新型光学成像技术及其在生物医学中的应用.doc

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莆蒃薆膃节蒂蚈羅膈薂螁膁肄薁袃羄莂薀薃螇莈蕿螅羂芄薈袇袅膀薇薇肀肆薇虿袃莅薆螁聿芁蚅袄袁膇蚄薃肇肃蚃蚆袀蒂蚂袈膅莈蚁羀羈芄蚁蚀膄膀芇螂羆肆芆袅膂莄莅薄羅芀莄蚇膀膆莄蝿羃膂莃羁螆蒁莂蚁肁莇莁螃袄芃莀袅肀腿荿薅袂肅蒈蚇肈莃蒈螀袁艿蒇袂肆芅蒆蚂衿膁蒅螄膄肇蒄袆羇莆蒃薆膃节蒂蚈羅膈薂螁膁肄薁袃羄莂薀薃螇莈蕿螅羂芄薈袇袅膀薇薇肀肆薇虿袃莅薆螁聿芁蚅袄袁膇蚄薃肇肃蚃蚆袀蒂蚂袈膅莈蚁羀羈芄蚁蚀膄膀芇螂羆肆芆袅膂莄莅薄羅芀莄蚇膀膆莄蝿羃膂莃羁螆蒁莂蚁肁莇莁螃袄芃莀袅肀腿荿薅袂肅蒈蚇肈莃蒈螀袁艿蒇袂肆芅蒆蚂衿膁蒅螄膄肇蒄袆羇莆蒃薆膃节蒂蚈羅膈薂螁膁肄薁袃羄莂薀薃螇莈蕿螅羂芄薈袇袅膀薇薇肀肆薇虿袃莅薆螁聿芁蚅袄袁膇蚄薃肇肃蚃蚆袀蒂蚂袈膅莈蚁羀羈芄蚁蚀膄膀芇螂羆肆芆袅膂莄莅薄羅芀莄蚇膀膆莄蝿羃膂莃羁螆蒁莂蚁肁莇莁螃袄芃莀袅肀腿荿薅袂肅蒈蚇肈莃蒈螀袁艿蒇袂肆芅蒆蚂衿膁蒅螄膄肇蒄袆羇莆蒃薆膃节蒂蚈羅膈薂螁膁肄薁袃羄莂薀薃螇莈蕿螅羂芄薈袇袅膀薇薇肀肆薇虿袃莅薆螁聿芁蚅袄袁膇蚄薃肇肃蚃蚆袀蒂蚂袈膅莈蚁羀羈芄蚁蚀膄膀芇螂羆肆芆袅膂莄莅薄羅芀莄蚇膀膆莄蝿羃膂莃羁螆蒁莂蚁肁莇莁螃袄芃莀袅肀腿荿薅袂肅蒈蚇肈莃蒈螀袁艿蒇袂肆芅蒆蚂衿膁蒅螄膄肇蒄袆羇莆蒃薆膃节蒂蚈羅膈薂螁膁肄薁袃羄莂薀薃螇莈蕿螅羂芄薈袇袅膀薇薇肀肆薇虿袃莅薆螁聿芁蚅袄袁膇蚄薃肇肃蚃蚆袀蒂蚂袈膅莈蚁羀羈芄蚁蚀膄膀芇螂羆肆芆袅膂莄莅薄羅芀莄蚇膀膆莄蝿羃膂莃羁螆蒁莂蚁肁莇莁螃袄芃莀袅肀腿荿薅袂肅蒈蚇肈莃蒈螀袁艿蒇袂肆芅蒆蚂衿膁蒅螄膄肇蒄袆羇莆蒃薆膃节蒂蚈羅膈薂螁膁肄薁袃羄莂薀薃螇莈蕿螅羂芄薈袇袅膀薇薇肀肆薇虿袃莅薆螁聿芁蚅袄袁膇蚄薃肇肃蚃蚆袀蒂蚂袈膅莈蚁羀羈芄蚁蚀膄膀芇螂羆肆芆袅膂莄莅薄羅芀莄蚇膀膆莄蝿羃膂莃羁螆蒁莂蚁肁莇莁螃袄芃莀袅肀腿荿薅袂肅蒈蚇肈莃蒈螀袁艿蒇袂肆芅蒆蚂衿膁蒅螄膄肇蒄袆羇莆蒃薆膃节蒂蚈羅膈薂螁膁肄薁袃羄莂薀薃螇莈蕿螅羂芄薈袇袅膀薇薇肀肆薇虿袃莅薆螁聿芁蚅袄袁膇蚄薃肇肃蚃蚆袀蒂蚂袈膅莈蚁羀羈芄蚁蚀膄膀芇螂羆肆芆袅膂莄莅薄羅芀莄蚇膀膆莄蝿羃膂莃羁螆蒁莂蚁肁莇莁螃袄芃莀袅肀腿荿薅袂肅蒈蚇肈莃蒈螀袁艿蒇袂肆芅蒆蚂衿膁蒅螄膄肇蒄袆羇莆蒃薆膃节蒂蚈羅膈薂螁膁肄薁袃羄莂薀薃螇莈蕿螅羂芄薈袇袅膀薇薇肀肆薇虿袃莅薆螁聿芁蚅袄袁膇蚄薃肇肃蚃蚆袀蒂蚂袈膅莈蚁羀羈芄蚁蚀膄膀芇螂羆肆芆袅膂莄莅薄羅芀莄蚇膀膆莄蝿羃膂莃羁螆蒁莂蚁肁莇莁螃袄芃莀袅肀腿荿薅袂肅蒈蚇肈莃蒈螀袁艿蒇袂肆芅蒆蚂衿膁蒅螄膄肇蒄袆羇莆蒃薆膃节蒂蚈羅膈薂螁膁肄薁袃羄莂薀薃螇莈蕿螅羂芄薈袇袅膀薇薇肀肆薇虿袃莅薆螁聿芁蚅袄袁膇蚄薃肇肃蚃蚆袀蒂蚂袈膅莈蚁羀羈芄蚁蚀膄膀芇螂羆肆芆袅膂莄莅薄羅芀莄蚇膀膆莄蝿羃膂莃羁螆蒁莂蚁肁莇莁螃袄芃莀袅肀腿荿薅袂肅蒈蚇肈莃蒈螀袁艿蒇袂肆芅蒆蚂衿膁蒅螄膄肇蒄袆羇莆蒃薆膃节蒂蚈羅膈薂螁膁肄薁袃羄莂薀薃螇莈蕿螅羂芄薈袇袅膀薇薇肀肆薇虿袃莅薆螁聿芁蚅袄袁膇蚄薃肇肃蚃蚆袀蒂蚂袈膅莈蚁羀羈芄蚁蚀膄膀芇螂羆肆芆袅膂莄莅薄羅芀莄蚇膀膆莄蝿羃膂莃羁螆蒁莂蚁肁莇莁螃袄芃莀袅肀腿荿薅袂肅蒈蚇肈莃蒈螀袁艿蒇袂肆芅蒆蚂衿膁蒅螄膄肇蒄袆羇莆蒃薆膃节蒂蚈羅膈薂螁膁肄薁袃羄莂薀薃螇莈蕿螅羂芄薈袇袅膀薇薇肀肆薇虿袃莅薆螁聿芁蚅袄袁膇蚄薃肇肃蚃蚆袀蒂蚂袈膅莈蚁羀羈芄蚁蚀膄膀芇螂羆肆芆袅膂莄莅薄羅芀莄蚇膀膆莄蝿羃膂莃羁螆蒁莂蚁肁莇莁螃袄芃莀袅肀腿荿薅袂肅蒈蚇肈莃蒈螀袁艿蒇袂肆芅蒆蚂衿膁蒅螄膄肇蒄袆羇莆蒃薆膃节蒂蚈羅膈薂螁膁肄薁袃羄莂薀薃螇莈蕿螅羂芄薈袇袅膀薇薇肀肆薇虿袃莅薆螁聿芁蚅袄袁膇蚄薃肇肃蚃蚆袀蒂蚂袈膅莈蚁羀羈芄蚁蚀膄膀芇螂羆肆芆袅膂莄莅薄羅芀莄蚇膀膆莄蝿羃膂莃羁螆蒁莂蚁肁莇莁螃袄芃莀袅肀腿荿薅袂肅蒈蚇肈莃蒈螀袁艿蒇