第五章工业微生物育种诱变剂

第五章工业微生物育种诱变剂 诱变剂 凡能诱发生物基因突变 并且突变频率远远超过自发突变率的物理因子或化学物质 1 物理诱变剂 例如 电离辐射 紫外线 电磁波等 2 化学诱变剂 如药品 农药 食品添加剂 调味品 化妆品 洗涤剂 塑料 着色剂 化肥 化纤等 3 生物诱变剂 如真菌的代谢产物 病毒 寄生虫等 生物体内还有一些内源性诱变剂 内源性诱变剂是在人体健康异常的情况下产生的 如遗传因素 内分泌紊乱等 第一节物理诱变剂 物理诱变剂是指通常使用的物理辐射中的各种射线 射线包括 紫外线 X射线 射线 快中子 射线 射线 微波 超声波 电磁波 激光射线和宇宙线等 物理辐射分为电离辐射和非电离辐射 都是以量子为单位的可以发射能量的射线 电离辐射 X射线和 射线 快中子非电离辐射 紫外线 射线的种类 室外活体辐照圃 室内辐照源 辐射离我们有多远在我们的生活环境中 辐射无处不在 家用电器 微波炉 吸尘器 电视 电冰箱 空调等 办公设备 手机 电脑 复印机 电子仪器 医疗设备等家庭装饰 大理石 复合地板 墙壁纸 涂料等周边环境 高压线 变电站 电视 广播 信号发射塔等自然环境 太阳黑子等 一 物理诱变剂的生物学效应 物理诱变剂对微生物的诱变作用主要是由高能辐射导致生物系统损伤 继而发生遗传变异的一系列复杂的连锁反应过程 分为物理 物理 化学 化学和生物学等几个阶段 电离辐射主要引起DNA上的基因突变和染色体的畸变 非电离辐射主要导致形成嘧啶二聚体 二 辐射引起生物效应的因素 辐射引起生物学效应的强弱既决定于微生物内在遗传因素 也受外界环境条件的影响 微生物的遗传背景微生物的生理状态可见光水分温度空气或氧气 三 非电离辐射 紫外线 紫外线是电磁波谱中波长从0 01 0 40微米辐射的总称 不能引起人们的视觉 电磁谱中波长0 01 0 04微米辐射 既可见光紫端到X射线间的辐射 1801年德国物理学家里特发现在日光光谱的紫端外侧一段能够使含有溴化银的照相底片感光 因而发现了紫外线的存在 自然界的主要紫外线光源是太阳 太阳光透过大气层时波长短于290 10 9米的紫外线为大气层中的臭氧吸收掉 人工的紫外线光源有多种气体的电弧 如低压汞弧 高压汞弧 紫外线有化学作用能使照相底片感光 荧光作用强 日光灯 各种荧光灯和农业上用来诱杀害虫的黑光灯都是用紫外线激发荧光物质发光的 紫外线还可以防伪 紫外线还有生理作用 能杀菌 消毒 治疗皮肤病和软骨病等 紫外线的粒子性较强 能使各种金属产生光电效应 紫外线强烈作用于皮肤时 可发生光照性皮炎 皮肤上出现红斑 痒 水疱 水肿等 严重的还可引起皮肤癌 紫外线作用于中枢神经系统 可出现头痛 头晕 体温升高等 作用于眼部 可引起结膜炎 角膜炎 称为光照性眼炎 还有可能诱发白内障 在焊接过程中产生的紫外线会使焊工患上电光性眼炎 目前 国内外的标准对纺织品的防紫外线性能一般都使用UPF值 即紫外线防护系数值进行评定 UPF值是紫外线对未防护的皮肤的平均辐射量的比值 UPF值越大 表明防紫外线性能越好 只有当UPF 30时 并且UVA的透过率小于5 时 才能称为防紫外线产品 防护等级标识为UPF30 而当UPF 50时 则表明该产品的紫外线防护性能极佳 防护等级标识为UPF50 一 紫外线的诱变机制和DNA损伤修复 1 紫外线的诱变机制紫外线引起 