广西地方标准《陆川猪及其肉制品的分子定性鉴定方法》（征求意见稿）

ICS67050X04DB45广西壮族自治区地方标准DB45/TXXXXX2017陆川猪及其熟肉制品的分子定性鉴定方法MOLECULARQUALITATIVEIDENTIFICATIONMETHODOFLUCHUANPIGANDITSCOOKEDMEATPRODUCTS（征求意见稿）2017XXXX发布2017XXXX实施广西壮族自治区质量技术监督局发布DB45/TXXXXX2017I目次前言II1范围12规范性引用文件13术语和定义14原理15仪器与试剂26鉴定步骤27结果判定与表述48实验室防污染措施4附录A（资料性附录）陆川猪特异性条带的核苷酸序列信息5附录B（规范性附录）PCR所用引物信息6附录C（资料性附录）样品DNA提取方法7附录D（资料性附录）10琼脂糖凝胶的制备8附录E（资料性附录）不同品种猪肉电泳检测图9DB45/TXXXXX2017II前言本标准按照GB/T112009给出的规则起草。本标准由广西大学提出。本标准起草单位广西大学、广西分析测试研究中心、广西经贸职业技术学院、广西陆川县质量技术监督局。本标准主要起草人黄丽、黄磊、杨磊、黄岛平、庞理松、夏宁、林葵、韦保耀、滕建文、庞丽。DB45/TXXXXX20171陆川猪及其熟肉制品的分子定性鉴定方法1范围本标准规定了陆川猪及其肉制品的分子定性鉴定的术语和定义、原理、仪器与试剂、鉴定步骤、结果判定与表述和实验室防污染措施的要求。本标准适用于广西壮族自治区境内陆川猪及其肉制品的分子定性鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验用水规格和试验方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义以下术语和定义适用于本文件。31陆川猪LUCHUANPIG因原产与广西东南部的陆川县而得名，现主要分布于玉林、钦州、梧州等地，体型特点为体躯矮，短，肥，宽。头较短小，耳小而薄向外平伸，额有横行皱纹。32PCRPOLYMERASECHAINREACTION聚合酶链反应（聚合酶链反应）是一种在体外快速扩增特定基因或DNA片段的方法。由“热变性复性延伸”三步反应组成一个PCR循环，经过多次循环反应，使目标DNA得以大量扩增。33特异性引物SPECIFICPRIMER针对特定模板DNA片段设计的两段与模板两端分别互补的一对寡核苷酸序列，在PCR反应中与模板DNA两端分别特异性结合。4原理采用DNA试剂盒，提取样品中的DNA，以提取的DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，对比DNA标准分子量条带，检验PCR产物是否有大小为1200BP的纯种陆川猪特异性条带或900BP的陆川猪系特异性条带，特异性条带的核苷酸序列信息见附录A，从而对生鲜肉及肉制品是否属于陆川猪进行判断。DB45/TXXXXX201725仪器与试剂51主要仪器及耗材511普通PCR仪。512电泳仪。513凝胶成像设备。514高速冷冻离心机。515冷藏冷冻冰箱。516漩涡振荡器。517微量移液器（10L、100L、1000L）。51802ML普通PCR管。519一次性PE手套。511015ML离心管。52主要试剂521除另有规定外，所有试剂均为分析纯或者生化试剂。522实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。523DNA提取试剂盒（GENOMICDNAISOLATIONKITINSTRUCTIONMANUAL）。5241XTAE缓冲液。5252XESPCRMASTERMIX（含溴酚蓝染料）。526MARKER为100BPPLUSDNALADDER。53特异性引物根据陆川猪线粒体TYRP1基因的核苷酸序列设计引物，其中WM12扩增陆川猪的基因片段大小为1200BP，WM14扩增陆川猪基因片段大小为900BP。