第十八章色谱法导论(20100523)

第十八章色谱法导论 导学 本章是色谱学的核心内容 了解色谱发展历史 理解色谱法的概念 分类及特点 掌握色谱法的分离原理 了解色谱图常用术语 重点掌握保留值及其相关内容 色谱理论既是对色谱现象的概括 也是对色谱发展的指导 塔板理论和速率理论应充分理解清楚 实际工作中的分离问题与分离度密不可分 所归纳出的分离度公式是色谱法中最重要的公式 并根据它可以通过改变一些参数来控制分离度 掌握定量分析的相关方法 概述 美国气相色谱仪 HP高压液相色谱仪 国产气相色谱仪 一 色谱法 chromatography 俄国植物学家茨维特在1906年使用的装置 色谱法是一种分离技术 试样混合物的分离过程是试样中各组分在色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配过程 其中的一相固定不动 称为固定相 另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体 气体或液体 称为流动相 当流动相中样品混合物经过固定相时 就会与固定相发生作用 由于各组分在性质和结构上的差异 与固定相相互作用的类型 强弱也有差异 因此在同一推动力的作用下 不同组分在固定相滞留时间长短不同 从而按先后不同的次序从固定相中流出 色谱法简史 俄国植物学家Tswett于1901年发现 利用吸附原理分离植物色素1903年发表文章 Onanewcategoryofadsorptionphenomenaandtheirapplicationtobiochemicalanalysis1906年Tswett创立 chromatography 色谱法 新名词1907年在德国生物会议上第一次向世界公开展示显现彩色环带的柱管1930年R Kuhn用色谱柱分离出胡萝卜素1935年AdamsandHolmes发明了离子交换树脂 进一步发明了离子色谱1938年Izmailov发明薄层色谱1941年Martin Synge发明了液 液分配色谱1944年Consden Gordon Martin发明纸色谱1952年Martin Synge发明气 液色谱1953年Janak发明气 固色谱1954年Ray发明热导检测器1957年Martin Golay发明毛细管色谱1959年Porath Flodin发明凝胶色谱1960年液相色谱技术完善 二 色谱法的分类 1 按流动相和固定相所处的状态分类 超临界流体色谱法 SFC 用超临界状态的流体作流动相的色谱法 超临界状态的流体不是一般的气体或流体 而是临界压力和临界温度以上高度压缩的气体 其密度比一般气体大得多而与液体相似 故又称为 高密度气相色谱法 2 按固定相的固定方式分类 3 按分离过程的机制分类 三 色谱法的特点和应用 1 分离效能高2 灵敏度高3 分析速度快4 应用范围广5 色谱法的缺点是对未知物的定性分析比较困难 1 色谱分析广泛应用于极为复杂的混合物成分分析 2 液相色谱法 在糖类 氨基酸 农药 染料 贵金属 有机金属化合物等方面得到了广泛的应用 3 色谱分离是一种有效的提纯物质技术 用于制备分离 得到高纯样品 4 色谱 质谱联用仪已成为研究分子结构的重要手段 应用范围广 色谱分离原理 色谱分离是基于样品中各组分在两相间平衡分配的差异 色谱分离过程的两大特点 第一 不同组分在通过色谱柱时移动的速度不等 差速迁移 它提供了实现分离的可能性 第二 各组分分子沿柱子进行扩散分布 即分子分布离散 色谱基本理论是从微观分子运动和宏观分布平衡探讨提高分离迁移和降低离散迁移 