用ISSR分子标记研究川产道地药用植物川芎的遗传多样性.doc

明 四 川大 学 硕 上 学 位 论 文植物学 专 业研 究 生王 岚 川芎具 有 较 丰 富 的 遗传多样 性 ，这 为川芎资 源的 有 效保 护 和种质 资 源的 改良奠定 了一定 的 基 础。 为了有 效保 护 川芎的 遗传多样 性 ，建议通 过 群 体 内的 个体 间 移栽提高群 体 问 的 基 因 交 流 ，同时 应 该 保 护 遗传多样 性 较 低 的 居 群 。 尽 可能最大 限 度 的 保 护 和丰 富 其 遗传多样 性 ，提出 对 川芎遗传多样 性 的 保 护 ，育种规 划和广 泛 利 用的 有 效措施 。 ： ： 琷 ， 琘 珿 痵 叫川大 学 颐 卜 学 位 论丘四川药 用 植物资源丰富 、 生 产 条件得 天 独 厚 ， 川芎 、 附 子 、 川贝 母、 麦 冬、 川芎 以根 茎 供药 用 ， 始 载 于 神农本 草 经 ， 性 味 辛 温， 主 归 肝 、 胆、 心包经 。 其辛 散 温通， 既能 活 血， 又 能 行气 ， 从而 达 到止痛 之 效 ， 为 血中 气 药 ， 治 血气 瘀滞于 胸、 胁、 腹 诸 痛 ： 辛 温升 散 ， 能 “上行头 目”， 祛风止痛 ， 为 治 头 痛 要 药 ： 活 血调 经 ， “下调 经 水 ”， 为 妇 科要 药 ： 活 血化 瘀 ， 行气 开 郁 ， 广泛 用 于 气 血瘀 滞之 积聚， 中 风 半身不 遂 之 证 ： 亦 治 风 湿 痹 痛 。 作为 种 疗效 显著 ， 具 有极 高 药 用 价 值多 集 中 在 药 用 成 分 分 析， 药 理 作用 等 方 面 ， 遗 传多 样 性 研究几 乎 是空 白 。 婴型 盔兰 塑 竺 ：兰 垡丝塞 。 实验 方 法 缓冲 液 籶 腡 狧 ； 疞混 匀 ， 置 于 水浴中放 置 脂 糖 凝胶 中电 泳 时 ， 其中的 插入 到 肿又 行纬 捎 饣 旌 衔 铮 笵 发 射线路 。 最 终 确定 这 十条 引物 为 ， ， ， ， ， ， ， ， ， 。 条 件优 化 条 具 多态性和 稳 定 性的 引物 用 于 本 实验 的 研究 。 迮榷 訮 反 应 的 影 响 在 此 浓度 下 扩增 条 带 数量 多且 清 晰。 反 应 的 稳 定 性和 可重 复 性较 好。 删 川大 学 硕 学 位 论 文浓度 升 高 ， 扩增 带 右 弱 到 强 。 引物 浓度 选 定 阴川大 学 硕 士 学 位 论 文图 锱榷 訮 反 应 的 影 响 最 终 确定 反 应 体 系 ： 用 的 退火 温 度 可能 不 相 同。 为获得 清 晰稳 定 的 扩增 效果 ， 本 实验 普遍提高 了退 镌 谟 泻 珽 碇 悄 褐械 缬荆 詌 ； 、 基 因 流 瑃 也 被 用 来检 测 群 体遗 传 多 样 性 水 平 。根带 ， 平 均 酢 鼍 尤 旱 亩 嗄 钗 坏 惆 俜 致 平 均 为 。 痵 表 秆 龅 鮅 物 核 苷 酸 序 列 及 统 计 条带 数。 的 遗传变异 为 ， 进 一 步 说 明 了 居群 间 的 分化 水 平 较 高 。居群 问每 代个 体 了分析，结 果 表 明 ：总 的 遗 传 变 异中 有 的 变 异发 生 在 居 群问 ，有 痑 变 异来源自 由度 变 异组分支 ； 和 聚 成另 外一 支 。 