PCR所用引物信息见附录B，使用前先对其进行预处理，使用小型离心机对引物进行2S左右离心，后加入说明书上各引物的稀释所需体积的TE溶液，使引物浓度达到100M，完成后将引物放入20冰箱中保存备用。6鉴定步骤61样品DNA提取依照通用型基因组DNA提取试剂盒（GENOMICDNAISOLATIONKITINSTRUCTIONMANUAL）中动物组织基因组DNA提取操作（内含步骤说明）进行提取，方法参照附录C。62DNA纯度的测定取5LDNA溶液加灭菌水稀释至1ML，用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260NM和280NM处的吸光值A260和A280。DNA的浓度按照式（1）计算1105NAC式中CDNA浓度，单位为微克每微升（G/L）；A260NM处的吸光值；DB45/TXXXXX20173N核酸稀释倍数。注当A260/A280比值在1720之间时，适宜于PCR扩增。63PCR反应配置体系时在每个PCR管内按照表1从上至下的顺序依次加入试剂和模板，注意在加样时应使样品DNA模板溶液完全落入反应液中，不应粘附于管壁上，如若管壁上存在粘附残留，必须先进行离心使其全部落入管底，再将PCR管放入PCR仪内准备扩增。PCR反应体系应符合表1的要求。表1PCR反应体系试剂名称剂量引物（上游）05L引物（下游）05L2ESTAQMASTERMIX125LDNA模板100L补DDH2O至250L64PCR反应程序在PCR仪表设置界面设定扩增程序95/5MIN预变性；95/30S变性，36/30S退火，72/2MIN延伸，35个循环；72/5MIN总延伸；4保存。65实验对照651鉴定过程设阴性对照、空白对照。652阴性对照将地方土猪或地方黑猪或白条猪或其他非陆川猪按61提取DNA，按63配置PCR反应体系，按64程序进行PCR扩增；653空白对照以灭菌水代替DNA模板，按63配置PCR反应体系，按64程序进行PCR扩增。66PCR反应运行设定好PCR仪的扩增程序后，检查PCR反应管是否摆放正确，盖紧PCR仪器盖，开始运行仪器进行PCR反应。67琼脂糖电泳检测PCR扩增完成后，尽快进行琼脂糖电泳检测，使用微量移液器取5L扩增产物，加入到浓度为10的琼脂糖凝胶（10琼脂糖凝胶制备见附录D）的上样孔中，同时加入2L的MARKER，用1TAE作为缓冲液，合闭电泳槽的盖子，开启电源开关，按5V/CM设定电压，电泳30MIN。68紫外成像拍照电泳结束后，小心地将凝胶从电泳槽中取出，放入盛有适当浓度溴化乙锭的避光容器里染色15MIN左右，染色完成后将凝胶转移到凝胶成像设备中观察拍照。拍照获得相应的电泳图进行结果判定。若不能及时进行紫外拍照观察，应将凝胶放入1TAE缓冲液中暂时保存，但不宜超过4H，超过应重做步骤66和67。DB45/TXXXXX201747结果判定与表述71质量控制以下条件有一条不满足时，结果视为无效A空白对照目标基因琼脂糖电泳检测无条带。B阴性对照目标基因琼脂糖电泳检测无条带。72结果判定将电泳后的琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统内观察，与标准DNA分子量比较，观察测试样品琼脂糖电泳检测图（参考附录图E1和图E2），按照以下方法进行判定如测试样品目标基因琼脂糖电泳检测有1200BP和900BP对应条带，则判定为被检样品阳性；如测试样品目标基因琼脂糖电泳检测无1200BP和900BP对应条带，则判定为被检样品阴性；如测试样品目标基因琼脂糖电泳检测只有900BP对应条带，则重复试验一次。如再次扩增后电泳检测仍只有900BP对应条带，且阴性对照和空白对照结果达到指控要求，则判定被检样品含有陆川猪源性成分。73结果表述应按照以下要求表述结果为阳性者，表述为“被检样品为纯种陆川猪”；结果为阴性者，表述为“被检样品为非陆川猪”；结果为含有陆川猪源性成分者，表述为“被检样品为杂元陆川猪”。