色谱基本理论是从热力学和动力学两方面讨论色谱分离问题 分配系数和分配比1 分配系数K 又称为平衡常数 是指在一定的温度和压力下组分在两相间达到分配平衡时 组分在固定相中的浓度Cs与在流动相中的浓度Cm之比 即 K 溶解度或吸附能力 组分在固定相中的量 在流动相中的量 组分在固定相中滞留的时间越长 K由组分及固定液的热力学性质决定的 只随柱温和柱压而变化 与色谱柱中气相和液相的体积无关 如果两个组分的分配系数相同 则它们的色谱峰完全重合 分配系数相差越大 相应的色谱峰相距越远 分离越好 一定温度下 组分的分配系数K越大 出峰越慢 试样一定时 K主要取决于固定相性质 每个组份在各种固定相上的分配系数K不同 选择适宜的固定相可改善分离效果 试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础 某组分的K 0时 即不被固定相保留 最先流出 2 分配比k 又称容量因子或容量比 是在一定温度和压力下 组分在两相间达到分配平衡时 组分在固定相中的质量p和在流动相中的质量q之比 1 分配系数与分配比都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数 随分离柱温度 柱压的改变而变化 2 分配系数与分配比都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数 数值越大 该组分的保留时间越长 3 分配比可以由实验测得 k tR t0 3 分配系数与分配比的关系 Vm 为柱内流动相的体积 也称为柱的死体积 包括固定相颗粒之间和颗粒内部空隙中的流动相体积 Vs 为固定相的体积 它指真正参与分配的那部分体积 若固定相是吸附剂 固定液 离子交换剂或凝胶 则分别指吸附表面积 固定液体积 离子交换剂交换容量或凝胶孔容 4 基本保留方程 基本保留方程可表示为 tR t0 1 k 若载气流量F0恒定 也可用保留体积表示 则VR Vm KVs这就是色谱基本保留方程 上式说明 色谱柱确定后 Vm和Vs即为定值 分配系数不同的各组分具有不同的保留值 因而在色谱图上有不同位置的色谱峰 色谱图及常用术语 试样各组分经色谱柱分离后 从柱后流出进入检测器 检测器将各组分浓度 或质量 的变化转换为电压 或电流 信号 电信号强度随时间变化的曲线 称为流出曲线 也叫色谱图 一 基线 当没有待测组分进入检测器时 在实验操作条件下 反映检测器噪声随时间变化的曲线称为基线 稳定的基线是一条直线 二 峰高 从色谱峰顶点到基线的距离叫峰高 它的平直与否可反应出实验条件的稳定情况 噪音 使基线发生细小的波动的现象 拐点间距离的一半 即图中1 2EF 峰底宽Wb 4 半峰宽 2 354 三 区域宽度 峰底宽度半峰宽标准偏差 色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之一 可用于衡量色谱柱的柱效及反映色谱操作条件下的动力学因素 宽度越窄 其效率越高 分离的效果也越好 如果进样量很小 浓度很低 在吸附等温线的线性范围内 色谱峰如果对称 可用Gauss正态分布函数表示 式中 C 不同时间t时某物质的浓度 C0 进样浓度 tr 保留时间 标准偏差 不对称因子 在实际的色谱过程中 很少符合高斯分布 而是具有一定的不对称性 可以定义一个不对称因子As来定量地表示色谱峰的不对称程度 拖尾峰 当As大于1时 色谱峰的形状是前半部分信号增加快 后半部分信号减少慢 引起峰拖尾的主要原因是溶质在固定相中存在吸附作用 因此 拖尾峰也称为吸附峰 伸舌峰 当As小于1时 色谱峰是前半部分信号增加慢 