说 明 四川省 内 的 个 居 群有 较近 的 亲 缘 关系， 的 件 进 行 了精确的 控 制， 并 确保 使用 同一 批次 的 负 屯 惶 仪。 选 取 部分样 品 进 行 了重 复 实验 ， 结果表 明 ， 在 最适反 应 条件 下 ， 实验 有较 好 的重 复 性 和 稳 定性 。 最终 利 用 标记有效 地检测出 了川芎 的 遗 传多 样 性 ， 即川芎 遗 传多 样 性 较 高。 对 检测川芎 的 遗 传多 态 性 来说 ， 标记是 一 种非常有效的 工具 。 在人 类 栽 培 过 程中 ，培 育 ，繁 殖 ，地 区 间引 种，都 可 能 严 重的 影 响 到 它 的 遗传结 构 。 但 是，仍 然 能 够 从 劾 嗤 贾 锌闯 觯 桓龅 厍 木尤 虲 ； 珻 和 仍 然 聚 在一 起 ，特 别 是四 川 省 内 的 个 居 群 具 有 更 近的 距离 。这说 明 在同 个 区 域的 居 群 间的 遗传 变异 较 小 ，而居 群 间的 遗传 分 化较 大 ，基 因流随 着 距离 的 增大 呈减 小 趋势。 四川 笱 秢 学 位论 义 通过 分 子 标 记 研 究川芎的 道地 性景 ， 因 此 即使 地 理 距 离很 远 ， 依然表 现 出 较近的 遗传 距 离。距 离最近， 说明 它们 之间 的 遗 传 背 景 差异 很 小。 但 是 有些地 理 分 布 距 离近的 居群， 比 如 虲 、 虲 ， 在图 中 彼此 间 并 没 有表 现 出 最近的 遗 传 关系，而 是 表 现 出 了 与 其它居 群 女 、 更 近的 遗传 距 离， 说明 这 些采自同 个 小区域 的 居 群之间 在遗 传 背 景 上存 在一 定的 差异 ， 这 可能 是 由 于 样品之间 小生 境的 不 同 造 成 的 。 保护 措 施 和 育 种 计 划遗 传多 样 性的 降低 会降低 这个 物 种 对 于生态和 进 化 的 适 应 能力 ， 而栽培 植物 较 易流 失遗 传多 样 性” 。 遗 传多 样 性的 评 估及其在 种 内 的 分 配对 于育 种 和样 性， 但是 川 芎 作为 一个 长 久栽培 的 无 性繁殖 物 种 ， 建 立一个 合 理 的 保护 措 施是 至关 重 要 的 。一个 方 法 是 保持 必要 的 居 群 个体 数 目 。分 布 的 范围 越 广， 越 有利 于遗 传多 样 性的 保护 。人 类的 行为 对 于栽培 过 程 起 到支配作 用， 会严 重 影 响到 川 芎 的 遗 传结 构， 乃至 遗 传多 样 性。 除 了产 量， 我们 更应 该 多 考虑 如 何 保护遗 传多 样 性， 抵御 遗 传均 质 化 。 为 了减 弱药 材市场 的 需求 对 川 芎 栽培 的 影 响， 。 珼 珻 基 因的 川芎 的 遗传变 异有 较 大 的 差 异，居 群 水平 的 多 态性 相对较 高 ，多 态百分率而 居 群 内的 遗传变 异占总变 异的 。 瑄 甂 琣 琌 蟣 瓼 甋 ， 琈 琣 瓽 甁 瓺 ： 甆 現 琑 甕 琓 甁 琙 甕 琣 甆 甋 甋 甅 瓽 瓽 琂 琣 瓵 ： 琂 產 瓵 孙 坤， 张 辉， 陈 纹 苫 麻刚 肿右 糯 昙 茄 芯 恳 弥参 锏 赖匦缘慕 筟 ， 珹 ， 瓹 琣 四 川大 学 顾 七 学 位 论 文第 二章川芎 的研 究 概况及分子 标 记在 药 用植物 研 究 中的应用 生 长 到 翌 年 小 满至 芒种 间收 获， 见图 拇冀 呤 灌 县 缰 菔 崇 庆 送饣 褂 蠮 芎 内酯 、 维 生 素 痛 、 胸 肋 疼痛 、 经 闭 腹痛 、 冠 心 病、 跌 打损 伤 等 。