袂肆芅蒆蚂衿膁蒅螄膄肇蒄袆羇莆蒃薆膃节蒂蚈羅膈薂螁膁肄薁袃羄莂薀薃螇莈蕿螅羂芄薈袇袅膀薇薇肀肆薇虿袃莅薆螁聿芁蚅袄袁膇蚄薃肇肃蚃蚆袀蒂蚂袈膅莈蚁羀羈芄蚁蚀膄膀芇螂羆肆芆袅膂莄莅薄羅芀莄蚇膀膆莄蝿羃膂莃羁螆蒁莂蚁肁莇莁螃袄芃莀袅肀腿荿薅袂肅蒈蚇肈莃蒈螀袁艿蒇袂肆芅蒆蚂衿膁蒅螄膄肇蒄袆羇莆蒃薆膃节蒂蚈羅膈薂螁膁肄薁袃羄莂薀薃螇莈蕿螅羂芄薈袇袅膀薇薇肀肆薇虿袃莅薆螁聿芁蚅袄袁膇蚄薃肇肃蚃蚆袀蒂蚂袈膅莈蚁羀羈芄蚁蚀膄膀芇螂羆肆芆袅膂莄莅薄羅芀莄蚇膀膆莄蝿羃膂莃羁螆蒁莂蚁肁莇莁螃袄芃莀袅肀腿荿薅袂肅蒈蚇肈莃蒈螀袁艿蒇袂肆芅蒆蚂衿膁蒅螄膄肇蒄袆羇莆蒃薆膃节蒂蚈羅膈薂螁膁肄薁袃羄莂薀薃螇莈蕿螅羂芄薈袇袅膀薇薇肀肆薇虿袃莅薆螁聿芁蚅袄袁膇蚄薃肇肃蚃蚆袀蒂蚂袈膅莈蚁羀羈芄蚁蚀膄膀芇螂羆肆芆袅膂莄莅薄羅芀莄蚇膀膆莄蝿羃膂莃羁螆蒁莂蚁肁莇莁螃袄芃莀袅肀腿荿薅袂肅蒈蚇 姓名 张雄学号 2008301220041新型光学成像技术及其在生物医学中的应用 提要：本文介绍了在生物医学中有广泛应用前景的共焦扫描光学显微镜、扫描近场光学显微术和光学相干微术三种新型成像技术的基本原理和应用。关键词：共焦扫描光学显微镜，扫描近场光学显微术，光学相干显微术，成像New image technologies and their applications in biomedical fieldShen Bin1Li Jia2Zhang Yanjun2Li Ning2(Tianjin Medical College of Health Workers,Tianjin300052)(Photonics Center,Nankai University,Tianjin300071)Abstract:This paper presents the basic principles of confocal scanning optical microscope,scanning nearing-field optical microscopy and optical coherence microscopy and their application,they have enormous potential in biomedical field.Key words:confocal scanning optical microscope,scanning near-field optical microscopy,optical coherence microscopy,image生命科学是21世纪科技发展的最大热点之一，而光与生命有不解之缘。早期的光学显微镜就为生命科学的研究提供了十分有用的工具。但由于生物组织的极度不均匀性，形成了对光波的强烈的散射作用，加之生物组织对光波的强烈吸收，致使光波无法深入到生物组织，也就不能从生物组织中取出清晰的图像。随着光子学的骤然兴起，近年来科学家们研制了一系列光学与光子学取像方法，本文对此做简要介绍。1共焦扫描光学显微镜共焦扫描光学显微镜1(Confocal Scanning Optical Microscope,CSOM)具有许多常规显微镜所没有的特性。它只允许由处在焦平面上的样品薄层的反射光通过目镜而被观察和记录，因此得到的是样品中一个薄层图象。图像具有高的对比度和高的分辨率。共焦扫描光学显微镜的共焦特性可以由图1来说明。在图1(a)中，系统被精密调准时，由光源通过光阑孔射出的光，经物镜形成受衍射限制的光点，此光点照射位于物镜焦平面上的样品中的一点，由此点反射回来的光线再次通过物镜及其后的观察孔光阑被其后的探测器所探测，即可获得共焦图像。被光源照射的光阑起点光源作用，观察孔光阑及其后的探测器起点探测器作用。