后半部分信号减小快 因为伸舌峰主要是固定相不能给溶质提供足够数量合适的作用位置 使一部分溶质超过了峰的中心 即产生了超载 所以也称超载峰 色谱流出曲线的意义 色谱峰数 样品中单组份的最少个数 色谱保留值 定性依据 色谱峰高或面积 定量依据 色谱保留值或区域宽度 色谱柱分离效能评价指标 色谱峰间距 固定相或流动相选择是否合适的依据 四 保留值 保留值是试样中各组分在色谱柱中滞留时间 retentiontime 的数值 反映了组分分子与固定相分子间作用力的大小 保留值通常用时间 距离或用将组分带出色谱柱所需要的流动相体积来表示 保留值是由色谱分离过程中的热力学因素所决定的 因此 在一定色谱条件下保留值是特征的 可作为色谱定性的参数 一 保留值的定义 4 保留体积 5 死体积 6 调整保留体积 从进样开始到色谱峰最大值出现时所需要的时间 称为保留时间 1 保留时间 2 死时间 不被固定相保留的组分 从进样到出现峰极大值所需要的时间称为死时间 死时间实际上就是流动相流经色谱柱所需要的时间 对于同一试样所有组分死时间都是相同的 3 调整保留时间组分的保留时间与死时间之差值 即实际上就是组分被固定相滞留的总时间 4 保留体积从进样开始到色谱峰最大值出现时所通过的流动相的体积 其单位为mL 式中为流动相平均体积流速 因为液体可以认为是不可压缩的 所以在液相色谱中 即为实测值 而在气相色谱中 由于气体可以压缩 必须根据色谱柱的工作状态 对实验值进行校正 5 死体积 不被保留的组分通过色谱柱所消耗的流动相的体积 可由死时间确定 死体积本意是指色谱柱中未被固定相占据的空隙体积 也即色谱柱内流动相的体积 但在实际测量时 它包括了柱外死体积 色谱仪中的管路和连接头间的空间以及进样系统和检测器的空间 当柱外体积很小时 可以忽略不计 6 调整保留体积 保留体积减去死体积 即组分停留在固定相时所消耗的流动相体积 二 保留值与平衡常数K的关系 调整保留体积与平衡常数K成正比 推导依据 当某一组分的色谱峰最高点出现时 说明该组分恰好有一半的量洗脱在体积的流动相中刚好流出柱子 其余一半则仍留在柱内 即留在柱内的流动相 体积为Vm 与固定相 体积为Vs 中 三 保留值与容量因子的关系由容量因子与平衡常数的关系可得 分配系数K与保留时间的关系为 tR k tM KtMVs Vm 在一定的实验条件下 组分的调整保留时间正比于分配系数K 或分配比k K 或k 越大 组分在色谱柱内的保留时间越长 由于分配系数 或分配比 是由组分的性质决定的 因此保留值可用于定性 在填充色谱柱中 选择不同的固定液及其用量 控制组分在色谱柱上的保留值 由此可推导 容量因子是色谱柱对组分保留能力的参数 值越大 保留时间越长 综上所述 在色谱分析中要使两组分分离 它们的保留时间t必须不同 而t是由两组分的K或k 决定 所以待分离组分K或k 不同是色谱分离的先决条件 四 相对保留值也称选择性因子 selectivityfactor 其定义为 标志两个峰在色谱图上的相对位置 可以方便地从色谱图上计算 相对保留值越大 越容易分离 如果 1 分离不能实现 只与柱温和固定相性质有关 而与柱内径 柱长L 填充情况及流动相流速无关 因此 在色谱分析中 尤其是GC中广泛用于定性的依据 小结 色谱基本术语 保留值定性的依据死时间tm保留时间tR调整保留时间t R死体积Vm保留体积VR调整保留体积V R 相对保留值 选择因子 区域宽度峰底宽度W半峰宽W1 2标准偏差 衡量柱效率和反映色谱操作条件的动力学因素 峰高峰面积 定量分析的基础 色谱法基本理论 色谱峰间距离由分配系数决定 即与色谱的热力学过程有关 