DNA与蛋白质的交联 胞嘧啶与尿嘧啶之间的水合作用 DNA链的断裂 嘧啶二聚体的形成 单链上相邻两个胸腺嘧啶之间或双链相对应的两个胸腺嘧啶之间 紫外线可使空气中的 2分子变成 3臭氧易分解放出原子氧 强杀菌作用 2紫外线O3 O2 O 2 DNA损伤修复包括光修复 切补修复 重组修复 SOS修复系统及聚合酶的校正作用 1 光复活一般微生物中都存在光复活作用 紫外线诱变时 照射或分离均应在红光下进行 2 切补修复在实际诱变工作中要采取某些措施避免暗修复 如加入某些物质 提高突变频率 二 紫外线诱变1 紫外线的有效光谱最有效波长为253 7nm 2537 即260nm的紫外线 30W紫外灯光谱分布范围广 诱变效率差 15W紫外灯80 波长几种在2537 诱变效果比30W的好 2 紫外线的辐射剂量绝对剂量单位 erg mm2相对剂量单位 用照射时间或杀菌率表示 一般认为杀菌率在90 99 9 时 诱变效果较好 移动式紫外灯15W紫外灯 不同微生物所需杀菌时间 15W功率的紫外灯管和固定距离为30cm的条件下照射微生物 要使杀菌率达到90 99 9 的效果 芽孢菌约需10min 照射短小芽孢杆菌的营养体来获得缺陷型需要1 3min 一般微生物营养体照射3 5min 无芽孢菌和革兰氏阳性菌只需0 5 2min 紫外线诱变的步骤与方法 1 出发菌株 把细菌斜面培养到对数期 霉菌或放线菌则培养到孢子刚成熟 2 前培养 营养丰富的培养基 同时加入抑制修复的物质 咖啡碱或异烟肼 达到最佳生理状态 3 制备菌悬液 4 紫外线照射 暗室进行 或诱变后立即浸入冰水中1 2h 低温抑制突变修复 5 后培养 根据延迟现象的原理 照射完毕的菌悬液加入到适合于正突变体繁殖的培养基 在适宜温度下培养1 5 2h 6 稀释涂皿 后培养结束后 从中取一定量培养物 作不同稀释度 涂皿 并且以未经紫外线照射过的菌悬液作对照 培养后 挑取菌落 以待筛选 四 电离辐射 伦琴和X射线 河南杞县 杞人忧钴 四川成都放60CO运输 2 电离辐射剂量快中子 拉德 rad 伦琴 R 致死率达到50 85 比较合适 诱变剂量大约在15 30krad 千拉德 X射线和 射线 伦琴 R 伦琴 1cm3干燥空气在0 1 103 105Pa 760mmHg气压下 产生2 08 109离子时所需的能量 达到1 1000的菌体生存率 剂量大约在1万 20万R 3 电离辐射的照射方法直接对平皿上生长的菌落进行照射 菌悬液置于试管内并浸入冰水中照射 处理完毕后继续冰浴可降低或抑制修复酶的活性 宇宙射线 五 近年来发展的新型诱变剂 1 微波微波对微生物的诱变效应有2个方面的因素 即热效应和非热效应 热效应是指物料吸收微波能量 使温度升高从而达到灭菌的效果 非热效应则是在电磁波的作用下 生物体内不产生明显的升温 却可以产生强烈的生物效应 2 红外射线红外辐射能促进菌体代谢 提高对紫外损伤的抗性 在紫外线中增加红外辐射可显著提高诱变效果 3 激光又称光微粒 可引起DNA 染色体畸变效应 酶的激活和钝化以及细胞的分裂和细胞代谢活动的改变等 4 高能电子流原生质体诱变 当真空中有一束离子束射向一块固体材料时 离子束把固体材料的原子或分子撞出固体材料表面 这个现象叫做溅射 而当离子束射到固体材料时 从固体材料表面弹了回来 或者穿出固体材料而去 这些现象叫做散射 