第九章植物细胞代谢产物制备VIP

第九章植物细胞代谢产物制备 植物细胞培养特点 植物细胞直径为10 200um 平均直径比微生物大30 100倍 植物细胞通常以一定数量的细胞团方式存在 植物细胞具有纤维素细胞壁和大的液泡 很容易被剪切力损伤 植物细胞生长速度慢 周期长 植物细胞培养基成份复杂 易污染 植物细胞培养需要光照 植物细胞培养技术 培养基 参考第五章植物人工繁殖 植物细胞分离机械法 参考第七章原生质体 酶解法 参考第七章原生质体 愈伤组织法 参考第五章植物人工繁殖 植物细胞培养 初步培养 小规模培养 继代培养 大规模培养 悬浮培养 固定化培养 初步培养初步得到的植物单细胞体外培养时增殖比较困难 需要特殊的培养方式提高培养效率 常采用两种培养方式 1 看护培养 用一块生长活跃的愈伤组织来看护单个细胞 使其持续分裂和增殖 此法简便高效 缺点是无法在显微镜下直接观察 2 饲养层培养 用处理过的无分裂能力或分裂能力很低的细胞饲养需要培养的细胞 使其分裂和生长 包括 饲养细胞与靶细胞共同混合于琼脂培养基中 饲养细胞在下层 靶细胞在上层分别混合于琼脂培养基中 饲养细胞与靶细胞一起培养于液体培养基中 饲养层细胞和靶细胞层之间放两张滤纸 上面一层滤纸用于将靶细胞转移到其他培养基上继续培养 看护培养 饲养层培养 饲养细胞与靶细胞共同混合于琼脂培养基中 饲养细胞在下层 靶细胞在上层分别混合于琼脂培养基中 饲养细胞与靶细胞一起培养于液体培养基中 饲养层细胞和靶细胞层之间放两张滤纸 继代培养初步培养得到的细胞需要进行继续培养 继续培养的目的是增殖细胞 根据培养方式可分为 1 固体培养操作简单 细胞生长慢 仪器设备要求低营养吸收 气体交换不均匀 细胞群体不一致2 液体培养操作方便 细胞生长快 仪器设备要求高营养吸收 气体交换均匀 细胞群体一致最佳继代时期 变化S形曲线后 和直线生长期 细胞生长曲线在整个培养过程中细胞数目不断发生变化 呈现出明显的由慢到快 再到慢 最后增长停止的细胞周期 细胞的生长呈S型曲线 1 滞后期 延迟期 细胞很少分裂 其长短与接种量和继代时原种细胞所处的生长期有关2 对数生长期 细胞分裂活跃 细胞数目增加 增长速率保持不变3 直线生长期 细胞生长和发育最明显4 缓慢期 生长逐渐缓慢 营养消耗殆尽 有毒代谢物质增多 氧气减少5 静止期 生长几乎处于停止状态 细胞数量增加极少 甚至开始死亡 讨论 为什么 1 滞后期的长短主要取决于在继代时原种培养细胞所处的生长期和接种的细胞数量的多少 2 加入条件培养基可以缩短滞后期 条件培养基 曾培养过一段时间组织或细胞的培养基 3 缩短两次继代时间间隔 可使细胞一直保持在对数生长期 4 如果使处在静止期细胞保持时间太长 则会引起细胞的大量死亡 悬浮培养固定化培养植物器官培养 植物细胞大规模培养 悬浮培养 悬浮培养是细胞培养的基本方法 是将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术 特点1 可以增加细胞与培养基的接触 促进营养的吸收 2 保证良好的混合状态 从而获得良好的气体传递效果 3 可以达到较高的细胞浓度 容易放大培养 细胞悬浮培养的建立 愈伤组织的诱导选择适宜的外植体 幼胚 下胚轴 子叶 选择适宜的培养基 较高激素浓度 必要的附加物质 愈伤组织要求 松散性好 增殖快 再生能力强 其外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色 呈细小颗粒状 疏松易碎 悬浮系的建立与培养 悬浮细胞的生长动态 生长速率 p 不同时间细胞密度 x 的自然对数与起始密度 x0 的自然对数之差与培养时间 t 的比值 p lnx lnx0 t 如 接种4 10 6个细胞到100ml培养基中 光照摇床 28度培养48h后 测得每毫升培养液中含8 10 8个细胞 