色谱峰的宽窄由组分在色谱柱内的传质和扩散行为决定 即与色谱的动力学过程有关 色谱理论可分为热力学及动力学理论两方面 热力学理论是由相平衡观点来研究分离过程 塔板理论 动力学理论是以动力学观点速度来研究各种动力学因素对柱效的影响 速率理论 把色谱柱比作分馏塔 引用处理分馏过程的概念和理论来解释色谱的分离过程 一 塔板理论 半经验理论 将色谱分离过程比拟作蒸馏过程 将连续的色谱分离过程分割成多次的平衡过程的重复 类似于蒸馏塔塔板上的平衡过程 在每一个塔板上 被分离组分达到一次分配平衡 塔板理论的假设 1 在每一个平衡过程间隔内 平衡可以迅速达到 这一小段间隔的柱长称为理论塔板高度 2 将载气看作成脉动 间歇 过程 3 试样沿色谱柱方向的扩散可忽略 4 每次分配的分配系数相同 根据上述假定 在色谱分离过程中 该组分的分布可计算如下 开始时 若有单位质量 即m 1 例1mg或1 g 的该组分加到第0号塔板上 分配平衡后 由于k 1 即ns nm故nm ns 0 5 当一个板体积 1 V 的载气以脉动形式进入0号板时 就将气相中含有nm部分组分的载气顶到1号板上 此时0号板液相 或固相 中ns部分组分及1号板气相中的nm部分组分 将各自在两相间重新分配 故0号板上所含组分总量为0 5 其中气液 或气固 两相各为0 25而1号板上所含总量同样为0 5 气液 或气固 相亦各为0 25 以后每当一个新的板体积载气以脉动式进入色谱柱时 上述过程就重复一次 见下表 流出曲线的形状和浓度极大的位置按上述分配过程 对于n 5 k 1 m 1的体系 随着脉动进入柱中板体积载气的增加 组分分布在柱内任一板上的总量 气液两相中的总质量 见上表 由塔板理论可建立流出曲线方程 m为组分质量 V为任意流动相体积 Vr为保留体积 n为理论塔板数 当V Vr时 C值最大 即 由流出曲线方程可推出 而理论塔板高度 H 即 从上两式可以看出 色谱峰宽越小 n就越大 而H就越小 柱效能越高 因此 n和H是描述柱效能的指标 通常填充色谱柱的n 103 H 1mm 而毛细管105 106 H 0 5mm 保留时间越长 W或W1 2越小 色谱峰越窄 理论塔板数越多 组分在两相间达到分配平衡的次数也越多 分离能力越强 柱效也就越高 有效理论塔板高度和有效理论塔板数 则 在实际应用中 提出了将除外的有效理论塔板数作为柱效能指标 其计算公式为 在实际应用中 常常出现计算出的n虽然很大 但色谱柱的柱效却不高 这是由于保留时间tR中包含了死时间t0 而t0并不参加柱内的分配过程 因此理论塔板数和理论塔板高度并不能真实地反映色谱柱分离效能的好坏 为此 提出用有效塔板数neft和有效高度Heft评价柱效能的指标 有效理论塔板数与容量因子的关系 上式说明了 值越小 就明显地小于值 值越大 就越接近值 应当指出 在相同条件下 用不同的值的组分测出的柱效率是不同的 小结 塔板理论 H 理论塔板高度 理论塔板数n 由于理论塔板数n不能真实地反映色谱柱的分离效能 故提出用扣除了死时间影响的有效理论塔板数neff和有效塔板高度Heff 色谱柱长度 塔板理论是一种半经验性的平衡理论 用热力学的观点阐明了溶质在色谱柱中的分配平衡和分离过程解释了流出曲线的形状及浓度极大值的位置提出了计算和评价柱效的参数 贡献缺点 不能解释造成谱带扩张的原因和影响板高的各种因素不能说明同一溶质为什么在不同的流速下 可以测得不同的理论塔板数 二 速率理论 1 速率方程 1956年荷兰学者范第姆特 VanDeemter 等人在研究气液色谱时 提出了色谱过程动力学理论 导出了塔板高度H与载气线速度的关系式 该理论仍然采用塔板高度的概念 