细胞培养实验室的设置及设备.doc

一、 细胞培养实验室的设置及设备（一）细胞培养实验室的设置组织细胞培养技术与其他一般实验室工作的主要区别在于要求保持无菌操作，避免微生物及其他有害因素的影响。目前，超净工作台的广泛使用，很大程度上方便了组织细胞培养工作，并使一些常规实验室有可能用于进行细胞培养。细胞培养实验室应能进行六方面的工作：无菌操作、孵育、制备、清洗、消毒灭菌处理、储藏。1无菌操作区（1）无菌操作室：无菌操作区只限于细胞培养及其他无菌操作的区域，最好能与外界隔离，不能穿行或受其他干扰。理想的无菌操作室应划为三部分：a) 更衣室供更换衣服、鞋子及穿戴帽子和口罩。b) 缓冲间位于更衣间与操作间之间，目的是为了保证操作间的无菌环境，同时可放置恒温培养箱及某些必需的小型仪器。c) 无菌操作间专用于无菌操作、细胞培养。其大小要适当，且其顶部不宜过高（不超过2.5m）以保证紫外线的有效灭菌效果；墙壁光滑无死角以便清洁和消毒。工作台安置不应靠墙壁，台面要光滑压塑作表面，漆成白色或灰色以利于解剖组织及酚红显示pH的观察。无菌操作间的空气消毒：紫外线灯产生臭氧，并且室内温度及湿度均较高，不利于工作人员健康。空气过滤的恒温恒湿装置最好。表1 洁净室（区）空气洁净度级别表洁净度级别 尘粒最大允许数立方米 微生物最大允许数 浮游菌立方米 沉降菌皿100级 3,500 0 5 110000级 350,000 2,000 100 3100000级 3,500,000 20,000 500 10300000级 10,350,000 60,000 - 15无臭氧紫外线消毒器电子消毒灭菌器在高压电场作用下，电子管的内外电极发生强烈电子轰击，使空气电离而将空气中的氧转换成臭氧。臭氧是一种强氧化剂，能同细菌的胞膜及酶蛋白氢硫基进行氧化分解反应，从而靠臭氧气体弥漫性扩散达到杀菌之目的，消毒时没有死角。消毒后空间的残留臭氧只需3040min即能自行还原成氧气，空气不留异味，消毒物体表面不留残毒。（2）净化工作台：操作简单，安装方便，占用空间小且净化效果很好。一般细菌培养室使用的净化工作台主要有两种：a)侧流式或称垂直式 b)外流式或称水平层流式。净化工作台工作原理（大致相同）通常是将室内空气经粗过滤器初滤，由离心风机压入静压箱，再经高效空气过滤器精滤，由此送出的洁净气流以一定的均匀的断面风速通过无菌区，从而形成无尘无菌的高洁净度工作环境。侧流式工作台空气净化后的气流由左或右侧通过工作台面流向对侧，也有从上向下或从下向上流向对侧，形成气流屏障保持工作区无菌。工作台结构为封闭式。外流式（水平式）工作台净化后的空气面向操作者流动，因而外方气流不致混入操作，但进行有害物质实验操作则对操作者不利。工作台结构为开放式（已少用）。净化工作台应用注意：（1）净化工作台应安装在隔离好的无菌间或清洁无尘的房间内，以免尘土过多易使过滤器阻塞，降低净化效果，缩短其使用寿命。（2）新安装的或长期未使用的工作台，工作前必须对工作台和周围环境用真空吸尘器或不产生纤维的工具进行清洁工作，然后再采用药物灭菌法或紫外线灭菌进行灭菌处理。（3）使用净化工作台前，应先用75酒精擦洗台面，并提前以紫外线灭菌灯照射3050min处理净化工作区内积存的微生物。关闭灭菌灯后应启动风机使之运转两分钟后再进行培养操作。（4）净化工作区内不应存放不必要的物品，以保持洁净气流流型不受干扰。（5）注意净化区内气流的变化，一旦感到气流变弱，如酒精灯火焰不动，加大电机电压仍未见情况改变则说明滤器已被阻塞，应及时更换。一般情况下，高效过滤器三年更换一次。更换高过滤器应请专业人员操作，以保持密封良好。