则细胞生长速率为多少 如何判断细胞进入对数期或者稳定期 1 细胞计数 在显微镜下计数 以细胞数 ml表示单位体积的细胞密度 2 细胞体积 将细胞沉降于离心管内 测定细胞层所占的体积 3 细胞鲜重或干重 过滤后直接称重为鲜重 干燥后再称重得到的是干重 悬浮细胞的衡量指标 悬浮培养细胞的同步化 细胞同步化 同一悬浮培养体系的所有细胞都同时到达细胞周期的某一特定时期 植物细胞在悬浮培养中容易团聚并进入不同程度的分化状态 因此 要达到完全同步化是十分困难的 同一培养体系的植物细胞经常不能处于同一细胞周期 这种差异使悬浮细胞分裂 代谢以及生理生化状态等复杂化 通过一定的理化措施可以使同一体系中的细胞达到相对同步化 细胞同步化方法 饥饿法 饥饿导致的细胞分裂受阻 使细胞不能合成DNA 即不能进入S期 或细胞分裂不能进行 即不能进入M期 因此 通过饥饿法可以获得处于G1和G2期的同步化细胞 将饥饿细胞转入完整培养基中继代培养时 细胞分裂又可重新恢复 抑制剂法 通过一些DNA合成抑制剂处理细胞 使细胞滞留在DNA合成前期 当解除抑制后 即可获得处于同一细胞周期 G1 的同步化细胞 或者利用破坏微管的药物将细胞阻断在中期 常用的药物有秋水仙素和秋水仙酰胺 后者毒性较小 分选法 依据细胞体积大小 采用梯度离心或者流式细胞仪进行分选 低温处理 不同的温度对细胞的有丝分裂有极明显的影响 在一定范围内 温度下降使细胞分裂速度减慢 细胞周期延长 从而相应地延长了分裂期的时间 使分裂指数提高 细胞同步化率升高 影响悬浮细胞生长的因素 1 愈伤组织的质量2 接种细胞密度 悬浮细胞的起始密度一般在0 5 2 5 105个细胞 毫升 接种初期的细胞密度过低往往使延迟期加长 最低有效密度 即能使细胞分裂 增殖的最低接种量 3 培养条件 培养基 方式 温度 继代周期 4 培养基 应用条件培养基提供单细胞生长和分裂所需的特殊代谢物 基本培养基成分的调节视不同的培养目的而定 培养基一般均以诱导愈伤组织形成的培养基为基础进行调整 5 培养方式 摇瓶 反应器 气动式 搅拌式 分批培养 半连续培养和连续培养 通常温度为25 继代培养与继代周期 继代周期 指具有一定起始密度的细胞 从开始培养到细胞数目和总重量增长停止的一个过程 继代培养周期的长短是由起始细胞密度 延迟期的长短 生长速率等决定 继代培养 Subculture 继初代培养之后的连续数代的扩繁殖培养过程 最佳继代时期 选择指数生长期和直线生长期 固定化培养法 细胞固定化培养 将细胞限制或定位于特定空间位置的培养技术 与悬浮培养相比 固定化培养的优点 1 细胞生长比较缓慢 利于代谢物的合成和积累 2 能长时间保持细胞活力 3 可以反复使用 方便产物的连续性收获 4 抗剪切能力强 维持了细胞稳定性 适合脆弱的细胞培养 5 耐受有毒前体物质的浓度高 6 遗传性状较稳定 7 后处理难度小 8 细胞密度大于悬浮培养 固定化培养方法 1 吸附固定化通过载体表面和细胞表面间的相互作用而达到固定目的的方法 是最简单的固定化技术 在经济上也最具有吸引力 吸附固定化包含物理吸附和离子吸附两种 物理吸附载体可以反复使用 但是结合不牢固 细胞容易脱落 离子吸附依靠静电引力将细胞固定在带异电荷的载体上 常用的载体有 高岭土 皂土 硅胶 氧化铝 磷酸钙胶 微空玻璃 纤维素 胶原以及火棉胶等 固定化培养方法 2 离子 共价交联法利用偶联共价分子 如戊二醛 偶联苯胺 与细胞表面的基团 如氨基 巯基 咪唑基等 反生共价结合 从而使细胞彼此交联形成网状结构 离子 共价交联法反应剧烈 对细胞损伤大 3 共价结合法细胞表面的基团如氨基 巯基 咪唑基等 和固相支持物表面的基团形成共价键 从而固定化细胞 细胞活性收到影响 容易死亡 4 包埋法将细胞包埋在多孔载体内部制成固定化细胞 操作简便 条件温和 负荷量大 细胞泄漏少 抗机械力损伤高 是目前常用的固定化方法 