mL，滤过，取续滤液1mL置10mL容量瓶中，用0.5%醋酸镁-甲醇溶液稀释至刻度，即得。3.3对照品溶液的制备精密称取1，8-二羟基蒽醌对照品10.48mg，用氯仿溶解并定容为100mL的对照品溶液。3.4大黄总蒽醌含量的测定以0.5%醋酸镁-甲醇溶液作为空白对照，在510nm处测溶液吸光度，根据标准曲线方程计算总蒽醌的含量。3.5方法学考察3.5.1标准曲线的绘制将对照品溶液在400700nm范围内扫描测定吸收光谱，结果在510nm处有最大的吸收峰，如下图1所示，故选取510nm为检测波长。精密移取对照品溶液0.2，0.6，1，2，3mL于10mL容量瓶中，挥去氯仿，5加0.5%醋酸镁-甲醇溶液溶解并定容至10mL，充分振摇后以0.5%醋酸镁-甲醇溶液做空白对照，确定510nm处为检测波长。图1对照品UV图谱得出大黄总蒽醌质量浓度与吸光度间的关系如表1，标准曲线如图2，回归方程为y=44.405x+0.0379，相关系数r=0.9998表1大黄总蒽醌质量浓度与吸光度关系0.000.200.400.600.801.001.201.401.600.0000.0050.0100.0150.0200.0250.0300.035浓度（mg/ml)吸光度A图2标准曲线1，8-二羟基的浓度（mg/mL）吸光度（A）0.0020960.1170.0062800.3260.0104800.5110.0209600.9710.0314401.42963.5.2仪器精密度实验取同一份供试品溶液，以0.5%醋酸镁-甲醇溶液作为空白对照，在510nm处连续测定吸光度6次，计算相对标准偏差RSD。结果如下表所示：表2仪器精密度实验编号吸光度A10.37620.37630.37840.37750.37760.377结果RSD=0.20%，表明仪器的精密性良好。3.5.3重复性实验各取0.4g生药材/mL的大黄提取液0.5mL，按照供试品制备方法在相同条件下制备供试品6份，并测其吸光度，计算总蒽醌的含量，结果如下表所示。表3重复性实验编号吸光度（A）含量（mg/g)11.2491.363821.2481.362531.2161.326541.2581.373851.2271.338961.2351.3479平均值1.2391.3522RSD(%)2.89由结果可知：RSD=2.89%，重复性良好，大黄中总蒽醌的含量为1.3522mg/g。7吸附量干树脂量（母液浓度-滤液浓度）x溶液体积3.5.4加样回收实验取大黄提取液0.5mL6份，各加入2.5mL1，8-二羟基蒽醌对照品溶液，按照3供试品制备方法和含量测定测定方法，测得回收率和RSD值，结果如下表所示：表4加样回收实验编号加入量（mg)回收量（mg)回收率（%）10.2620.18670.9920.2620.19574.4330.2620.17767.5640.2620.16462.6050.2620.15960.6960.2620.15559.16平均值0.2620.17365.90RSD(%)9.22由结果可知，加样回收实验的回收率比较低，相对标准偏差也比较大，原因主要在于操作过程中尤其是萃取过程蒽醌的损失。3.6DM301大孔树脂的吸附和解吸附特性3.6.1大孔树脂的预处理新购的大孔树脂用食用乙醇浸泡24h，装色谱柱，先用食用乙醇洗柱至洗脱液加水不出现白色浑浊，接着用去离子水洗至洗脱液无醇味。备用。3.6.2吸附量和吸附率的计算=8母液浓度（母液浓度-滤液浓度）吸附率x100%=3.6.3pH对DM301大孔树脂静态交换吸附大黄提取液的影响取大黄提取液100mL，平均分为4份，每份25mL，用2mol/LNaOH溶液调成pH6，7，8，9。精密称取1.5g吸干表面水分的DM301型大孔树脂，置于50mL三角瓶中，各加入15mL上述调pH6，7，8，9大黄提取液，放置24小时，不时振摇，滤过，分别吸取滤液1mL，按要求制备供试品溶液。