但同时考虑到H还取决于同一组分的不同分子在柱中差速迁移过程中所引起的色谱峰扩展程度 将色谱过程与组分在两相间的扩散和传质过程等动力学因素联系起来 从理论上总结出影响塔板高度的各种因素 1 涡流扩散项 A A 2 dpdp 固定相的平均颗粒直径 固定相的填充不均匀因子 固定相颗粒越小dp 填充的越均匀 A H 柱效n 表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻 色谱峰较窄 当色谱柱内同时起步的组分随流动相进入色谱柱朝柱口方向移动时 如果固定相颗粒大小及填充不均匀 组分分子穿过这些空隙时碰到大小不一的颗粒而必须不断改变流动方向 使组分分子在柱内形成了紊乱的 涡流 不同的组分分子所经过的路径长短不一 组分分子或前或后流出色谱柱 造成色谱峰的峰形扩张 采用粒度较细 颗粒均匀的担体 尽量填充均匀可以降低涡流扩散项 降低板高H 提高柱效 2 分子扩散项 B B 2 Dg a 扩散导致色谱峰变宽 H n 分离变差 b 分子扩散项与流速有关 流速 滞留时间 扩散 c 扩散系数 Dg M载气 1 2 M载气 B值 Dg 组分在流动相中的扩散系数 cm2 s 弯曲因子 亦称阻碍因子 由于固定相颗粒的存在使扩散受阻 当试样分子以 塞子 的形式进入色谱柱后 随流动相在柱中前进时 由于存在浓度梯度 组分分子自发地向前和向后扩散即沿着色谱柱轴向扩散 这种扩散称为 纵向分子扩散 结果使色谱峰扩张 板高H增大 讨论 Dg随柱温升高而增加 随柱压降低而减小 流动相分子量大 Dg小 即B小 u增加 组份停留时间短 纵向扩散小 对于液相色谱 因Dm较小 B项可忽略 选择 球状颗粒 大分子量流动相 适当增加流速 短柱 低温 3 传质阻力项 Cu 组分在气相和液相两相间进行反复分配时 遇到阻力产生 Cu Cm Cs u式中Cm 流动相传质阻力 指试样组分从流动相扩散到流动相与固定相界面进行质量交换过程中所受到的阻力 Cs 固定相传质阻力 为组分从两相界面扩散到固定相内部达到分配平衡后又返回到两项界面时受到的阻力 采用细颗粒 增大组分在流动相中的扩散系数Dm 采用分子量小的流动相 使组分分子在流动相中的扩散系数增加 适当降低流动相线速度等均可使流动相传质阻力减小 Csu 组分分子从两相界面扩散到固定液内部 在固定液中消耗的时间不同 分配平衡后又返回到两相界面所需时间不同 使色谱带展宽 Cmu 组分分子进入色谱柱后 从流动相扩散到两相界面需要一定的时间 与扩散经过的距离平方成正比 与组分的Dm成反比 而扩散经过的路径决定于固定相颗粒间空隙的大小 即决定于dp的大小 由于组分处在颗粒空隙间的不同位置 因此到达两相界面的时间不同 使谱带展宽 减小液膜厚度df CS下降 但k又减小 当保持固定液含量不变时 可通过增加固定液载体的比表面来降低df 但比表面过大又会因吸附过强使峰拖尾 增加柱温 可增加组分分子在液相中的扩散系数DS 但k值也减小 为保持合适CS值 应控制柱温 气相传质阻力 液相传质阻力 填充颗粒直径 组分分子在气相中的扩散系数 载气平均线速度 固定相液膜厚度 组分在液相中扩散系数 以气 液色谱为例 将A B C值分别代入色谱板高方程式中 此方程式称为范第姆特方程 也叫速率方程 它表明理论塔板高度是引起峰扩展的诸因素对理论塔板高度的贡献的总和 范式方程对色谱分离条件的选择具有指导意义 vanDeemter方程的H u曲线 流动相传质阻力项 分子扩散项 涡流扩散项 H u关系曲线 固定相传质阻力项 载气流速高时 传质阻力项是影响柱效的主要因素 流速 柱效 载气流速低时 