粗过滤器中的过滤布（无纺布）应定期清洗更换，时间应根据工作环境洁净程度而定，通常间隔3-6个月进行一次。（6）净化工作台使用完毕应及时清理工作台面上的物品并用酒精擦洗台面使之始终保持洁净。（7）净化工作台应定期进行功能测试，检查净化工作台各项工作指标是否达到要求，例如进行无菌试验，定期检查台面空气的洁净度是否达标。超净工作台的无菌程度检查超净工作台在消毒处理后，无菌试验前及操作过程中需检查空气中菌落数；取直径约90mm平皿，在超净工作台内点燃酒精灯，在酒精灯旁，以无菌操作，将平皿半开注入溶化的营养琼脂培养基约20ml，制成平板，在3035预培养48小时，证明无菌后将平板3个，以无菌方式带入超净工作台内左、中、右各放一个；打开平皿盖扣置，平板在空气中暴露30分钟后将平皿盖盖好，置3035培养48小时，取出检查，100级清洁度要求：3个平皿上生长的菌落数平均不得超过1个。超净工作台应定期请有关部门检查其洁净度，应达到100级（一般用尘埃粒子计数仪）检测尘埃粒径5祄的粒数不得超过3.5个升；空气流量应控制在0.751.0m3/s；细菌菌落数平均1个，可根据无菌状况必要时置换过滤器。2孵育区本区对无菌的要求虽不比无菌区严格，但仍需清洁无尘，因此也应设置在干扰少而非来往穿行的区域。孵育可在孵箱或可控制温度的温室中进行，后者费用高，一般实验室多采用孵箱进行工作。3制备区在该区主要进行培养液及有关培养用的液体等的制备。4储藏区主要存放各类冰箱、干燥箱、液氮罐、无菌培养液、培养瓶等，此环境也需要清洁无尘。5清洗和消毒灭菌区清洁和消毒灭菌区应与其他区域分开，主要进行所有细胞培养器皿的清洗、准备、消毒及三蒸水制备等工作。(二)细胞培养实验室的设备组织细胞培养室除一般实验室的普通常规设备外，尚有一些特殊需要的设备。基本可分为两大类：第一类为常用的基本设备；第二类为较高级的特殊设备。1. 常用的基本设备（1） 仪器：a）显微镜：倒置显微镜是组织细胞培养室所必需的日常工作常规使用设备之一，便于掌握细胞的生长情况并观察有无污染等。若有条件，尚可配置带有照相系统的高质量相差显微镜、解剖显微镜、荧光显微镜、录像系统或缩时电影拍摄装置等，以便随时观察、记录、摄影细胞生长情况。a） 培养箱：体外培养的细胞和体内细胞一样，需要在恒定的温度下生存，大多数情况下，最适温度是37，温差变化一般不应超过0.5，细胞在温度升高2时，持续数小时即不能耐受，40以上将很快死亡。因此需要有能控制温度的培养箱，如具有较高灵敏度的恒温培养箱及CO2培养箱。恒温培养箱应选隔水式或晶体管自控温培养箱，此类培养箱灵敏度高，温度控制较稳定。一般的恒温培养箱价格较便宜，其缺点是只宜于作密闭式培养。CO2培养箱目前多数的细胞培养室已广泛使用。CO2培养箱的优点是能够提供进行细胞培养时所需要的一定量的CO2（常用浓度为5），易于使培养液的pH保持稳定，适用于开放或半开放培养。培养细胞的器皿可用培养皿、培养板或培养瓶；当使用培养瓶时，可将瓶盖略微旋松，使培养瓶内与外界保持通气状态。由于这种培养方法培养器皿内部与外界相通，培养箱内空气必须保持清洁，应定期以紫外线照射或酒精消毒。同时培养箱应放置盛有无菌蒸馏水的水槽，防止培养液蒸发，使箱内相对湿度始终保持为100。c）干燥箱：用于细胞培养箱的有些器械、器皿需要烘干后才能使用，玻璃器皿等须干热消毒。干热消毒时，电热干燥箱升温较高，一般需达到160以上。通常使用鼓风式电热干燥箱。其优点是温度均匀、效果较好，缺点是升温过程较慢。升温时不能先升温后鼓风而应鼓风与升温同时开始，至100时，停止鼓风，应避免包裹器皿的纸或棉花烧焦，烧焦的碎屑可影响细胞的生长。