包埋法存在扩散限制 大分子基质不能渗透到细胞内部 包埋法分为微囊化和凝胶包埋两大类 包埋剂有海藻酸盐 角叉胶 琼脂糖 聚丙烯酰胺等 固定化培养方法 25 1 凝胶包埋法 胶格包埋法 将酶分子包埋在高聚物网格内的包埋方法 聚丙烯酰胺包埋是最常用的包埋法 先把丙烯酰胺单体 交联剂和悬浮在缓冲溶液中的细胞混合 然后加入聚合催化系统使之开始聚合 结果就在细胞周围形成交联的高聚物网络 海藻酸钠也可以用来作为包埋载体 它从海藻中提取出来 可被多价离子Ca2 Al3 凝胶化 操作简单经济 角叉莱胶 卡拉胶 冷却成胶或与二 三价金属离子成胶 包埋条件温和无毒性 机械强度好 固定化的酶活回收率和稳定性都比聚丙烯酰胺法好 胶原和明胶也是常用的包埋载体 26 2 微囊化包埋法主要将细胞封装在胶囊 脂质体和中空纤维中 微囊制备方法 1 界面沉淀法是一种简单的物理微囊化法 它是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低而形成的皮膜将酶包埋 2 界面聚合法是将亲水性单体和疏水性单体利用界面聚合的原理包埋酶的方法 所得的微囊外观好 但不稳定 有些酶还会因在包埋过程中发生化学反应而失活 3 表面活性剂乳化液膜包埋法是在水溶液中添加表面活性剂使之乳化形成液膜达到包埋目的的一种方法 27 微囊化包埋法 凝胶包埋法 四种固定化方法的特点小结 制法 特性 思考题 1 如何得到植物离体单细胞 2 植物细胞悬浮培养有哪些方法 3 简述悬浮培养细胞同步化的方法4 简述悬浮培养中细胞生长的计量方法5 如何获得同步化的培养细胞 6 固定化细胞的方法有哪些 各自的特点是什么 植物细胞培养制备代谢产物 植物细胞培养制备代谢产物 植物中含有数量极为可观的次生代谢物质 据保守的估计 目前已发现的植物天然代谢物已超过2万种 而且还在以每年新发现1600种的速度递增 本草纲目 中记载的1892种药物中绝大多数是植物 目前 仍约25 的法定药品来自植物 早在1956年 Routier和Nickell就提出工业化培养植物细胞以提取其天然产物的大胆设想 细胞代谢产物分为初级代谢产物和次级代谢产物 初级代谢产物是指微生物通过代谢活动所产生的自身生长和繁殖所必需的物质 如氨基酸 核苷酸 多糖 脂类 维生素等具生理活性物质或为生长提供能量的必不可少的物质 次级代谢产物是指微生物生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂 对该生物无明显生理功能 或并非是该生物生长和繁殖所必需的物质 如抗生素 毒素 激素 色素等 如下列物质哪些是初级代谢产物 哪些是次级代谢产物 亮氨酸 苯丙氨酸 腺嘌呤 甘油三酯 人参皂苷 紫杉醇 青霉素 麻黄碱 肉毒素 初级代谢产物和次级代谢产物 植物次级代谢产物 根据药用情况大致分为 1 苷类 皂苷 人参皂苷 三七皂苷 柴胡皂苷 2 固醇 菜油固醇 豆固醇 胆固醇3 生物碱 吡啶类 槟榔碱 嘌呤类 咖啡碱 茶碱 4 酚类化合物 黄酮类 醌类 苯醌 萘醌 蒽醌 5 萜类化合物 三萜皂甙 d i 单萜 二萜 紫杉醇 6 多炔类 有机酸 植物次生代谢产品的市场潜能 植物细胞培养生产次级代谢产物过程 细胞株的筛选 细胞培养 次级代谢产物合成 次级代谢产物提取 提高次级代谢产物产量的途径 细胞株的筛选 细胞系 Cellline 是由原代培养经传代培养纯化 获得的以一种细胞为主的 能在体外长期生存的不均一的细胞群体 细胞株 Cellstrain 是指从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法 由单细胞增殖形成的细胞群 由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群 亦可称之为亚细胞株 适用于生产的细胞株必须满足的条件 