分子扩散项成为影响柱效的主要因素 流速 柱效 由于流速对这两项完全相反的作用 流速对柱效的总影响使得存在着一个最佳流速值 即速率方程式中塔板高度对流速的一阶导数有一极小值 以塔板高度H对应载气流速u作图 曲线最低点的流速即为最佳流速 在某一流速 最佳线速度 下有一板高的极小值 最小板高 相应的柱效最高 LC的最小板高比GC的小一个数量级以上 理论上 说明柱效LC比GC高得多 由于LC的最佳流速很小 若使用 则分析时间太长 故实际使用的流速比最佳流速高很多 对于一定长度的柱子 理论塔板数越大 板高越小 柱效越高 粒度越细 板高越小 受线速度影响亦小 在HPLC分析中采用细粒作固定相的理论根据 但颗粒细导致柱流速慢 当采用高压技术 才能实现HPLC的分析要求 固定相粒度大小对板高的影响 在其他条件不变的情况下 填料粒度由大变小时 涡流扩散项A变小 纵向扩散项B基本不变 流动相传质阻力项减小 而当固定液含量不变时 粒度变小 表面积增大 液膜厚度变小 固定相传质阻力项减小 即C变小 因此可知 最小塔板高度减小 而最佳流速增大 5 速率理论的要点 1 组分分子在柱内运行的多路径与涡流扩散 浓度梯度所造成的分子扩散及传质阻力使气液两相间的分配平衡不能瞬间达到等因素是造成色谱峰扩展柱效下降的主要原因 2 通过选择适当的固定相粒度 载气种类 液膜厚度及载气流速可提高柱效 3 速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导 阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响 4 各种因素相互制约 如载气流速增大 分子扩散项的影响减小 使柱效提高 但同时传质阻力项的影响增大 又使柱效下降 柱温升高 有利于传质 但又加剧了分子扩散的影响 选择最佳条件 才能使柱效达到最高 2 影响色谱带展宽的其他因素 1 非线性色谱速率理论比较全面地考虑了两相中的传质和扩散 但仍假定等温线是线性的 等温线是非线性的 等温线的非线性决定了分配系数不是常数 使谱带的高浓度区域 中心附近 和低浓度区域 前沿和尾部 的分子的移动速率不等 使峰展宽 2 活性中心的影响由于载体表面不完全惰性 即使涂布少量固定液后 在它表面存在的活性中心 如酸或碱作用中心 对极性强的组分仍会产生吸附 使这些组分释放的速度慢于其他分子而造成拖尾 解决办法是将载体预处理 除去或减少这些活性中心 3 柱外效应在色谱柱以外的降低柱分离效率的现象称为柱外效应 造成柱外效应的因素有两类 柱前后死体积和与进样有关的技术 后者包括进样速度慢 进样量大及气化温度不够高等 对组分在两相中的分配系数不起任何作用 反而造成谱带展宽 因此 必须将柱外效应抑制到最低程度 改善柱效率的因素 选择颗粒较小的均匀填料 选用较低的柱温操作 降低担体表面液层的厚度 选用合适的载气及载气流速 流速较小时 分子扩散项成为色谱峰扩张的主要因素 宜用相对分子质量较大的载气 流速较大时 传质项为控制因素 宜用相对分子质量较小的载气 分离度 色谱分离中的四种情况的讨论 柱效较高 K 分配系数 较大 完全分离 K不是很大 柱效较高 峰较窄 基本上完全分离 柱效较低 K较大 但分离的不好 K小 柱效低 分离效果更差 一 分离度的定义 分离度 resolution 又称为解析度 分辨率 是色谱图中相邻两峰分离程度的量度 两峰间的分离程度受两峰尖的距离和两峰峰宽的制约 分离度为相邻两峰保留值之差与两峰宽之和的一半的比值 为了综合考虑保留值的差值与峰宽两方面因素对柱效率的影响 以分离度作为色谱峰的总分离效能指标 时 峰间距离等于 