消毒后，不能立即打开箱门以免骤冷而导致玻璃器皿损坏，应等候温度自然下降至100以下方可开门。d）水纯化装置：细胞培养对水的质量要求较高，细胞培养以及与细胞培养工作相关的液体的配制用水必须事先严格纯化处理。水纯化时可采用离子交换装置或蒸馏器。离子交换纯水尚不能有效去除有机物，因此用水时尚需再次蒸馏。进行细胞培养时配制各种培养液及试剂等均需使用三次蒸馏水：即使是用于玻璃器皿的冲洗，也应使用二次以上蒸馏水。目前国内使用较多的是自动双重纯水蒸馏器（石英管加热），使用方便，安全、蒸馏速度快（1600ml/h）。使用注意：a不可采用普通自来水蒸馏，以免蒸馏器内很快结成水垢影响蒸馏效果；同时，还需视蒸馏器内存水垢程度定期彻底清洗蒸馏器。b正确的使用方法是将经金属蒸馏器蒸馏的蒸馏水加入玻璃蒸馏器内进行再次蒸馏。一般配制培养液的用水应在配液前蒸馏，不宜使用存放数日的三蒸水，以免影响培养用水的质量。目前市场上供应的是含有各种级别和类型的采用一种或多种纯化方法相结合的使普通水纯化为纯水和超纯水的纯水系统可供选择。例如：设计灵活的可以挂壁、也可为台式，也可以有储水箱、也可直接用分液枪的纯水装置；还可根据各类实验用水需求选择配备有效杀菌或去除DNA酶、RNA酶、蛋白酶等，甚至可有效去除掉热源、内毒素的超滤型纯水器。e）冰箱：细胞培养室必须配备a普通冰箱或冷藏柜储存培养液、生理盐水、Hanks液试剂等培养用的物品及短期保存组织标本。b低温冰箱（-20）、超低温冰箱用于储存需要冷冻保存生物活性及较长时期存放的制剂，如酶、血清等。细胞培养室的冰箱应属专用，不得存放易挥发、易燃烧等对细胞有害的物质，且应保持清洁。f）细胞冷冻储存器：储存器常用的是液氮容器。根据使用需要分为不同的类型及多种规格。选择购置液氮容器时要综合考虑容积大小，取放使用方便及液氮挥发量（经济）三种因素。液氮容器的大小可自25L500L，可以储存1ml的安瓿25015000个左右。液氮温度可低达-196，使用时应防止冻伤。由于液氮不断挥发，应注意观察存留液氮情况，及时定期补充液氮，避免挥发过多而致细胞受损。目前，国内各类实验室已广泛使用新型的细胞冷冻储存器。市场所提供的各种新型的细胞冷冻储存器具有性能优异，使用方便等特点。例如：可通过先进的电子控制器实现冻存自动化并监测液氮水平和样品温度，确保样品温度始终处于设定温度点；可配备先进的报警系统，分别警报液氮液面、温度、电池、电压、电源等失常情况：同时具备热气体旁路系统，防止高于-130的暖空气进入液氮罐，从而更有效地保护样品，防止升温。另外，多种规格的先进液氮运输，供应罐系列不仅移动方便，还可通过连接管给储存罐补充液氮，提高工作效率，保证样品安全。g）离心机：进行细胞培养时，常规需要进行制备细胞悬液、调整细胞密度、洗涤、收集细胞等工作，通常需要使用离心机。a一般可常规配置4000rpm的国产台式离心机，例如细胞沉降，使用80100g的离心机即可，离心力过大有时可能引起细胞的损伤。b另外，可根据需要添置其他类型如大容量或可调节温度的离心机等c若需特殊用途，例如某些细胞的分离制备需梯度离心，则需另行配置实验所需的具备其他特殊功能的离心机。h）天平：常用的有扭力天平、精密天平及各种电子天平。分析天平的感量为0.1mg、0.01mg和0.001mg。根据称取物质的量和称量精度的要求，选择适宜级别的天平。要求精密称定时，当取样量大于100 mg 选用感量为0.1mg天平，在10010 mg 选用感量为0.01mg 天平，小于10mg选用感量为0.001 mg天平 。i）消毒器：直接或间接与细胞接触的物品均需消毒灭菌处理。常用：a手提式高压蒸汽消毒器b目前市场上，具有高效、安全、方便等性能，适用于各种器皿、液体、培养基的高压灭菌装置已在流通（如脉动真空灭菌器）。