1 分散性好 适合大规模悬浮培养 2 均一性好 细胞大小 生理状态一致 3 生长速度快 培养周期短 不易染菌 4 目标产物含量高 容易分离提取 5 细胞遗传稳定 适合工业生产用细胞株的一般筛选流程 1 愈伤组织的诱导与培养 选用植物的目标化合物高产部位作为外植体诱导愈伤组织 2 单细胞分离 选取生长快速而疏松的愈伤组织 分散接种固体培养基继代培养 挑选生长快速的细胞 3 细胞株的建立 转移到液体培养基中进行悬浮培养 从中选择分散性好 生长速度快的细胞 4 细胞株筛选 检测目标产物含量 从 3 中选择目标产物含量高的细胞株 5 性能评价 进行较大规模培养 考察细胞生长与目标产物合成的稳定性 6 细胞株获得 得到适合工业化生产的细胞株 细胞株保种 细胞株定向富集驯化 定向富集驯化是一种有效的筛选技术 包括 1 激素自养型细胞株的驯化筛选如 将愈伤组织或分离到的细胞接种在不含生长素 分裂素的继代培养基中进行传代培养 挑选生长好的细胞进行反复继代培养驯化 可以获得激素自养型细胞 2 耐受高剂量有毒物质的细胞株驯化筛选如 将愈伤组织或分离到的细胞接种在含高浓度乙酸盐 苯甲酸钠等毒性化合物的培养基中 反复继代培养驯化细胞 不断提高这些毒性化合物的浓度 可以获得耐受性高的细胞株 细胞株人工诱变筛选 1 细胞融合2 细胞重组3 基因突变三个人工诱变系统 1 悬浮培养系统速度快 细胞群体均匀 突变体筛选容易2 愈伤组织系统继代培养的同时进行选择压力筛选3 原生质体系统体外诱变容易 细胞培养 工业化 产业化过程 细胞培养有分批式 流加式 半连续式 连续式和贯流式5种 参考第四章内容 产物积累与细胞生长关系 a 生长偶联型 产物合成发生在细胞生长过程中 到达平台期后合成停止 b 中间型 产物合成出现在细胞生长旺盛阶段 在平台期也能合成 但是速度减缓 c 非生长偶联型 产物合成出现在细胞生长平台期 两步培养法 1 植物细胞培养中为何经常采用两步法 许多植物细胞培养研究表明 促进细胞生长的条件和促进次生代谢物生产的条件并不相同 一些促进细胞生长的因子往往抑制次生代谢物的合成和积累 因此宜用两步法 2 何为二步法 第一步 愈伤培养在生长培养基上使细胞快速增殖 第二步 细胞生长通过指数生长期后 转移到生产培养基上进行第二步培养 以获得最高次生产物产量 1 在紫草细胞悬浮培养时加入十六烷不仅可以提取紫草宁色素 而且可以使产量提高 2 采用对紫杉醇有高分配系数的十六烷 油酸等进行东北红豆杉细胞两相培养生产紫杉醇 结果好于一般悬浮培养 有机相中紫杉醇含量远高于水相和细胞内紫杉醇 3 在培养的花菱草细胞中加入一种液体硅胶可使血根碱产量大幅度提高 两相培养 在培养体系中加入水溶性或脂溶性的有机物或者具有吸附作用的多聚化合物 使培养体系形成上 下两相 细胞在水相中生长合成次生代谢物质 分泌出来的产物被转移至有机相中 不仅减少了产物的反馈抑制作用 而且实现收获的连续化 次级代谢产物合成 1 聚酮途径2 莽草酸途径3 甲戊二羟酸途径 次级代谢产物提取 细胞培养 分离细胞 过滤 离心 细胞 破碎 过滤 培养液 浓缩 过滤 萃取 浓缩 层析 纯化 活性检测 结构鉴定 药理 药代 药动 临床 安全 提高次级代谢产物产量的途径 生物因素 1 细胞株 稳定 高产 生长速度快的细胞株是细胞大规模培养生产代谢产物的前提 在进行植物细胞培养生产有价值的代谢产物时必须弄清楚产物的合成部位 也就是应该考虑到不同部位来源细胞的特性 2 细胞凋亡 是植物细胞培养过程中不可避免的现象 但是可以通过条件改变进行调控来减少细胞凋亡 保证充足的营养供给以及避免有害代谢产物的积累 这可以通过采用合适的培养工艺来实现 3 细胞团 植物细胞容易聚集成团 细胞团的形成影响稳定的悬浮体系的维持 同时造成了培养物的显著异质性 细胞团表面与内部的细胞存在营养吸收和代谢产物分泌的差异 