称为分离 此时 峰有2 的相互重叠 时 峰间距离等于 称为分离 峰重叠小于1 可以认为两峰已经完全分开 若值更大 分离效果会更好 但会延长分析时间 在峰形不对称或两峰有重叠时 峰底宽度很难测定 此时可用半峰宽代替峰底宽 并认为 分子为两组分保留值之差 由色谱体系热力学过程决定 分母为两峰宽度之和一半 取决于色谱体系动力学过程 二 分离度公式 分离度概括了色谱过程动力学和热力学特性 是衡量色谱柱分离效能的总指标 由上式可知 1 增加塔板数可以提高分离度 2 k值的最佳范围是 1 k 10 3 相对保留值 增大 能显著地提高分离度两根同种色谱柱的相互关系式 三 分离度的最佳化 一 一般要求 1 定性分析最低要求 2 用峰高法进行定量分析 3 用测量峰面积法进行定量分析 4 相邻两组分的响应信号差别越大 所需的分离度值越大 二 参数影响 1 分离度与的关系 具有一定相对保留值的物质对 分离度R直接和有效塔板数n有关 说明有效塔板数能正确地代表柱效能 R与n的平方根成正比 增加n 可以增加R 降低塔板高度H是增大分离度的有效途径 根据速率理论 提高柱效采用直径较小 粒度均匀的固定相 均匀地填充色谱柱 分配色谱还需要控制较薄的液膜厚度 根据下式可计算出给定分离度下应具有的塔板数 2 分离度与的关系 分离度与成正比 当趋于0时 也趋于0 当值增大时 项增大 随之增大 当值太大时 增大对增大的贡献极小 并且分析时间大大延长 导致谱峰扩展严重 有时甚至造成谱带检测的困难 所以应将值控制在适当的范围内 从分离度 分离时间及对峰的检测等方面综合考虑 的最佳值一般控制在2 10之间 对于GC 通过提高温度 可选择合适的k值 以改进分离度 而对于LC 只要改变流动相的组成 就能有效地控制k值 它对LC的分离能起到立竿见影的效果 如果设Q n 4 1 那么 R Q k 1 k 3 分离度与的关系 当 时 不能实现分离 但值的微小变化都对有很大影响 因此增大值是改善分离度最有力的手段 r21 与固定相有关 增大 可使分离度增大 r21是由相邻两色谱峰的相对位置决定的 决定于固定相和流动相的性质 在气相色谱法中 通过改变固定相来改善r21值 流动相惰性 在液相色谱法中 通过改变流动相来改善r21值 固定相昂贵 色谱柱温度在色谱分离中所起作用 色谱柱温度在色谱分离中扮演既重要又复杂的双重作用 柱温既是热力学因素 又是动力学因素 1 组分的分配系数大小直接由组分的自由能决定 固定相一定 受柱温控制 对柱温的变化敏感 因此气相色谱柱必须置于恒温箱中操作 以排除环境温度变化而引起的干扰 在液相色谱中 分配系数对柱温的变化不敏感 可在室温下操作 2 柱温又属于动力学因素 可直接引起分子扩散速率 Dm决定 两相传质速率 Dm Ds决定 Dm和Ds的变化实际上是流动相和固定相黏度变化引起 对气体而言 温度上升 黏度上升 对液体而言 温度上升 黏度下降 但柱温对两者的变化率不等价 同时 流动相黏度变化又会引起流动相线速的变化 为获得良好的分离 选择柱温十分重要 要提高分离的选择性 柱温宜低些 为提高柱效 柱温宜高些 两者是矛盾的 应通过实验条件的选择 达到两者的优化 改善分离 为什么气相色谱柱必须置于恒温箱中操作 液相色谱可在室温下操作 样品量的影响 每一色谱柱的固定相 都有一定的样品线性容量范围 在该范围内 进样量增加 色谱峰高增加 色谱峰区域宽度和保留时间不变 若样品量超过线性容量范围 进样量增加 容量因子k下降 对于分析分离 为获得必需的分离度 一般进样量保持在线性容量范围以下 色谱柱固定相的样品容量 决定于固定相的性质和用量 某商品色谱柱有关说明书内容为 