8实验室防污染措施按照GB/T27403的规定执行。DB45/TXXXXX20175AA附录A（资料性附录）陆川猪特异性条带的核苷酸序列信息附录A给出了陆川猪特异性条带的核苷酸序列信息。ACAAAGGGCTACAAACCAAAGCCTCATCCTGCACCCTTGCCTCAAGCAGGATGAAAGCTCAGAAACTCCTCTCTCTGGGGTACACTTTCTTGCCTCTGCTGTTTATTCAGCAGGCCTGGGCTCAGTTCCCCAGAGAGTGTACCACCATTGAGGCTTTGAGAAGTGGGGTATGTTGCCCAGATCTGTCCCCACTGTCTGGGCCCGGGACTGACCGCTGTGGCTTCTCCTCAGGGAGGGGCAGGTGTGAGGCCGTGACAGCAGACTCCCGACCCCACAGCCADB45/TXXXXX20176BB附录B（规范性附录）PCR所用引物信息表B1给出了PCR所用引物信息。表B1PCR所用引物信息检测基因引物序列上游5CACCACCACGC3WM12下游5CACCACCACGC3上游5'CTCCTCCTCGC3'WM14下游5'CTCCTCCTCGC3'DB45/TXXXXX20177CC附录C（资料性附录）样品DNA提取方法C1方法说明依照通用型基因组DNA提取试剂盒（GENOMICDNAISOLATIONKITINSTRUCTIONMANUAL）中动物组织基因组DNA提取说明进行操作。C2操作方法C21将待测的原料猪肉，去除肥肉后，用灭菌刀切分。提取时切取05G肉样，剪碎后用干净镊子或药匙转移至干净的离心管中；C22向离心管中加入400LBUFFERL1和20LFOREGENEPROTEASE，涡旋混匀，放置于65金属浴或水浴中25MIN30MIN，其间每间隔10MIN涡旋混匀一次，促进酶解；C23酶解完成后，加入400LBUFFERL2，颠倒混匀至分层消失，置于65金属浴或水浴中10MIN，然后12000RPM室温离心5MIN10MIN，收集上清液；C24将上清液用移液器转移到离心柱中，再将离心柱放入收集管中，然后12000RPM室温离心1MIN，弃掉收集管中的废液；C25向离心柱中加入500LBUFFERPW，12000RPM室温离心1MIN，弃掉收集管中的废液；C26再向离心柱中加入700LBUFFERWB，12000RPM离心1MIN，弃掉收集管中的废液；将离心柱放回收集管中，12000RPM空管离心2MIN，弃掉离心柱中残余的BUFFERWB；C27将离心柱移至新的15ML离心管中，向膜中央悬空滴加100L已于65预热的BUFFEREB，室温放置5MIN，12000RPM离心1MIN，收集洗脱液；C28再次向膜中央悬空滴加100L已预热的BUFFEREB，12000RPM离心1MIN，收集洗脱液；将两次收集的洗脱液合并，即得样品DNA。DNA提取后置于20保存。DB45/TXXXXX20178DD附录D（资料性附录）10琼脂糖凝胶的制备D1概述本附录给出了10琼脂糖凝胶的制备方法。D2制备方法D21将凝胶托架两端用胶带封闭并水平放置在工作台上，放上梳子，使梳齿下沿距托架板05MM至10MM。D22配制足够量的凝胶称取10G琼脂糖于三角瓶中，加入100ML1倍TAE电泳缓冲液，加热溶解琼脂糖。D23待琼脂糖溶液冷至50时，将胶液沿托架胶板边缓慢连续注入，让胶液自由流向各方，凝胶厚度控制在3MM至5MM之间。待凝胶完全凝固后，撤去两端胶带。D24将托架放入电泳槽中，加入1倍TAE电泳缓冲液，使之浸过胶面2MM，拔出梳子，以备加样电泳。DB45/TXXXXX20179EE附录E（资料性附录）不同品种猪肉电泳检测图图E1和图E2分别给出了不同品种猪肉的WM12电泳检测图和WM14电泳检测图。图E1WM12电泳检测图注1至1