分别测定滤液的吸光度和吸附前大黄提取液的吸光度，按照标准曲线公式转化为蒽醌浓度按照下式计算吸附量和吸附率，从而考察提取液pH对DM301大孔树脂吸附总蒽醌的影响，结果如下图表所示：表5提取液pH对DM301大孔树脂吸附能力影响PH吸附率吸附量(mg/g)667.59%0.8552758.95%0.8127854.39%0.7038936.11%0.28170.00%10.00%20.00%30.00%40.00%50.00%60.00%70.00%80.00%提取液pH吸附率图3提取液pH对DM301树脂吸附率影响由此可见，pH值为6、7、8、9下DM301型大孔树脂静态交换吸附大黄提取液的吸附量分别为0.8552、0.8127、0.7038、0.2817mg/g，吸附率分别为67.59%、58.95%、54.39%、36.11%，大黄提取液的不同pH值对吸附树脂吸附能力影响较大，pH6时DM301大孔吸附树脂对大黄总蒽醌静态吸附率最大，过9高的pH值可能会破坏大黄蒽醌类成分物质。3.6.4上样液浓度的确定各取约10gDM301大孔树脂装柱，加入15mL生药材浓度为0.1g/mL、0.2g/mL、0.3g/mL、0.4g/mL、0.5g/mL大黄提取液，调节流速为1mL/min，分别收集流出液。定容至100mL，取5mL进行含量测定。不同浓度提取液被DM301吸附的总蒽醌吸附量和变化如表6和图4所示：表6不同浓度提取液对DM301树脂吸附的影响05101520253000.10.20.30.40.50.6大黄提取液浓度（g/ml)吸附量(mg/g)图4不同提取液浓度对DM301树脂吸附容量的影响由图可知，大黄提取液大黄含量较低时，DM301树脂交换吸附大黄总蒽醌的能力随着提取液含量的提高而增加。当提取液含量为0.4g/mL生药材时，其交换吸附能力最好，吸附量为25.4397mg/g。3.6.5最大上样量的确定浓度（g/mL)总蒽醌吸附量（mg/g）0.15.81350.26.99580.316.96090.425.43970.525.101910精密称取10.1024g大孔树脂装柱，加入100mL0.4g/mL的大黄提取液吸附，调节流速为1mL/min，收集流出液，每5mL收集一管，共收集20份，编号，各取1mL进行总蒽醌含量测定。各流出段的吸光度和总蒽醌含量如表7所示，流出段总蒽醌含量变化情况表7不同流出段的总蒽醌含量编号吸光度（A）相当于毫升数总蒽醌含量（mg)10.32950.366220.330100.367330.333150.370740.415200.463050.460250.513760.469300.523870.477350.532880.490400.547590.509450.5689100.529500.5914110.557550.6230120.580600.6488130.588650.6578140.593700.6635150.604750.6758160.621800.6950170.635850.7107180.636900.7119190.638950.7141200.6371000.71411100.10.20.30.40.50.60.70.8020406080100体积（ml)总蒽醌含量（mg)图5大黄泄漏曲线图由图3可知，当加入15-20mL大黄提取液时，流出总蒽醌的浓度有一个较大的转折，即最大上样量为15-20mL大黄提取液/10g大孔树脂，每1.0gDM301大孔吸附树脂可处理1.5-2mL的物料，约为0.6-0.8g物料。