SE 54 GC柱 柱效2500 这种表示方法正确吗 为什么 不正确 该说明书虽给出了所用何种固定相 并标明是气相色谱柱 但是对于柱效的描述是不完整的 根据范氏方程 影响柱效的因素有扩散系数 液膜厚度 组分分配比等 特别是不同组分在同一根柱子上的柱效是不相同的 因此 在采用塔板数评价一根色谱柱的柱效时 必须指明组分 固定相及其含量 流动相及操作条件 柱温 流速 等 这样 也有利于购买者按条件重复试验 来验证此柱是否达到该柱效 例1 如果柱长L2为1m时 分离度为0 8 要实现完全分离 R 1 5 色谱柱Ll至少应有多长 例2 用3m长的填充柱得到如图所示的色谱流出曲线 为了得到R 1 5的分离度 填充柱最短需要多少米 例3 已知一色谱柱在某温度下的速率方程的A 0 08cm B 0 65cm2 s C 0 003s 求最佳线速度u和最小塔板高H 解 欲求u最佳和H最小 要对速率方程微分 即dH du d A B u Cu du B u2 C 0而 最佳线速 u最佳 B C 1 2最小板高 H最小 A 2 BC 1 2可得u最佳 0 65 0 003 1 2 14 7cm sH最小 0 08 2 0 65 0 003 1 2 0 1683cm 色谱定性和定量分析 一 定性分析 一 利用纯物质对照定性 二 相对保留值法 三 加入已知物增加峰高法 四 保留指数定性法 五 其它方法如红外光谱法 IR 质谱法 MS 核磁共振波谱法 NMR 等结合进行定性鉴定 一 利用纯物质对照定性 在一定色谱条件下 一个未知物只有一个确定的保留时间 将已知纯物质在相同条件下的保留时间与未知物保留时间进行比较 就可定性鉴定 相同 未知物可能是已知的纯物质 不同 未知物就不是该纯物质 纯物质对照法定性只适用于组分性质已有所了解 组成比较简单 且有纯物质的未知物 是气相色谱定性中最常用的定性方法 由于两种组分在同一色谱柱上可能有相同的保留值 只用一根色谱定性 结果不可靠 可采用另一根极性不同的色谱柱进行定性 比较未知组分和已知纯物质在两根色谱柱上的保留值 如果都具有相同的保留值 即可认为未知组分与已知纯物质为同一种物质 二 相对保留值法 对于一些组成比较简单的已知范围的混合物或无已知物时 可选定一基准物按文献报道的色谱条件进行实验 计算两组分的相对保留值 并与文献值比较 若二者相同 则可认为是同一物质 ris仅随固定液及柱温变化而变化 可选用易于得到的纯品 而且与被分析组分的保留值相近的物质作基准物 三 加入已知物增加峰高法 当未知样品中组分较多 所得色谱过密 不易辨认时 或仅作未知样品指定项目分析时均可用此法 首先作出未知样品的色谱图 然后在未知样品中加入某已知物 又得一色谱图 峰高的增加的组分即可能为这种已知物 四 保留指数定性法 保留指数 retentionindex 又称柯瓦指数 它表示物质在固定液上的保留值行为 是国际上公认的定性指针 重现性好 标准统一及温度系数小 保留指数的物理意义在于 它是与被测物质具有相同调整保留时间的假想的正构烷烃的碳数乘以100 保留指数仅与固定相的性质 柱温有关 与其它实验条件无关 其准确度和重现性都很好 IX为待测组分的保留指数 z与z n为正构烷烃对的碳数 规定正己烷 正庚烷及正辛烷等的保留指数为600 700 800 其它类推 在有关文献给定的操作条件下 将选定的标准和待测组分混合后进行色谱实验 要求被测组分的保留值在两个相邻的正构烷烃的保留值之间 由上式计算则待测组分X的保留指数IX 再与文献值对照 即可定性 二 定量分析 式中为被测组分i的质量 为被测组分i的峰面积 为被测组分i的校正因子 一