有 效 成 分之 一 ， 属酰胺类 生 物 碱 防 治 急性呼吸 窘迫综 合 征 急性肺 损伤作 为我 国 传 统 的 中药 材 ，由于川 芎 独特的 生 物学 特性和 较高的 医 药 价 值 ，长 期 以来一直吸 引 作 众 多的 学 者 的 研 究 兴 趣。 近 几 十 年来，我 国 学 者 在川 芎 栽培、川 芎 化 学 成分 和川 芎 的 药 理研 究 方 面 都 取 得较多成果，这为开发和 利 用 我国 这一传 统 中药 资 源 奠 定了基 础。 近 年来，随 作 生 物技 术 的 发展 ，对 川 芎 研 究已从不 同领 域 得到 不 断 的 深 入 。 这将进 一步 推 动 川 芎 的 科学 合 理的 开发利 用 。关 于川 芎 的 本草 考 证 已有 多篇 文献 报道 ，但对 川 芎 的 历 史、品 种 和 产 地 在本草 史上 ，对 芎 最 早 形 态 记载为 药 材 形 状 ，南 北朝 本草 经集注 云以栽培 品为 主 ，其药 材 形 状 ，气 味与 今 川芎 接近。 川芎 的 生育 期 姑 缙 冢 捍 孪卵 链文 月 初，川芎 茎 叶逐渐枯 黄 、 凋 落 ，川芎 处 于越冬阶 段 。 虼 笃诖 月 中 旬 至 孪卵 芎 根 茎 干物质积 累多，迅速膨大 。 旮 钠骄 芍 卦 部 抱 住 茎 杆，小叶 对，有柄 。 川芎 叶片 完 全 展开 后 天左 右 丌 始 枯 黄 ，从 叶 涤 甓 嗉 性 、 三 个 月 ，分 别 ，土 温 妫 邓 地 形 地 貌 二 泥 罔， 但以 灰 潮 油 沙 田栽培 的 川芎 产量 高 品 质 好 。灰 潮 油 沙 田熟 化 度高 ， 有 机质 丰富 ， 微 生 物 活 跃 ， 土体 厚 ， 上 重 下轻， 在 孙新 国， 曹 阳 等 “ ”对 用 泱 芎 嗪的 含 量 的 色 谱条件进 行 了 研究 ， 袁 季芳 扔 帽 姿 幔 杭状 迹 核 为流 动相 ， 外 标 法 测 定 阿 魏 酸 含量 。结 果 阿 魏 酸 检 测 线 性 范 围 玂 觳 獠 薄 层色 谱扫描 法 简 单， 快速 ， 操 作方便 ， 但由于 其定 量 分 析的 精密 度不高 ， 一以 杌 兀 然旌 先 芤合 陨约 鸱缤茨 械 拇 芎高 效 毛 细 管电 泳 法 是 近 年来 发 展 迅速 的 一 种 新 的 分 离 分 析 技术 ， 与 滨乜 等 以 鹕 盎 撼逡何 5 缬 窘 橹剩 舛n诵 耐 吹 瓮柚 麝 香 ， 川芎， 元减 少， 改善 神 经 系统 功能障碍， 具 有防治 脑 缺血 性 损害 之 功效”“。 保护 血 脑 屏 障 改善 血 液 流 变性动 脉 粥样 硬化 患者 血 浆 脂 质过 氧化 物 可撸琇 升高是 血 氧自 由川芎嗦 可 以 改善 微 循 环 ， 使其口径 、 流 速、 流 量 、 毛 细 血 管 数 等 方面 有明显 改善 ， 尤以 微 动 脉 最明显 。动 物 实 验 表 明川芎嗦 具 有强 心 、 解 除血 管 平 滑肌痉挛 的作用 ， 可拮 抗肾上 腺 素、 氯 化 钾 与 垂体 后 叶 素引起 的血 管 收缩 与 心 肌 缺血 缺氧， 降低肺 动 脉 高压 。