另外有一种现象是 离子束射到固体材料以后 受到固体材料的抵抗而速度慢慢减低下来 并最终停留在固体材料中 这一现象就叫做离子注入 在半导体材料掺杂 金属 陶瓷 高分子聚合物等的表面改性上获得了极为广泛的应用 5 离子注入 离子注入诱变 就是利用离子注入生物体引起遗传物质的改变 导致性状的变异 从而达到育种的目的 离子注入诱变的优点 1 离子束与生物体作用 不仅有能量沉积 同时有质量沉积 2 由于注入离子的不同电荷数 质量数 能量 剂量的组合 可提供众多的诱变条件 变异幅度大 3 离子注入具有作用区域的选择性 种类的多样性 其作用是局部的 可控制的 可对生物体进行定点区域的诱变 第二节化学诱变剂 化学诱变剂 是一类能对DNA起作用 改变起结构 并引起遗传变异的化学物质 包括 碱基类似物 烷化剂 移码突变剂以及其他种类等 化学突变剂具有专一性 只对基因的某部位发生作用 化学诱变剂的剂量主要决定于其浓度和处理时间 剂量使用原则 以诱变效应大 而副反应小为原则 注意 90 以上的化学诱变剂都是致癌物质或极毒药品 使用时注意自身安全 并防止污染环境 一 碱基类似物碱基类似物 是一类和天然的嘌呤嘧啶等四种碱基分子结构相似的物质 既能诱发正向突变 又能诱发回复突变 5 溴尿嘧啶 5 BU 5 氟尿嘧啶 5 FU 5 脱溴尿嘧啶 BUdr 5 碘尿嘧啶 5 IU 2 氨基嘌呤 AP 6 巯基嘌呤 6 MP 常用5 BU和AP 碱基类似物的诱变作用是取代核酸分子中碱基的位置 再通过DNA的复制 引起突变 因此也叫 掺入诱变剂 在微生物细胞处在代谢的旺盛期效果最佳 同分异构现象 嘧啶分子以酮式和烯醇式形式出现 嘌呤分子以胺基和亚胺基互为变构 一 碱基类似物的诱变机制 正常掺入错误复制 错误掺入正常复制 碱基类似物的诱变可回复突变 复制期 细菌采用对数期的细胞 霉菌 放线菌采用孢子 但要进行前培养 使孢子处于萌动状态 并要加大5 BU的浓度 处理过程要进行振荡培养 2 氨基嘌呤 AP 可以和胸腺嘧啶互配 但出现亚氨基状态时 和胞嘧啶配对 二 碱基类似物的诱变处理方法 以5 BU为例 5 BU和5 FU为白色结晶粉末 能溶于水或乙醇 1 单独处理斜面 前培养液体培养基 对数期 离心去除培养液 加入生理盐水或缓冲液 饥饿培养8 10h 将5 BU或5 FU加入培养液 浓度为25 40 g ml 取0 1 0 2ml涂平板培养 挑单菌落真菌 放线菌孢子需加0 1 1mg ml的5 FU 振荡培养6 12h 2 与辐射线复合处理联合处理 提高突变率 二 烷化剂 活性烷基易取代DNA分子中活泼的氢原子 从而改变DNA分子结构 引起突变 单功能烷化剂 对生物毒性小 诱变效应大 双功能烷化剂 两个烷化基团特异地与DNA鸟嘌呤起反应 很容易在相对DNA链间形成共价链而产生交联现象 妨碍双链分开及DNA的复制 导致生物死亡 综合衡量 乙基功能基诱变效应比甲基功能基要强 双功能基和多功能基烷化剂比单功能基反应速度快 如硫芥 氮芥等 一 烷化剂的作用机制主要通过烷化基团使DNA分子上的碱基及磷酸部分被烷化 DNA复制时导致碱基配对失误而引起突变 突变的主要位点 鸟嘌呤的N7 鸟嘌呤的O6 胸腺嘧啶O4突变的次要位点 鸟嘌呤的N3 腺嘌呤的N2 腺嘌呤的N7 胞嘧啶N3 二 烷化剂的性质 溶液烷化剂的性质比较活泼 