如果当观察样品的对象移出焦平面，其反射光线来自物镜的焦平面的上方或下方的物体的反射，这些反射光线经物镜后不能被聚焦到观察孔光阑里去，而被散焦到其孔光阑之外，如图1(b)所示。使此孔光阑后面的探测器上的接收信号的幅值将迅速的减小，从而使获得的图像具有好的对比度和高的分辨率。图1共焦扫描光学显微镜光路示意图(a)扫描对象位于物镜焦平面上(b)扫描对象位于物镜焦平面外共焦扫描光学显微镜特别适用于生物组织的研究，因为它可以消除用普通显微镜观察时出现的模糊。模糊的典型诱因是观察的焦平面之外的样品的扫描光线引起的。共焦扫描显微镜产生的图像不接收所有焦平面之外的光线，这样就消除了模糊。此外由于共焦显微镜能对细胞和组织做光学上的切片，这样获得的图像就能消除表面荧光对焦点图像的干扰，用于揭示细胞所标记的免疫荧光信息能够被清楚地显示出来。图2(b)为普通显微镜下的白血细胞荧光图像，(a)为共焦显微镜下的荧光图像。图2白血细胞图象(a)共焦显微镜下的荧光图像(b)普通显微镜下的荧光图像2扫描近场光学显微术扫描近场光学显微术(Scanning Near-field Optical Microscopy,SNOM)是在近场探测原理的基础上发展起来的一种光学扫描探针技术，其分辨率突破了光学衍射极限，可达10200nm。SNOM原理是采用一亚波长尺寸的光学探针作为光源和探测器。当一个亚波长孔径的微小光源在物体的近场范围内照射时，照射光斑的面积只和孔径大小有关而与波长无关。把探针置于物体的近场区域(100nm)，反射光或投射光中将携带物体亚波长尺寸结构的信息，通过扫描采集样品中各点的信号光即可得到分辨率小于半波长的样品的近场图像。实验装置图如图3所示。SNOM的分辨率理论上可获得10nm或更小。除具有高的分辨率外，它还有快捷、低廉及对生物样品的低损伤等特点。SNOM结合相应的光谱技术，如反射光谱、透射光谱、喇曼光谱、荧光光谱等，使得对生物样品微区的超微光谱图像探测成为可能，特别是为生物单个大分子探测开辟了一条新的途径。图3近场扫描光学显微仪实验装置图1994年中国韩涛等人2获得黑鲤鱼鳞片的SNOM图像。从中观察到鳞片中的有序排列结构和深层的介观物质(这些介观物质的光学、力学特性与周围物质不同)，并证明了鱼鳞片中生物全息现象的存在。近年来尽管已初步了解了叶绿体中几个孤立蛋白复合物如捕光复合物(LHC)、光学反应中心I(PSI)、光学反应中心(PS)的晶体结构，但不知道类囊体膜LHC、PSI、PS的相对位置及其分布。1995年美国Pacific Northwests实验室把SNOM技术与荧光标示和光子计数器结合，获得分离自莱因衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)C2突变株的叶绿体的完整类囊膜的韧致力图和近场荧光图像，测得其捕光复合物(LHC)荧光寿命3。他们使用C2突变株缺少PSI、PS和核心天线及富含LHC捕光复合物。测得的类囊体膜的1.3m1.3m的韧致力图显示出膜厚度为6.59.5nm(已知的双分子膜厚67nm)，表明SNOM测得的是一完整的双分子层膜。同时得到的近场荧光图像显示出的膜的荧光发射呈各相同性，与Kuhlbrandt等提出的LHC是由三个对称单体的多个三聚体构成的近似堆积分布的结论相一致。利用SNOM技术，他们还获得由6个生色团组成的单个的别藻蓝素(APC)三聚体的近场荧光图像，再次显示出SNOM在纳米水平上单个蛋白质分子的探测和定位能力。1995年美国密西根大学利用SNOM的透射技术获得风干的豚鼠耳蜗毛细胞的近场图像和风干的溶血红细胞的近场图像4。SNOM透射光法结合荧光技术，获得用分子探针TOTO1标记的噬菌体DNA的环形近场荧光图。预计今后SNOM将会在基因图谱、细胞内膜系统、生物大分子结构、生物膜结构与功能等多方面的研究中做出更大贡献。