3.6.6不同乙醇含量对蒽醌类成分动态洗脱率的影响各取10g以交换吸附蒽醌类成分的大孔树脂装柱，先用水洗脱洗至洗脱液接近无色，再分别用250mL30、45、60、75、90的乙醇进行洗脱，按1mL/min的流速进行洗脱，分别收集洗脱液，定容为100mL，取2mL进行含量测定。洗脱蒽醌含量和洗脱液含醇量关系如表8和图6所示：表8不同含醇量洗脱液洗脱能力的影响洗脱剂含醇量吸光度（A）洗脱蒽醌量（mg)30%0.1923.4745%0.2705.2360%0.2945.7775%0.3236.4290%0.49910.38120246810120%20%40%60%80%100%含醇量洗脱蒽醌量(mg)图6不同乙醇含量洗脱液洗脱能力考察由图可知，乙醇含量对洗脱大黄总蒽醌有很大的影响，随着乙醇含量增加，洗脱大黄总蒽醌的效率提高，用90%乙醇洗脱大黄总蒽醌效果较好。3.6.7洗脱流速的确定各取10g以交换吸附蒽醌类成分的大孔树脂装柱，先用水洗至洗脱液接近无色，用150mL90%乙醇，调节流速分别为0.5mL/min、0.75mL/min、1mL/min、1.25mL/min、1.5mL/min进行洗脱。分别收集洗脱液，挥去乙醇，定容为50mL，取2mL进行含量测定，从而考察洗脱流速对洗脱能力的影响，流速和总蒽醌的洗脱量关系如表9和图7所示：表9流速对洗脱能力的影响流速(d/min)吸光度(A)洗脱量（mg)0.50.751.01.251.50.5830.7110.8380.8330.5726.13787.57919.00918.95286.0140130246810010203040流速（d/min)洗脱量(mg)图7流速对洗脱能力影响图结果可知，DM301吸附树脂洗脱率在1mL/min时洗脱效率最高，这可能是蒽醌与大孔树脂的结合力较大，当流速过大时，洗脱剂来不及与树脂进行交换吸附，而使蒽醌不能被洗脱下来。3.6.8洗脱液用量的确定各取10g大孔树脂装柱，取0.4g/mL大黄提取液15mL进行动态吸附，用去离子水洗脱至接近无色后，用90%乙醇洗脱，收取洗脱液，毎10mL收取一份，共收取13份，挥去乙醇，定容至10mL，进行含量测定，结果如表10所示，洗脱曲线如图8所示：表10洗脱液用量的确定洗脱液体积（mL）吸光度洗脱液中蒽醌量（mg)101.0170.4493201.3000.5770301.1200.4959400.8730.3847500.7750.3405600.6440.2813700.4020.1726800.2060.0842900.1470.05741000.0930.03631100.0790.03081200.0560.02191300.0510.01990.51.01.52.01400.10.20.30.40.50.60.7020406080100120140洗脱液用量（ml)洗脱液中蒽醌量（mg)图8洗脱曲线结果表明：当用80mL的洗脱液洗脱时，洗脱液中蒽醌的含量已经很低，可以认为洗脱完全，即用80mL的90%乙醇洗脱剂能将大黄总蒽醌洗脱下来。3.7验证实验各取10gDM301大孔树脂装柱3份，分别加入10mL0.4g/mL大黄提取液进行动态交换吸附，用蒸馏水洗至洗脱液接近无色后，按照优化的动态洗脱条件，用80mL的90%乙醇，流速20d/min进行洗脱，收取洗脱液，挥去乙醇后，定容成25mL，计算吸附率，解吸附率，相对标准偏差RSD，结果如表11所示：表11按照优化条件验证实验编号吸附量（mg）吸附率（%）洗脱量（mg）解吸附率（%）11.403475.451.137881.0821.324671.211.075981.2231.375373.941.109780.69RSD（%）2.90.34从上表中可以看出，DM301树脂分离纯化大黄总蒽醌的工艺稳定可行。154讨论大孔吸附树脂是一类不含离子交换基团的交联聚合物，由于范德华力及氢键的作用而具有吸附性，还因具有网状结构和很高的比表面积而具有筛选性能。