不太稳定 在水溶液中容易发生分解 大部分半衰期很短 其长短与温度 溶液pH关系很大 因此 化学诱变剂要现用现配还要避光 配制烷化剂时 要采用合适的出缓冲液 有毒 超级诱变剂之称 适合诱发营养缺陷型突变株 还能使多基因并发突变 NTG在水溶液中随不同pH将产生不同的分解产物 通常在pH6 0的条件下进行诱变处理 常用磷酸缓冲液和Tris缓冲液 1 1 甲基 3 硝基 1 亚硝基胍 NTG或NG或MNNG NTG诱变处理方法 步骤 新鲜斜面制备菌悬液 配制NTG母液 菌悬液和NTG溶液混合保温处理 以冷的生理盐水稀释洗涤菌体终止反应 平皿分离 其他方法 液体培养后直接加入NTG NTG与琼脂和菌液混合制平板 注意 NTG是一种强烈致癌物质 操作时要带橡皮手套 穿工作服 带口罩 用称量瓶称量 最好在通风橱中进行 凡接触过NTG的器皿必须及时 单独处理 例用自来水大量冲洗或用1 2N的NaOH浸泡过夜 洗净 2 甲基磺酸乙酯 乙基硫酸甲烷 EMS EMS诱变处理方法 EMS母液配制 菌体培养至对数期 制成菌悬液 两者混合保温处理 以冷的生理盐水稀释洗涤菌体终止反应 平皿分离 EMS是剧毒的诱变剂 在整个诱变过程 包括配制药品 操作处理 保存等都要严守安全 不能接触皮肤 所有接触过EMS的器皿 单独用大量水冲洗洗涤 或用10 NaS2O3溶液浸泡过夜 再用清水冲洗干净 3 硫酸二乙酯 DES DES原液用乙醇助溶 磷酸缓冲液稀释 菌悬液制备 DES和菌悬液混合振荡 终止反应 平皿分离 4 乙烯亚氨高浓度短时间处理 三 脱氨基 亚硝氨为例 一 亚硝酸的诱变机制亚硝酸可直接作用于正在复制或未复制的DNA分子 脱去碱基中的氨基变成酮基 改变碱基氨氢键的电位 引起转换而发生变异 还可引起DNA两条单链之间交联 二 亚硝酸的处理方法1 试剂的配制 1 1mol LpH4 5醋酸缓冲液 2 0 1mol L亚硝酸钠溶液 3 0 07mol LpH8 6磷酸氢二钠溶液2 处理方法孢子悬液 醋酸缓冲液 亚硝酸钠溶液混合保温 加入磷酸氢二钠溶液 降pH终止反应 稀释涂平板 亚硝酸钠浓度 孢子0 025mol L 细菌0 05mol L 四 移码诱变剂 移码诱变剂与DNA相互结合引起碱基增添或缺失而造成突变 移码诱变剂 吖啶黄 吖啶橙 原黄素 ICR 171 ICR 191等1 吖啶化合物的诱变机制移码突变2 吖啶黄的性质和使用方法加入到培养基中制成平板或加到培养液里 五 羟化剂 羟胺 HA 1 羟胺的诱变机制 G C A T2 羟胺的处理方法 六 金属盐类 如氯化锂 硫酸锰等 氯化锂称之为助诱变剂 氯化锂是白色粉末 易溶于水 使用时通常加到培养基中 为了速免受破坏 倒平板时 当培养基温度冷却到50 60 时才加入制成平板 然后把细菌或孢子涂布分离 处理终浓度为0 3 1 5 七 其他化学诱变剂 1 秋水仙碱 诱变辅助剂2 抗生素 链黑霉素 争光霉素 丝裂霉素 放线菌素 正定霉素 光辉霉素 阿霉素 诱变辅助剂 八 重视化学诱变剂的操作安全 化学诱变剂多数是极毒的致癌药品 在进行诱变操作后的处置以及诱变剂的保藏等方面的安全防护都是极其重要的 如有疏忽 就可能对健康和环境带来恶果 万万不可麻痹 一 噬菌体人们在使用某些噬菌体来筛选抗噬菌体突变菌株时 发现常伴随着出现抗生素产量明显提高的抗性变株 因此 可以认为这