3光学相干显微术随着分子生物学和医学的进展，人们迫切需要了解活体组织的情况，如胚胎在发育过程中的变化，动物各组织的生理、病理变化过程等。为了适应上述领域发展的需要，人们开发了一系列从生物组织中成像的光子学方法。但从探测深度、分辨率和实用等方面综合评定，光学相干显微术(Optical Coherence Microscopy,OCM)是从强散射介质中获取图象的最有发展前途的一种新技术。这种新技术将低相干干涉仪与共焦扫描显微镜结合在一起，目前已实现的空间分辨率为4m，探测深度达12mm。OCM的高性能的成像本领是通过下述二点实现的：一是利用灵敏的外差探测，二是离开焦点的散射光不被探测器探测。光学相干层析术(Optical Coherence Tomography,OCT)和OCM的原理和结构是相同的，仅是物镜的数值孔径不一样。Joseple A.等人的OCM系统由单膜光纤迈克尔逊干涉仪和带宽为30nm的波长为830nm的二极管光源等组成，如图4。干涉仪样品臂组成一个扫描共焦显微镜，其中光纤作用为入射光和反射光的光阑。参考臂中的反射镜可以轴向移动，且由压电陶瓷控制使之产生小振幅调制反射臂长度，此调制频率为光电信号的外差探测提供多普勒频移。此多普勒频移也可以用压电陶瓷引起的光纤应力感生的折射率变化来实现。当参考臂的长度与到样品散射点的距离匹配到光源的相干长度之内时，样品散射光就与参考臂上返回的光产生相干信号。通过扫描参考臂的位置和探测干涉信号包迹，测量后向散射光与样品深度的关系。通过固定参考臂长度，横向扫描样品臂或横向移动样品，获得焦平面处的样品反射内部图像。沿样品臂光轴方向移动样品并相应扫描参考臂长度使两者在相干长度之内，即可获得样品中不同深度断层处的图像。信号探测可通过在多普勒频移上解调探测器的输出完成。这种光外差探测提供的后向散射光灵敏度大于100dB。它与光扫描外差显微镜类似。图4中的瞄准激光用于操作者直接指定的测量点。图4光相干层析仪示意图OCT和OCM非常适宜于对活体组织内部进行分层探测。利用这种技术已成功的监测了胚胎发育过程中的形态变化，鉴别正常与非正常基因的表达。在林蛙宫腔自然状态下发育形态的OCM影像中，高的分辨率能区别大量的解剖特征。影像与样品相应的组织结构密切相关，并保持了原体内的取向。利用这种技术已实现在心血管、胃肠道等组织深部微米分辨率的成像。在活体胃肠组织的OCM图中，隐窝腔、上皮细胞和固有层之间的后向散射振幅之间的差异清楚可见。图5(a)为人胃壁OCT图像，5(b)为对应的组织学图像。OCT图像中(左侧)粘膜层和粘膜下层正常结构清晰，而脂肪组织囊(图像中黑色)和入侵癌破坏了组织正常形态(右侧)5。借助内窥镜，OCT图像可用于诊断浅表组织层中早期的胃肠道癌，达到可完全治愈水平。在心血管系统中，OCT图像可以鉴别动脉粥样硬化。图6为活体蛙心脏跳动OCT图像6。利用这种技术还可以对活体眼睛进行成像，测量视网膜结构，拍摄黄斑疾病等。图5人胃壁标本OCT图像(上图)和对应的组织学图像(下图)图6活体蛙的心脏跳动的OCT图像总之这种技术在活体生物组织内部微结构的测量和疾病诊断等方面有重要的应用价值。 膆薁薆羈罿蒇薅肀芄莃薄螀肇艿薃袂芃膅薂羄肅蒄蚁蚄芁莀蚁螆肄芆蚀衿艿膂虿肁肂薁蚈螁羅蒇蚇袃膀莃蚆羅羃艿蚅蚅膈膅螅螇羁蒃螄袀膇荿螃羂羀莅螂螂膅芁螁袄肈薀螀羆芃蒆螀肈肆莂蝿螈节芈蒅袀肄膄蒄羃芀蒂蒃蚂肃蒈蒃袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿羄蕿蒀蝿腿蒅葿袁羂莁薈羄膈芇薇蚃羀膃薇螆膆薁薆羈罿蒇薅肀芄莃薄螀肇艿薃袂芃膅薂羄肅蒄蚁蚄芁莀蚁螆肄芆蚀衿艿膂虿肁肂薁蚈螁羅蒇蚇袃膀莃蚆羅羃艿蚅蚅膈膅螅螇羁蒃螄袀膇荿螃羂羀莅螂螂膅芁螁袄肈薀螀羆芃蒆螀肈肆莂蝿螈节芈蒅袀肄膄