川芎嗪对心 血 管 的药理和 电 生 理作用 与 异 搏 定相 似，有人 认为 该 药可能为 一 种新的“钙拮 抗剂 ”。还有报告该 药有神 经 节阻 断 和 降压 作用 。血 小板 释 放 的 ， 、 组织胺均 可 引起 明显 的血 管 炎 症 反 应和 支 气管 减 轻肺 水 肿 ， 防治 急 性 呼 吸窘 迫综 合 征 和 急 性 肺 损伤川芎嗦 可减 轻 油 酸 所 致肺 毛 细 血 管 内 皮 细 胞肿 胀 ， 使肺 组织表 面 出 血 、 充血 、 炎 症 灶、 梗 死 灶等 病 变减 轻 ， 肺 系数 下 降 ， 减 轻 肺 水 肿 ， 对 预 防效果与 氟 美 松 相 似。“， 并 对中 性 粒 细 胞在肺 内 的聚 集 、 扣押有较强 抑制作用 ， 可防治 急 性 肺 损伤 。“。 旱腎 临床应用 时 ， 血 浆 水 平 的动 态 变化 。结果 ： 冠心 病 组血 浆 含 量 明显 高于 对照 组 谛 牟 橛 葡相 应时 间 段 血 浆 水 平 比明显 下 降 组血 浆 水 平与 组相 应时 间 段血 浆 水 平 比无 明显 变化 。结论 ： 在冠心 病 的发 病 过 程 中 有重要作用 。川芎嗪可 迅 速降 低冠心 病 患者 血 浆 水 平 ， 其作用 强 度 可 能与 血 浆中 川芎嗪浓 度 有关 ， 且 血 药浓 度 与 效应问 存在延迟 关 系。这 种内 源 性 物 质的测 定可能为 确定川芎嗪有效治 疗 血 药浓 度 提供了新的思 路。 泌尿 系统 蟪 槿 】 崭 咕 猜 鲅 # 觳 庋 V蠵 和 峁 褐 瘟谱檠 =琍 和 抗肿 瘤 功 能 。达 和 对内 皮 细胞 通透性 影 响 进 行 研 究 。结 果：中药 对肿 瘤 细胞 与 内 皮 细胞 的 黏 对血 液 流变 学 影 响 简 单序 列 重 复 问 区昙羌际 跏 怯蒢 测 的是两个 涞 囊 欢味 痰腄序 列 多态 性 。 利 用真核 生物基 因组 广泛 存除 了 用于 进 化、 遗 传多样 性分 析外 ，还 广泛 用于 药用植物的鉴定 ”“ 。 是 农 业 上 作 物育 种 学 经常 使 用 的术统 植物分类研究 结 果 吻 合。 术 由于 其提 供的多 态 性 丰 富 、 操作 方 便 快捷、 成 本低 、 安 全 性 好等特 点， 现 已被归 。 “、 姜黄 种 原 植物进 行 的研究 表 明， 技术 可以 为该 类药 材的道 地 性 鉴定 提 供重要 依据 。 此 进 行 扩 增，分 别 扩 增出 醮 条带 。 多 态 性 位 点 比 率 为 ，平表 明 荒 漠 肉苁 蓉和 管 花 肉苁 蓉在居群间 均有 一 定 的 分 化，荒 漠 肉苁 蓉的 遗传多进 化及 分 类与 鉴 定 的 最 根本 的 物 质 基 础 ，但 目 前 绝 大 多 数 药 用 植 物 遗传背 景 的 季节和 繁殖 期 的 影 响。 因 此，分 子标 记 在药 用 植 物 分 子生 物 学 研 究 方面 有 着广阔的 发 展空 间 。 阳川大学碗 学位 论 文， 闫山， 张 秋江， 等 毛 细 管 电泳 法 测定 克 心 痛 滴 丸 中 阿 魏酸 的 含量于 化 鹏， 府 军 ， 李平 升 过 敏性哮 喘 中 血小 板功 能 变 化 及 川芎嗪 对 哮 喘 防 治 作 用 的 研究中 西 医结合 杂 志 ， ：