细胞团容易受剪切力影响而破碎 引起培养液粘度增加 致使气体交换与传递受到影响 要保持反应器良好的混合效果 适当大小的细胞团有利于代谢产物积累 4 生物合成机制 次级代谢产物的生物合成不同于蛋白质合成 涉及多基因参与 机制非常复杂 影响因素非常多 结合目标产物进行生物合成机制研究 揭示代谢途径及诱导合成机制是细胞培养的重要生物学问题 有利于指导建立优化的培养工艺与技术 提高次级代谢产物产量的途径 化学因素 1 营养盐 一方面是保证植物细胞生物量的增长 另外一方面是要保证细胞能合成和积累次级代谢产物 普通的培养基一般仅能满足第一方面的需要 对于第二方面的需求 必须针对具体的培养对象和目的 优化培养基 从而保证最大限度积聚目标产物 2 前体 指某一代谢中间体的前一阶段的物质 一般在生物合成反应的中间过程中 某一阶段前的物质 都可以说是该阶段物质的前体物质 缺乏某一种前体时细胞就不能合成某一种代谢物 如果在培养基中加入外源前体将会有助于合成该代谢产物或使其产量增加 提高次级代谢产物产量的途径 3 诱导子 能够与细胞发生相互作用 通过细胞内一系列的信号转导过程 作用于与细胞次生代谢相关的基因表达 进而改变细胞次生代谢相关酶的活力 最终使细胞次生代谢水平发生改变的物质 从来源上可以分为外源性和内源性诱导子 内源性诱导子是指在外界信号刺激下细胞合成的物质 外源诱导子 菌丝 微生物机体提取物及微生物产生的多糖 蛋白和脂肪酸等 内源性诱导子 来源于植物结构的化合物 如降解细胞壁的酶 细胞壁碎片 寡聚糖等有机分子 提高次级代谢产物产量的途径 4 反馈抑制 植物次级代谢产物在培养系统的积累有时会对目标产物的合成具有反馈抑制 例如 直线式反馈控制 当末端代谢产物达到一定浓度时 就会抑制该代谢途径 通常是抑制第一种酶的活性 可以采用流加 半连续培养 两相培养等工艺技术可以克服 提高次级代谢产物产量的途径 物理因素 1 光照 光对细胞代谢产物的合成有很重要的影响 光照时间长短 光质 光强等都会对代谢产物合成和积聚产生作用 光对许多酶有诱导或抑制作用 2 温度 温度会影响酶的活性 细胞的生长速率与培养温度紧密相关 植物细胞培养一般在25 左右进行 3 pH 会影响培养液的渗透压 酸碱度 酶的活性 从而影响细胞代谢 植物细胞液体培养的pH变化范围在5 6之间 最佳的起始pH在5 5 5 8之间 如果对培养液pH进行控制 将有利于次级代谢产物的生成 提高次级代谢产物产量的途径 工程技术因素 1 培养液的流变特性 由于植物细胞培养过程中容易结团 同时 不少细胞在培养过程中容易分泌粘多糖等物质 从而使传氧速率降低 影响细胞生长 2 气体传递 植物细胞培养一般需要光照 通过光合作用合成有机物 因此氧气和CO2的含量与传递对培养过程影响较大 氧的传递与通气速率 培养液混合程度 培养液流变特性 气液界面面积等因素有关 而氧的吸收与反应器类型 细胞生长速率 温度 pH 营养组成 细胞浓度等相关 提高次级代谢产物产量的途径 3 搅拌与剪切力 为了加强气 液 固之间的传质 细胞悬浮培养时需要混合搅动 植物细胞虽然有较硬的细胞壁 但是细胞壁很脆弱 对搅拌的剪切力很敏感 由于剪切力比较大 细胞会破碎自溶 次级代谢产物合成会降低 各种植物细胞耐受剪切力的能力不尽相同 烟草细胞和长春花细胞在150rpm和300rpm时一般还能生长 培养桔叶鸡眼藤细胞时 涡沦搅拌器的转速应低于20rpm 4 泡沫与器壁表面粘附性 与微生物细胞培养相比 植物细胞培养过程中产生的气泡更大 而且由于培养液含有蛋白质或粘多糖 粘度大 细胞很容易被包埋在泡沫里 造成非均相培养 也可从营养液中带出来 造成损失或污染 因此 必须对泡沫进行消除 提高次级代谢产物产量的途径 植物组织培养制备代谢产物 细胞分化与次生代谢产物 1 细胞水平上的分化次生代谢产物和细胞的发育成熟与否有关 如绿色愈伤组织和不定芽合成羽扇豆