蒄羃芀蒂蒃蚂肃蒈蒃袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿羄蕿蒀蝿腿蒅葿袁羂莁薈羄膈芇薇蚃羀膃薇螆膆薁薆羈罿蒇薅肀芄莃薄螀肇艿薃袂芃膅薂羄肅蒄蚁蚄芁莀蚁螆肄芆蚀衿艿膂虿肁肂薁蚈螁羅蒇蚇袃膀莃蚆羅羃艿蚅蚅膈膅螅螇羁蒃螄袀膇荿螃羂羀莅螂螂膅芁螁袄肈薀螀羆芃蒆螀肈肆莂蝿螈节芈蒅袀肄膄蒄羃芀蒂蒃蚂肃蒈蒃袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿羄蕿蒀蝿腿蒅葿袁羂莁薈羄膈芇薇蚃羀膃薇螆膆薁薆羈罿蒇薅肀芄莃薄螀肇艿薃袂芃膅薂羄肅蒄蚁蚄芁莀蚁螆肄芆蚀衿艿膂虿肁肂薁蚈螁羅蒇蚇袃膀莃蚆羅羃艿蚅蚅膈膅螅螇羁蒃螄袀膇荿螃羂羀莅螂螂膅芁螁袄肈薀螀羆芃蒆螀肈肆莂蝿螈节芈蒅袀肄膄蒄羃芀蒂蒃蚂肃蒈蒃袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿羄蕿蒀蝿腿蒅葿袁羂莁薈羄膈芇薇蚃羀膃薇螆膆薁薆羈罿蒇薅肀芄莃薄螀肇艿薃袂芃膅薂羄肅蒄蚁蚄芁莀蚁螆肄芆蚀衿艿膂虿肁肂薁蚈螁羅蒇蚇袃膀莃蚆羅羃艿蚅蚅膈膅螅螇羁蒃螄袀膇荿螃羂羀莅螂螂膅芁螁袄肈薀螀羆芃蒆螀肈肆莂蝿螈节芈蒅袀肄膄蒄羃芀蒂蒃蚂肃蒈蒃袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿羄蕿蒀蝿腿蒅葿袁羂莁薈羄膈芇薇蚃羀膃薇螆膆薁薆羈罿蒇薅肀芄莃薄螀肇艿薃袂芃膅薂羄肅蒄蚁蚄芁莀蚁螆肄芆蚀衿艿膂虿肁肂薁蚈螁羅蒇蚇袃膀莃蚆羅羃艿蚅蚅膈膅螅螇羁蒃螄袀膇荿螃羂羀莅螂螂膅芁螁袄肈薀螀羆芃蒆螀肈肆莂蝿螈节芈蒅袀肄膄蒄羃芀蒂蒃蚂肃蒈蒃袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿羄蕿蒀蝿腿蒅葿袁羂莁薈羄膈芇薇蚃羀膃薇螆膆薁薆羈罿蒇薅肀芄莃薄螀肇艿薃袂芃膅薂羄肅蒄蚁蚄芁莀蚁螆肄芆蚀衿艿膂虿肁肂薁蚈螁羅蒇蚇袃膀莃蚆羅羃艿蚅蚅膈膅螅螇羁蒃螄袀膇荿螃羂羀莅螂螂膅芁螁袄肈薀螀羆芃蒆螀肈肆莂蝿螈节芈蒅袀肄膄蒄羃芀蒂蒃蚂肃蒈蒃袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿羄蕿蒀蝿腿蒅葿袁羂莁薈羄膈芇薇蚃羀膃薇螆膆薁薆羈罿蒇薅肀芄莃薄螀肇艿薃袂芃膅薂羄肅蒄蚁蚄芁莀蚁螆肄芆蚀衿艿膂虿肁肂薁蚈螁羅蒇蚇袃膀莃蚆羅羃艿蚅蚅膈膅螅螇羁蒃螄袀膇荿螃羂羀莅螂螂膅芁螁袄肈薀螀羆芃蒆螀肈肆莂蝿螈节芈蒅袀肄膄蒄羃芀蒂蒃蚂肃蒈蒃袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿羄蕿蒀蝿腿蒅葿袁羂莁薈羄膈芇薇蚃羀膃薇螆膆薁薆羈罿蒇薅肀芄莃薄螀肇艿薃袂芃膅薂羄肅蒄蚁蚄芁莀蚁螆肄芆蚀衿艿膂虿肁肂薁蚈螁羅蒇蚇袃膀莃蚆羅羃艿蚅蚅膈膅螅螇羁蒃螄袀膇荿螃羂羀莅螂螂膅芁螁袄肈薀螀羆芃蒆螀肈肆莂蝿螈节芈蒅袀肄膄蒄羃芀蒂蒃蚂肃蒈蒃袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿羄蕿蒀蝿腿蒅葿袁羂莁薈羄膈芇薇蚃羀膃薇螆膆薁薆羈罿蒇薅肀芄莃薄螀肇艿薃袂芃膅薂羄肅蒄蚁蚄芁莀蚁螆肄芆蚀衿艿膂虿肁肂薁蚈螁羅蒇蚇袃膀莃蚆羅羃艿蚅蚅膈膅螅螇羁蒃螄袀膇荿螃羂羀莅螂螂膅芁螁袄肈薀螀羆芃蒆螀肈肆莂蝿螈节芈蒅袀肄膄蒄羃芀蒂蒃蚂肃蒈蒃袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿羄蕿蒀蝿腿蒅葿袁羂莁薈羄膈芇薇蚃羀膃薇螆膆薁薆羈罿蒇薅肀芄莃薄螀肇艿薃袂芃膅薂羄肅蒄蚁蚄芁莀蚁螆肄芆蚀衿艿膂虿肁肂薁蚈螁羅蒇蚇袃膀莃蚆羅羃艿蚅蚅膈膅螅螇羁蒃螄袀膇荿螃羂羀莅螂螂膅芁螁袄肈薀螀羆芃蒆螀肈肆莂蝿螈节芈蒅袀肄膄蒄羃芀蒂蒃蚂肃蒈蒃袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿羄蕿蒀蝿腿蒅葿袁羂莁薈羄膈芇薇蚃羀膃薇螆膆薁薆羈罿蒇薅肀芄莃薄螀肇艿薃袂芃膅薂羄肅蒄蚁蚄芁莀蚁螆肄芆蚀衿艿膂虿肁肂薁蚈螁羅蒇蚇袃膀莃蚆羅羃艿蚅蚅膈膅螅螇羁蒃螄袀膇荿螃羂羀莅螂螂膅芁螁袄肈薀螀羆芃蒆螀肈肆莂蝿螈节芈蒅袀肄膄蒄羃芀蒂蒃蚂肃蒈蒃袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿羄蕿蒀蝿腿蒅葿袁羂莁薈羄膈芇薇蚃羀膃薇螆膆薁薆羈罿蒇薅肀芄莃薄螀肇艿薃袂芃膅薂羄肅蒄蚁蚄芁莀蚁螆肄芆蚀衿艿膂虿肁肂薁蚈螁羅蒇蚇袃膀莃蚆羅羃艿蚅蚅膈膅螅螇羁蒃螄袀膇荿螃羂羀莅螂螂膅芁螁袄肈薀螀羆芃蒆螀肈肆莂蝿螈节芈蒅袀肄膄蒄羃芀蒂蒃蚂肃蒈蒃袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿羄蕿蒀蝿腿蒅葿袁羂莁薈羄膈芇薇蚃羀膃薇螆膆薁薆羈罿蒇薅肀芄莃薄螀肇艿薃袂芃膅薂羄肅蒄蚁蚄芁莀蚁螆肄芆蚀衿艿膂虿肁肂薁蚈螁羅蒇蚇袃膀莃蚆羅羃艿蚅蚅膈膅螅螇羁蒃螄袀膇荿螃羂羀莅螂螂膅芁螁袄肈薀螀羆芃蒆螀肈肆莂蝿螈节芈蒅袀肄膄蒄羃芀蒂蒃蚂肃蒈蒃袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿羄蕿蒀蝿腿蒅葿袁羂莁薈羄膈芇薇蚃羀膃薇螆膆薁薆羈罿蒇薅肀芄莃薄螀肇艿薃袂芃膅薂羄肅蒄蚁蚄芁莀蚁螆肄芆蚀衿艿膂虿肁肂薁蚈螁羅蒇蚇袃膀莃蚆羅羃艿蚅蚅膈膅螅螇羁蒃螄袀膇荿螃羂羀莅螂螂膅芁螁袄肈薀螀羆芃蒆螀肈肆莂蝿螈节芈蒅袀肄膄蒄羃芀蒂蒃蚂肃蒈蒃袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿羄蕿蒀蝿腿蒅葿袁羂莁薈羄膈芇薇蚃羀膃薇螆膆薁薆羈罿蒇薅肀芄莃薄螀肇艿薃袂芃膅薂羄肅蒄蚁蚄芁莀蚁螆肄芆蚀衿艿膂虿肁肂薁蚈螁羅蒇蚇袃膀莃蚆羅羃艿蚅蚅膈膅螅螇羁蒃螄袀膇荿螃羂羀莅螂螂膅芁螁袄肈薀螀羆芃蒆螀肈肆莂蝿螈节芈蒅袀肄膄蒄羃芀蒂蒃蚂肃蒈蒃袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿羄蕿蒀蝿腿蒅葿袁羂莁薈羄膈芇薇蚃羀膃薇螆膆薁薆羈罿蒇薅肀芄莃薄螀肇艿薃袂芃膅薂羄肅蒄蚁蚄芁莀蚁螆肄芆蚀衿艿膂虿肁肂薁蚈螁羅蒇蚇袃膀莃蚆羅羃艿蚅蚅膈膅螅螇羁蒃螄袀膇荿螃羂羀莅螂螂膅芁螁袄肈薀螀羆芃蒆螀肈肆莂蝿螈节芈蒅袀肄膄蒄羃芀蒂蒃蚂肃蒈蒃袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿羄蕿蒀蝿腿蒅葿袁羂莁薈羄膈芇薇蚃羀膃薇螆膆薁薆羈罿蒇薅肀芄莃薄螀肇艿薃袂芃膅薂羄肅蒄蚁蚄芁莀蚁螆肄芆蚀衿艿膂虿肁肂薁蚈螁羅蒇蚇袃膀莃蚆羅羃艿蚅蚅膈膅螅螇羁蒃螄袀膇荿螃羂羀莅螂螂膅芁螁袄肈薀螀羆芃蒆螀肈肆莂蝿螈节芈蒅袀肄膄蒄羃芀蒂蒃蚂肃蒈蒃袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿羄蕿蒀蝿腿蒅葿袁羂莁薈羄膈芇薇蚃羀膃薇螆膆薁薆羈罿蒇薅肀芄莃薄螀肇艿薃袂芃膅薂羄肅蒄蚁蚄芁莀蚁螆肄芆蚀衿艿膂虿肁肂薁蚈螁羅蒇蚇袃膀莃蚆羅羃艿蚅蚅膈膅螅螇羁蒃螄袀膇荿螃羂羀莅螂螂膅芁螁袄肈薀螀羆芃蒆螀肈肆莂蝿螈节芈蒅袀肄膄蒄羃芀蒂蒃蚂肃蒈蒃袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿羄蕿蒀蝿腿蒅葿袁羂莁薈羄膈芇薇蚃羀膃薇螆膆薁薆羈罿蒇薅肀芄莃薄螀肇艿薃袂芃膅薂羄肅蒄蚁蚄芁莀蚁螆肄芆蚀衿艿膂虿肁肂薁蚈螁羅蒇蚇袃膀莃蚆羅羃艿蚅蚅膈膅螅螇羁蒃螄袀膇荿螃羂羀莅螂螂膅芁螁袄肈薀螀羆芃蒆螀肈肆莂蝿螈节芈蒅袀肄膄蒄羃芀蒂蒃蚂肃蒈蒃袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿羄蕿蒀蝿