因此，大孔吸附树脂在中药的提取、分离、富集方面具有重要的应用价值，但对于不同型号的大孔吸附树脂，其树脂本身的极性、孔径、比表面积、孔容以及上柱溶液的浓度、体积、pH值、化学成分的性质等均影响其分离、富集效果。同时，其解吸还受到洗脱剂的种类、浓度、体积、程序、流速的影响。本实验考察了DM301型大孔树脂对大黄总蒽醌类成分吸附纯化的工艺，从静态和动态两个方面进行考察，静态交换吸附主要考察了溶液pH对吸附能力的影响；动态交换吸附则从上样液的浓度、最大上样量，洗脱剂的含醇量、洗脱流速、洗脱液的用量进行考察，从而制备最佳的纯化工艺。由于蒽醌类物质多含有酚羟基，可作为良好的氢键供体，有利于极性树脂的吸附。DM301树脂是乳白色不透明球状颗粒，是苯乙烯型中极性共聚体，适用于具有一定弱极性和极性的有机化合物，较大的孔径，这表明DM301型树脂对含有酚羟基的蒽醌类物质具有较高的富集能力。本实验研究初步确定DM301大孔吸附树脂对大黄总蒽醌类物质纯化条件为：上样大黄提取溶液的浓度为0.4g生药材/mL，pH6，最大上样量为1.5-2mL/g大孔树脂，洗脱时先用水洗至流出液接近无色后，用90%乙醇80mL进行洗脱，流速1mL/mL。经3次验证实验后，证明了该工艺稳定可行。本实验过程中，对于每个研究的条件均进行平行操作2次，因此得到的条件结果稳定可靠，消除了环境条件、仪器等因素的影响。加样回收实验不能得到满意的结果，这有可能是实验操作中不够谨慎，尤其是萃取的难度带来的，最后验证实验时，制成干膏对于生产更具有实际意义，但是蒽醌在过高的温度下也容易分解破坏。16参考文献1黄泰康常用中药成分与药理手册M北京：中国医药科技出版社，1994：227-2282马琼英，高鸣，王小琴，等大黄素、川芹嗪对中分子物质损伤人脑大脑皮层神经元影响的实验研究J湖北中医学院学报，1999，1(1)：39-413张赤志应用大黄治疗肝性脑病J湖北中医杂志，2004，26(2)：17-204芦喜珍，刘焱文，何再安，等大黄注射液的制备及含量测定J中国医院药学杂志，1994，14(8)：377-3785屠鹏飞，贾存勤，张洪全大孔吸附树脂在中药新药研究和生产中的应用J世界科学技术：中医药现代化，2004，6(3)：22-296周金黄，王建华，刘于中.世纪之交：现代中药药理学的回顾与展望J中国药理学会通讯，1999，16(3)：6277钱尚统单味大黄醇提片治疗急性肠炎及痢疾的疗效观察J中成药，1989，11(9)：23-248黄翠玲，李才，邓义斌大黄延缓慢性肾功能衰竭机制的研究进展J中国中西医结合杂志，l995，l5(8)：5069林秀珍，马德禄，崔荣芬大黄索及番泻苷和大黄多糖对培鼠肝细胞内游离钙浓度的影响J中国中西医结合杂l995，l5(7)：4l910王鸿利大黄有效单体止凝血机理的临床研究J中西医结合杂志，1985，(9)：555-55711陈德伟生、制大黄止血效果比较J中药材，l988，l1(6)：3812夏学德大黄治疗急性胰腺炎17例J中西医结合杂志，l988，8(4)：20913倪弘，薛小平，杨秀竹，等大黄酸抑制小鼠腹腔巨噬细胞炎性介质活化的作用机理J天津中医，2001，18(1)：35-3614李新字，张翔宇，景炳文，等大黄对大鼠肠缺血再灌注致肺损伤中磷脂酶A2的影响J中国急救医学，2006，20(6)：324-32615张骏，翁福海大，黄素对内毒素刺激下的大鼠腹腔巨噬细胞分泌TNF2A及17NO的影响J天津医科大学学报，200l，7(2)：l89-l9116李翠萍当归对大黄注射液中总葸醌含量的影响J中医药研究，1997，13(5)：58-5917芦喜珍，刘焱文，何再安，等大黄注射液的制备及含量测定J中国医院药学杂志，1994，14(8)：377-37818罗军，刘振安，刘焱文，等大黄注射液质量标准的研究J中国实验方剂学杂志，1998，4(