尼龙固定化木瓜蛋白酶

1 尼龙固定化木瓜蛋白酶尼龙固定化木瓜蛋白酶 一一 实验原理实验原理 通过物理或化学的方法 将水溶性的酶与水不溶性的载体结合 固定在载体上 在一定的空间 范围内进行催化反应的酶称为固定化酶 酶的固定化方法有 吸附法 物理吸附 离子吸附 包 埋法 共价键结合法 交联法 固定化酶的优越性主要表现在 1 在大多数情况下 可提高酶 的稳定性 2 提高酶的使用效率 降低生产成本 3 酶不与产品混合 制品易于纯化 4 利用固定化酶 工业上可以大批量 连续化生产 本实验尼龙固定化木瓜蛋白酶属共价键结 合法 尼龙长链中的酰胺键 经 HCl 水解后 产生游离的 NH 基 在一定条件下与双功能试剂戊二 醛中的一个 CHO 缩合 戊二醛的另一个 CHO 则与酶中的游离氨基缩合 形成尼龙 载体 戊二 醛 交联剂 酶 即尼龙固定化木瓜蛋白酶 二二 实验材料 试剂及仪器实验材料 试剂及仪器 3 1 材料 尼龙布 86 或 66 100 目 剪成 3 3cm2 3 2 试剂 1 1 甲醇溶液 含 18 6 CaCL2和 18 6 水 每组 50mL 称 18 6 克 CaCL2 溶于 18 6 mL 蒸 馏水 冷却后 用甲醇定容至 100 mL 1 2 3 5mol L HCl 溶液 每组 30mL 取 29 2 mL 浓 HCl 定容至 100 mL 1 3 0 2 mol L 硼酸缓冲液 pH 8 4 每组 30mL 称取 0 858 克 Na2B4O7 10H2O 和 0 68 克 H3BO3用蒸馏水溶解 定容至 100 mL 1 4 5 戊二醛 以 0 2mo1 L pH 8 4 硼酸缓冲液配制 每组 30mL 取 25 戊二醛 20mL 用 0 2mo1 L pH 8 4 硼酸缓冲液定容至 100 mL 2 5 0 1mo1 L pH 7 2 磷酸缓冲液 每组 250mL 称取 1 28 克 Na2HPO4 2H2O 和 1 克 NaH2PO4 12H2O 用蒸馏水溶解 定容至 100 mL 2 6 0 5mo1 L NaCl 溶液 用 0 1mo1 L pH 7 2 磷酸缓冲液配制 每组 150mL 称取 2 93NaCl 用 0 1mo1 L pH 7 2 磷酸缓冲液溶解 定容至 100 mL 3 7 木瓜蛋白酶溶液 1mg mL 用 0 1mo1 L pH 7 2 磷酸缓冲液配制 每组 15mL 称取 100 mg 木瓜蛋白酶粉末 加 1 mL 激活剂 研磨 10min 用 0 1mo1 L pH 7 2 磷酸缓冲液溶解 定容 至 100 mL 3 8 激活剂 用 0 1mo1 L pH 7 2 磷酸缓冲液配制 含半胱氨酸 10mmo1 L EDTA 1mmo1 L 每组 50mL 称取 0 12 克半胱氨酸和 0 04 克 EDTA 用 0 1mo1 L pH 7 2 磷酸缓冲液溶解 定 容至 100 mL 4 9 0 5 酪蛋白 用 0 1mo1 L pH 7 2 磷酸缓冲液配制 每组 20mL 称取 0 5 克酪蛋白 加 100 mL0 1mo1 L pH 7 2 磷酸缓冲液 37 下保温振荡 3h 至酪蛋白溶解 4 10 10 三氯乙酸 用蒸馏水配制 每组 40mL 称取 10 克三氯乙酸 加蒸馏水溶解 定 容至 100 mL 3 3 仪器 2 恒温水浴锅 紫外分光光度计 冰箱 四四 实验步骤实验步骤 4 1 固定化酶的制备 1 每组取 5 块尼龙布洗净 凉干 用含 18 6 CaC12和 18 6 水的甲醇溶液在室温下保温 10 秒钟左右 并轻轻搅拌至尼龙布发粘 取出用水冲去污物 用吸水纸吸干 2 尼龙布用 3 5mo1 L HCl 在室温水解 45min 用水洗至 pH 中性 3 尼龙布用 5 戊二醛在室温下浸泡偶联 20min 4 取出尼龙布 用 0 1mol L pH7 2 磷酸缓冲液反复洗去多余的戊二醛 吸干 立即用酶 液 1mg mL 在 4 下固定 3 5h 酶液用量每块布为 0 8mL 5 从酶液中取出尼龙布 保留残余酶液作测定用 用 0 5 mo1 L 的 NaCl 用 0 1mol L pH7 2 磷酸缓冲液配制 洗去多余的酶蛋白 即为尼龙固定化酶 4 2 酶活力测定 1 溶液酶活力测定 取 0 2mL 酶液 加入 1 8mL 激活剂 37 预热 10min 加入 37 预热 10min 的 0 5 酪蛋白溶液 1mL 准确反应 10min 加入 10 三氯乙酸 2mL 反应终止酶反应 对照管先 加入 10 三氯乙酸溶液 后加酪蛋白溶液 其它与测定管相同 以 4000rpm 转速离心 5min 或者过滤 清液于 280nm 波长下测定光吸收值 在上述条件下 在酶反应的 10min 内增加 0 001 个光吸收值为 1 个酶单位 U 以下同 表 1 酶活力测定 溶液酶固定化酶残留酶试剂 对照组 12 对照组 12 对照组 12 激活剂 mL 1 81 81 82 02 02 01 81 81 8 酶液 固定化 酶 mL 或块 0 20 20 2 1 块1 块1 块 0 20 20 2 37 保温 10min 37 0 5 酪 蛋白 mL 11 11 11 37 反应 10 min 10 TCA mL 摇匀 222222222 1 酪蛋白 mL 1 1 1 离心或过滤取上清 A280nm 2 残留酶活力测定 同溶液酶活力测定 3 固定化酶活力测定 取一块尼龙布固定化酶 加入 2 0mL 激活剂 其余步骤与溶液酶测定 3 相同 五五 数据处理及计算数据处理及计算 活力回收 固定化酶总活力数 溶液酶总活力数 100 相对活力 固定化酶总活力数 溶液酶总活力数 残留酶活力数 100 六六 注意事