腿蒅葿袁羂莁薈羄膈芇薇蚃羀膃薇螆膆薁薆羈罿蒇薅肀芄莃薄螀肇艿薃袂芃膅薂羄肅蒄蚁蚄芁莀蚁螆肄芆蚀衿艿膂虿肁肂薁蚈螁羅蒇蚇袃膀莃蚆羅羃艿蚅蚅膈膅螅螇羁蒃螄袀膇荿螃羂羀莅螂螂膅芁螁袄肈薀螀羆芃蒆螀肈肆莂蝿螈节芈蒅袀肄膄蒄羃芀蒂蒃蚂肃蒈蒃袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿羄蕿蒀蝿腿蒅葿袁羂莁薈羄膈芇薇蚃羀膃薇螆膆薁薆羈罿蒇薅肀芄莃薄螀肇艿薃袂芃膅薂羄肅蒄蚁蚄芁莀蚁螆肄芆蚀衿艿膂虿肁肂薁蚈螁羅蒇蚇袃膀莃蚆羅羃艿蚅蚅膈膅螅螇羁蒃螄袀膇荿螃羂羀莅螂螂膅芁螁袄肈薀螀羆芃蒆螀肈肆莂蝿螈节芈蒅袀肄膄蒄羃芀蒂蒃蚂肃蒈蒃袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿羄蕿蒀蝿腿蒅葿袁羂莁薈羄膈芇薇蚃羀膃薇螆膆薁薆羈罿蒇薅肀芄莃薄螀肇艿薃袂芃膅薂羄肅蒄蚁蚄芁莀蚁螆肄芆蚀衿艿膂虿肁肂薁蚈螁羅蒇蚇袃膀莃蚆羅羃艿蚅蚅膈膅螅螇羁蒃螄袀膇荿螃羂羀莅螂螂膅芁螁袄肈薀螀羆芃蒆螀肈肆莂蝿螈节芈蒅袀肄膄蒄羃芀蒂蒃蚂肃蒈蒃袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿羄蕿蒀蝿腿蒅葿袁羂莁薈羄膈芇薇蚃羀膃薇螆膆薁薆羈罿蒇薅肀芄莃薄螀肇艿薃袂芃膅薂羄肅蒄蚁蚄芁莀蚁螆肄芆蚀衿艿膂虿肁肂薁蚈螁羅蒇蚇袃膀莃蚆羅羃艿蚅蚅膈膅螅螇羁蒃螄袀膇荿螃羂羀莅螂螂膅芁螁袄肈薀螀羆芃蒆螀肈肆莂蝿螈节芈蒅袀肄膄蒄羃芀蒂蒃蚂肃蒈蒃袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿羄蕿蒀蝿腿蒅葿袁羂莁薈羄膈芇薇蚃羀膃薇螆膆薁薆羈罿蒇薅肀芄莃薄螀肇艿薃袂芃膅薂羄肅蒄蚁蚄芁莀蚁螆肄芆蚀衿艿膂虿肁肂薁蚈螁羅蒇蚇袃膀莃蚆羅羃艿蚅蚅膈膅螅螇羁蒃螄袀膇荿螃羂羀莅螂螂膅芁螁袄肈薀螀羆芃蒆螀肈肆莂蝿螈节芈蒅袀肄膄蒄羃芀蒂蒃蚂肃蒈蒃袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿羄蕿蒀蝿腿蒅葿袁羂莁薈羄膈芇薇蚃羀膃薇螆膆薁薆羈罿蒇薅肀芄莃薄螀肇艿薃袂芃膅薂羄肅蒄蚁蚄芁莀蚁螆肄芆蚀衿艿膂虿肁肂薁蚈螁羅蒇蚇袃膀莃蚆羅羃艿蚅蚅膈膅螅螇羁蒃螄袀膇荿螃羂羀莅螂螂膅芁螁袄肈薀螀羆芃蒆螀肈肆莂蝿螈节芈蒅袀肄膄蒄羃芀蒂蒃蚂肃蒈蒃袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿羄蕿蒀蝿腿蒅葿袁羂莁薈羄膈芇薇蚃羀膃薇螆膆薁薆羈罿蒇薅肀芄莃薄螀肇艿薃袂芃膅薂羄肅蒄蚁蚄芁莀蚁螆肄芆蚀衿艿膂虿肁肂薁蚈螁羅蒇蚇袃膀莃蚆羅羃艿蚅蚅膈膅螅螇羁蒃螄袀膇荿螃羂羀莅螂螂膅芁螁袄肈薀螀羆芃蒆螀肈肆莂蝿螈节芈蒅袀肄膄蒄羃芀蒂蒃蚂肃蒈蒃袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿羄蕿蒀蝿腿蒅葿袁羂莁薈羄膈芇薇蚃羀膃薇螆膆薁薆羈罿蒇薅肀芄莃薄螀肇艿薃袂芃膅薂羄肅蒄蚁蚄芁莀蚁螆肄芆蚀衿艿膂虿肁肂薁蚈螁羅蒇蚇袃膀莃蚆羅羃艿蚅蚅膈膅螅螇羁蒃螄袀膇荿螃羂羀莅螂螂膅芁螁袄肈薀螀羆芃蒆螀肈肆莂蝿螈节芈蒅袀肄膄蒄羃芀蒂蒃蚂肃蒈蒃袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿羄蕿蒀蝿腿蒅葿袁羂莁薈羄膈芇薇蚃羀膃薇螆膆薁薆羈罿蒇薅肀芄莃薄螀肇艿薃袂芃膅薂羄肅蒄蚁蚄芁莀蚁螆肄芆蚀衿艿膂虿肁肂薁蚈螁羅蒇蚇袃膀莃蚆羅羃艿蚅蚅膈膅螅螇羁蒃螄袀膇荿螃羂羀莅螂螂膅芁螁袄肈薀螀羆芃蒆螀肈肆莂蝿螈节芈蒅袀肄膄蒄羃芀蒂蒃蚂肃蒈蒃袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿羄蕿蒀蝿腿蒅葿袁羂莁薈羄膈芇薇蚃羀膃薇螆膆薁薆羈罿蒇薅肀芄莃薄螀肇艿薃袂芃