2)：41-4219李平华，王兴文大孔吸附树脂在中药有效成分分离纯化中的研究进展J云南中医学院学报，26(3)：4320袁倚盛，赵飞浪，潭力大黄游离蒽醌的制备与纯化J中草药，1999，31(7)：50821金波，李薇，蔡伟大黄总蒽醌提取与纯化工艺的研究J时珍国医国药，2005，16(8)：75622XUHan-lin，CHENJun，SHAOJi-zhen，eta1Studyonseparaionandpurificationofanthr-aquinonesinRadixEtRhizomaRheibyD301maeroporousresinJZhongguoZhongYaoZaZhi2006；31(14)：l163-116523黄园，徐雄良，张志荣，等大黄总蒽醌纯化工艺研究J中成药，2003，25(10)：78324王高森，侯世祥，朱浩，等大孔树脂吸附纯化中药复方特性研究J中国中药杂志，2006，31(15)：1237-123925刘峰群，易毛，刘丽萍，等大孔吸附树脂法纯化大黄中结合型蒽醌总提取物的研究J中国现代医药杂志，2006，8(4)：104-10526贾存勤，李阳春，屠鹏飞，等不同型号大孔树脂对大黄总蒽醌吸附的研J湖北中医学院学报，2005，7(4)：20-2218综述大孔吸附树脂在中药研究和生产中的应用进展大孔吸附树脂(以下简称大孔树脂)是20世纪60年代发展起来的一种新型吸附剂。它是一类不含交换基团且具有大孔结构的离分子材料。它具有很好的大孔网状结构和较大的比表面积，通过物理吸附从水溶液中有选择地吸附有机物。自问世以来，大孔树脂已广泛应用于环保、食品、医药等领域。尤其在中药有效成分分离纯化的应用中，更是呈现出良好的发展势头。由于它的应用时间较短，基础研究较薄弱，许多规律还不成熟。笔者就十年来大孔吸附树脂的相关基础和它在中药有效成分分离纯化中的研究作一回顾，以期为他人的研究提供参考。1特性及分离原理大孔树脂一般为白色球形颗粒状，粒度多为2060目，通常分为非极性和中极性两类。物理化学性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂。对有机物选择性较好，不受无机盐类和强离子、低分子化合物存在的影响。大孔树脂为吸附性和筛选性原理相结合的分离材料，与离子交换树脂的分离原理不同1。它本身具有的吸附性，是由于分子间范德华力和产生氢键的结果，筛选性原理是由于其本身的多孔性结构决定。正因为有这些特性，才使得有机化合物尤其是水溶性化合物的分离纯化得以大大简化。从显微形状上看，大孔树脂包含有许多具有微观小球组成的网状孔穴结构，这些球体的构成，多为苯乙烯型和2-甲基丙烯酸脂型，前者为非极性树脂，后者为中极性树脂。大孔树脂的“孔径”是指微观小球之间的平均距离，其“表面积”是指微观小球表面积的总和(m2g)，由于吸附性和筛选性原理，有机化合物根据吸附力的不同及分子量的大小，在大孔树脂上经一定的溶剂洗脱而分开。大孔树脂根据孔径、比表面积及构成类型被分为许多型号，在应用中，可根据实际要求及要分离的化合物加以选择。文献中已报导的大孔树脂型号有：南开大学生产的D2、D619、D8、DS2、DM2、D101型；XAD-1型、XAD-2型、XAD-3型、XAD-4型、XAD-5型、XAD-6型、XAD-7型、XAD-8型；HP-20型、HP-30型、HP-40型、SIP系列；HPD系列：CAD-40型；XAD-4型；DA-201型等。2确定分离条件在了解大孔树脂结构及分离原理的基础上，必须根据化合物的结构特征来确定分离条件，才能取得预期的效果。首先要明确分离化合物分子体积的大小，如多糖类、皂甙类等，他们分子体积相差明显，通过预实验或查阅文献来选用相应孔径的树脂材料；其次，要知道分子中是否含有酚羟基、羧基或碱性氮原子由此来确定树脂的型号及分离条件。