可供使用者在灭菌的同时监测灭菌容器内的压力和温度，确保灭菌质量和安全，并可通过记忆（储存）支持系统改变各种参数（例如灭菌、排气、加热等参数），即使在进行灭菌时发生停电故障，仍可保留所设定的参数j）滤器：目前细胞培养工作中采用的培养用液，包括人工合成培养液、血清、消化用胰酶等常含有维生素、蛋白、多肽、生长因子等物质，这些物质在高温或射线照射下易发生变性或失去功能，因而上述液体多采用滤过消毒以除去细菌。目前常使用的滤器有Zeiss滤器、玻璃滤器和微孔滤器，各种滤器有其使用原理和特点（后详述）。（2）培养用器皿：a）培养器皿：供细胞接种、生长等用的器皿，可由透明度好、无毒的中性硬质玻璃或无毒而透明光滑的特制塑料制成。（a）玻璃培养器皿的优点是多数细胞均可生长，易于清洗、消毒，可反复使用，并且透明而便于观察；缺点是易碎，清洗时费人力。（b）塑料制培养器皿的优点是一次性使用，厂家已消毒灭菌密封包装，打开即可用于细胞培养操作。常用的培养器皿：培养瓶：由玻璃或塑料制成。主要用于培养、繁殖细胞。进行培养时培养瓶瓶口加盖螺旋瓶盖或胶塞，胶塞多用于密封培养。国产培养瓶的规格以容量（ml）表示，如250ml、100ml、25ml等；进口培养瓶则多以底面积（cm2）表示。培养皿：由玻璃或塑料制成，供盛取、分离、处理组织或做细胞毒性、集落形成、单细胞分离、同位素掺入、细胞繁殖等实验使用。常用的培养皿规格有10cm、9cm、6cm、3.5cm等。多孔培养板：为塑料制品。可供细胞克隆及细胞毒性等各种检测实验使用。其优点是节约样本及试剂，可同时测试大量样本，易于进行无菌操作。培养板分为各种规格，常用的规格有：96孔、24孔、12孔、6孔、4孔等。各种单层生长的细胞在培养器皿中长满时可获得的细胞数，主要是取决于器皿的底表面积和细胞体积的大小。常用培养器皿及可获得的细胞数（以Hela细胞为例）见表2。表2 常用的培养器皿及可获得的细胞数培养器皿 底面（cm2） 加培养液量（ml） 可获细胞量96孔培养板 0.32 0.1 110524孔培养板 2 1.0 510512孔培养板 4.5 2.0 11066孔培养板 9.6 2.5 2.51064孔培养板 28 5.0 71063.5cm培养皿 8 3.0 2.01066 cm培养皿 21 5.0 5.21069 cm培养皿 49 10.0 12.210610 cm培养皿 55 10.0 13.710625cm塑料培养瓶 25 5.0 510675 cm塑料培养瓶 75 1530 210725 ml玻璃培养瓶 19 4.0 3106100 ml玻璃培养瓶 37.5 10.0 6106250 ml玻璃培养瓶 78 15.0 71072500 ml旋转培养瓶 700 100250 2.0108b）培养操作有关的器皿：a贮液瓶：主要用于存放或配制各种培养用液体如培养液、血清及试剂等。贮液瓶分为各种不同规格，如1000ml、500ml、250ml、100ml、50ml、5ml等。b吸管：主要分为刻度吸管、无刻度吸管。刻度吸管主要用于吸取、转移液体，常用的有1ml、2ml、5ml、10ml等规格。无刻度吸管分为直头吸管及弯头吸管，除可以作吸取、转移液体外，弯头尖吸管还常用于吹打、混匀及传代细胞。c加样器（移液器）：用于吸取、移动液体或滴加样本。可根据需要调节量的大小，吸量准确、方便。尤以微量加样器，可保证实验样品（或试剂）含量精确，重复性良好。目前，可高温消毒的，多通道的各类移液器可供使用者选择，能确保加样准确、快速、方便并且达到无菌要求。c）其他用品：尚有收集细胞用的离心管，放置