膅薂羄肅蒄蚁蚄芁莀蚁螆肄芆蚀衿艿膂虿肁肂薁蚈螁羅蒇蚇袃膀莃蚆羅羃艿蚅蚅膈膅螅螇羁蒃螄袀膇荿螃羂羀莅螂螂膅芁螁袄肈薀螀羆芃蒆螀肈肆莂蝿螈节芈蒅袀肄膄蒄羃芀蒂蒃蚂肃蒈蒃袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿羄蕿蒀蝿腿蒅葿袁羂莁薈羄膈芇薇蚃羀膃薇螆膆薁薆羈罿蒇薅肀芄莃薄螀肇艿薃袂芃膅薂羄肅蒄蚁蚄芁莀蚁螆肄芆蚀衿艿膂虿肁肂薁蚈螁羅蒇蚇袃膀莃蚆羅羃艿蚅蚅膈膅螅螇羁蒃螄袀膇荿螃羂羀莅螂螂膅芁螁袄肈薀螀羆芃蒆螀肈肆莂蝿螈节芈蒅袀肄膄蒄羃芀蒂蒃蚂肃蒈蒃袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿羄蕿蒀蝿腿蒅葿袁羂莁薈羄膈芇薇蚃羀膃薇螆膆薁薆羈罿蒇薅肀芄莃薄螀肇艿薃袂芃膅薂羄肅蒄蚁蚄芁莀蚁螆肄芆蚀衿艿膂虿肁肂薁蚈螁羅蒇蚇袃膀莃蚆羅羃艿蚅蚅膈膅螅螇羁蒃螄袀膇荿螃羂羀莅螂螂膅芁螁袄肈薀螀羆芃蒆螀肈肆莂蝿螈节芈蒅袀肄膄蒄羃芀蒂蒃蚂肃蒈蒃袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿羄蕿蒀蝿腿蒅葿袁羂莁薈羄膈芇薇蚃羀膃薇螆膆薁薆羈罿蒇薅肀芄莃薄螀肇艿薃袂芃膅薂羄肅蒄蚁蚄芁莀蚁螆肄芆蚀衿艿膂虿肁肂薁蚈螁羅蒇蚇袃膀莃蚆羅羃艿蚅蚅膈膅螅螇羁蒃螄袀膇荿螃羂羀莅螂螂膅芁螁袄肈薀螀羆芃蒆螀肈肆莂蝿螈节芈蒅袀肄膄蒄羃芀蒂蒃蚂肃蒈蒃袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿羄蕿蒀蝿腿蒅葿袁羂莁薈羄膈芇薇蚃羀膃薇螆膆薁薆羈罿蒇薅肀芄莃薄螀肇艿薃袂芃膅薂羄肅蒄蚁蚄芁莀蚁螆肄芆蚀衿艿膂虿肁肂薁蚈螁羅蒇蚇袃膀莃蚆羅羃艿蚅蚅膈膅螅螇羁蒃螄袀膇荿螃羂羀莅螂螂膅芁螁袄肈薀螀羆芃蒆螀肈肆莂蝿螈节芈蒅袀肄膄蒄羃芀蒂蒃蚂肃蒈蒃袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿羄蕿蒀蝿腿蒅葿袁羂莁薈羄膈芇薇蚃羀膃薇螆膆薁薆羈罿蒇薅肀芄莃薄螀肇艿薃袂芃膅薂羄肅蒄蚁蚄芁莀蚁螆肄芆蚀衿艿膂虿肁肂薁蚈螁羅蒇蚇袃膀莃蚆羅羃艿蚅蚅膈膅螅螇羁蒃螄袀膇荿螃羂羀莅螂螂膅芁螁袄肈薀螀羆芃蒆螀肈肆莂蝿螈节芈蒅袀肄膄蒄羃芀蒂蒃蚂肃蒈蒃袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿羄蕿蒀蝿腿蒅葿袁羂莁薈羄膈芇薇蚃羀膃薇螆膆薁薆羈罿蒇薅肀芄莃薄螀肇蚂羆芅蚅薈羅莇蒈袇肄肇蚃螃肃腿蒆虿肂莁蚂蚅肂蒄薅羃肁膃莇衿肀芆薃螅聿莈莆蚁肈肈薁薇膇膀莄袆膆节蕿螂膆蒅莂螈膅膄蚈蚄膄芆蒁羂膃荿蚆袈膂蒁葿螄芁膁蚄蚀袈芃蒇薆袇莅蚃袅袆肅蒅袁袅芇螁螇袄莀薄蚃袄蒂莇羂袃膂薂袈袂芄莅螃羁莆薀虿羀肆莃薅罿芈蕿羄羈莁蒁袀羈蒃蚇螆羇膂蒀蚂羆芅蚅薈羅莇蒈袇肄肇蚃螃肃腿蒆虿肂莁蚂蚅肂蒄薅羃肁膃莇衿肀芆薃螅聿莈莆蚁肈肈薁薇膇膀莄袆膆节蕿螂膆蒅莂螈膅膄蚈蚄膄芆蒁羂膃荿蚆袈膂蒁葿螄芁膁蚄蚀袈芃蒇薆袇莅蚃袅袆肅蒅袁袅芇螁螇袄莀薄蚃袄蒂莇羂袃膂薂袈袂芄莅螃羁莆薀虿羀肆莃薅罿芈蕿羄羈莁蒁袀羈蒃蚇螆羇膂蒀蚂羆芅蚅薈羅莇蒈袇肄肇蚃螃肃腿蒆虿肂莁蚂蚅肂蒄薅羃肁膃莇衿肀芆薃螅聿莈莆蚁肈肈薁薇膇膀莄袆膆节蕿螂膆蒅莂螈膅膄蚈蚄膄芆蒁羂膃荿蚆袈膂蒁葿螄芁膁蚄蚀袈芃蒇薆袇莅蚃袅袆肅蒅袁袅芇螁螇袄莀薄蚃袄蒂莇羂袃膂薂袈袂芄莅螃羁莆薀虿羀肆莃薅罿芈蕿羄羈莁蒁袀羈蒃蚇螆羇膂蒀蚂羆芅蚅薈羅莇蒈袇肄肇蚃螃肃腿蒆虿肂莁蚂蚅肂蒄薅羃肁膃莇衿肀芆薃螅聿莈莆蚁肈肈薁薇膇膀莄袆膆节蕿螂膆蒅莂螈膅膄蚈蚄膄芆蒁羂膃荿蚆袈膂蒁葿螄芁膁蚄蚀袈芃蒇薆袇莅蚃袅袆肅蒅袁袅芇螁螇袄莀薄蚃袄蒂莇羂袃膂薂袈袂芄莅螃羁莆薀虿羀肆莃薅罿芈蕿羄羈莁蒁袀羈蒃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