但是要取得满意的分离效果，还需注意以下几方面的因素的影响：分子极性大小分子极性的大小直接影响分离效果。极性较大的化合物一般适于在中极性的树脂上分离，而极性较小的化合物则适于在非极性的树脂上分离。极性大小是个相对概念，要根据分子中极性基因(如羟基、羧基等)与非极性基团(如烷基、苯环、环烷母核等)的数量和大小来决定。对于未知化合物，可通过一定的预试验及TLC、PC而大致确定。2.1分子体积在一定条件下，化合物体积越大，吸附力越强，如碱性红霉素、叶绿素等，能被非极性大孔树脂很好地吸附，这与大分子体积憎水型增大有关。这一点与凝胶渗透层析恰好相反，这是由于大孔树脂同时存在的吸附性所致。另一方面，分子体积的大小是选择型号的主要因素之一。分子体积较大的化合物选择较大孔径的树脂，否则，将直接影响到分离的效果。但对于中极性大孔树脂来说，被分离化合物分子上能形成氢键的基团越多，在相同条件下吸附力越强。所以对某一化合物的吸附力强弱最终取决于上述因素的综和效应结果。2.2pH值上样药液pH值对化合物的分离效果至关重要。根据化合物的结构特点灵活改变溶液的pH值，可使提纯工作取得理想效果。一般情况下，酸性化合20物在适当酸性溶液中充分吸附，碱性化合物则在适当碱性条件下被较好地吸附(特殊要求例外，如大多数化合物被吸附的情况下，可改变pH值，是形成较强的离子型化合物，而顺着溶液泄漏出来，达到提纯目的，中性化合物可在大约中性的条件下被吸附。2.3树脂柱的清洗化合物经树脂柱的吸附后，在树脂表面或内部还残留着许多非极性成分，或吸附性杂质成分，这些杂质必须在清洗过程中尽量洗除。非吸附性成分一般用水即可洗除，而吸附性杂质可根据情况用酸液或碱液除去(0.1mol/LNaOH或HCl)，经清洗可使许多杂质除去。一般情况下，冲洗至无色即可。2.4洗脱液的选择洗脱液可使用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙脂，根据吸附力强弱选用不同的吸脱剂及浓度。对非极性大孔树脂，根据作者经验及相关文献分析，则用极性较大的溶剂较为合适。为达到满意的效果，可设计几种不同的浓度洗脱，再确定最佳的洗脱液浓度。在实际工作中，甲醇、乙醇、丙酮应用较多。洗脱速度一般控制在0.55mLcm2min为好。3应用概况3.1应用树脂分离纯化的中药成分类型2近10年来，大孔树脂用中药成分分离纯化的报道逐年递增。据不完全统计，曾公开发表的论文中用大孔树脂分离纯化的成分有27种，见表1。21表1用大孔树脂分离纯化的部分中药成分名称成分类型数量成分名称皂甙10人参总皂甙，甘草酸，三七总皂甙，绞股蓝总皂甙，蒺藜总皂甙，桔梗总皂苷，知母总皂甙，刺玫果总皂甙，毛冬青皂甙，西洋参花皂甙黄酮4银杏叶黄酮，葛根黄酮，橙批甙，荞麦芦丁生物碱4川乌、草乌总生物碱，喜树碱，川芎提取物(含川芎嗪及阿魏酸)其他9银杏内脂及白果内脂，丹参总酚酸，茶多酚，紫草宁，白芍总甙，赤芍总苷，紫苏色素，胆红素，大黄游离蒽醌注：为近10年来国内公开刊物上发表的资料从表1可以看出，大孔树脂目前的应用范围主要集中于皂甙、黄酮、生物碱及其他具有一定极性的化合物成分。自大孔树脂问世至90年代，大孔树脂用于中药成分分离纯化的研究已取得一定进展。1979年中国医学科学院药物研究所植化室3报道大孔树脂可用于三颗针生物碱，赤芍甙，天麻甙，薄盖灵芝中尿嘧啶与尿嘧啶核苷的分离。钱庭宝等4总结过1990年以前大孔树脂在中药成分分离纯化中的应用情况，并认为罂粟生物碱、茶叶生物碱、莨宕碱、山梗菜碱、长春胺、番爵床、石蒜碱、马钱子碱、猪毛菜碱、颠茄碱、小檗碱、乌头碱、山楂黄酮等都可用大孔树脂或用大孔树脂与离子交换树脂结合进行分离。3.2大孔树脂在中药化学成分分离纯化中的应用情况曾报道用大孔吸附树脂法测定三七及其制剂冠心宁总皂甙。实验证明：D-型大孔吸附树脂对三七、人参三萜皂甙在水溶液中不仅吸附快，解吸也快，而且吸附容量相当可观，方法简便有效，用于分离纯化中药中皂甙成分有一定价值5。也有人应用4种不同型号的大孔树脂法提取甜菊甙，均获得较好的结果。其中AmberliteXDA-4型为最好，其吸附量为6.14%，并认为此方法简便，结晶纯度高，对改进生产工艺有一定作用6。有用D101型非极性树脂作为22吸附剂，提取甜菊总甙，粗品回收率在8%左右，精品回收率在3%左右。其法操作简单，再生方便，得率恒定，成品质量稳定7。也有采用D-型吸附树脂分离比色法测定甜叶菊叶中甜叶菊甙的含量。用本法与HPLC法比较，两者结果相近，故本法准确、可靠8。报道用大孔吸附树脂比色法测定气血注射液、生脉注射液、益气和血冲剂等复方制剂中人参皂甙的含量。此法重现性好，便于测定复方制剂中人参皂甙的含量9。魏峰在用大孔吸附树脂提取刺玫果皂甙的实验中，发现用水洗脱大孔树脂柱上刺玫果的皂甙是一个更好的方法。优点是：不用有机溶媒，皂甙中杂质少，其吸附规律是在水溶液中，对极性大的吸附力小，对极性小的吸附力大10。汤毅等利用大孔吸附树脂法，除去西洋参精口服液中的蔗糖、蜂蜜等干扰，用薄层扫描法测定人参皂甙含量11。有用大孔吸附树脂法提取精制三七总皂甙，提取率在88%以上，并能除去糖类等水溶性杂质及大部分脂溶性杂质，降低了提取物的吸潮性，色泽好，同时纯度高，质量稳定12。董林等报道用大孔吸附树脂DA201型提取分离逐瘀化痰汤中人参总皂甙，简便迅速，三份样品同时操作，半天即可完成。吸附柱用大约100mL水洗后，即可重复上样。本法准确可靠，加样回收率可达99.4%。避免了以往的乳化现象严重给定量分离带来的困难13。李义侠等用D101大孔吸附树脂法，将西洋参茎叶粗总皂甙，进行常水洗涤，80%正丁醇洗脱，粗制皂甙，其含量在90%左右14。董林等用DA201型大孔吸附树脂测定三七蜂王浆中三七皂甙及其制剂中总皂甙的含量15。金继曙等采用DA201型大孔吸附树脂分离白芍总甙，收率为1.5%，且具有操作简便，树脂再生容易，得率恒定，产品质量稳定等特点16。陈刚等将大孔吸附树脂法用于绞股蓝皂甙的分离提取，发现在用碱液冲洗柱子时，绞胶蓝皂甙能很好地吸附于柱子上，而用60%乙醇冲洗柱子时，则很快解吸附，而30mL即能将绞股蓝皂甙全部洗脱下来17。江林等用树脂分离比色法测定三七总皂甙含量，同时对三七全株不同生长部位、不同规格、不同产地的22个样品进行三七总皂甙的含量测定18。郑芙蓉等用大孔吸附树脂一比色法考察了绞股蓝药材及合剂中绞股蓝皂甙的含量。该实验证明：本制剂不需要醇沉，既保持传统的中医药理论特色，又最大限度地保持了其有效成分，工艺简单，且不23含蔗糖19。徐仲仙等报道对绞股蓝原浆与口服液总皂甙含量测定，用正丁醇提取法与大孔吸附树脂分离法作了比较。实验结果表明：原浆中的总皂甙含量测定两种方法均可使用，但大孔树脂法较正丁醇法优越，特别是对绞股蓝口服液总皂甙的含量测定，大孔树脂法变异小，数据精确，操作简便20。耿家玲等报道用大孔树脂对三七叶中的总皂甙进行了分离纯化，工艺流程已基本成熟并进入日处理茎叶40kg的中试阶段，所得三七叶甙含量达95%以上，提取率6%以上21。3.3中药复方的纯化近年来，有人尝试将大孔树脂用于中药复方的精制，已取得了一些成绩。钟国华用大孔吸附树脂法对龟鹿补肾液的生产工艺进行了改进研究。由原来的酒沉法改为树脂法，对两种工艺试制的口服液成品，通过淫羊藿甙、蛋白质、多糖等成分含量的比较，表明树脂法生产工艺试制的口服液成品各项指标不仅有明显提高，而且树脂法工艺省去了大量酒精，工艺中减少了一步浓缩，可达到降低生产成本，提高生产效率的目的22。宓晓黎等以总黄酮、总皂甙、总生物碱为指标，考察了4种大孔树脂对降压胶囊的吸附作用，结果表明，上样液的浓度及上样液的pH、含醇量是影响吸附的主要因素23。饶品昌等用大孔树脂对右归煎进行了