细胞因子生物学活性检测

细胞因子生物学活性检测 细胞因子水平测定是细胞免疫功能检测的一个重要组成部分 由于许多细胞因子 cDNA 克隆和表达的成功 给细胞因子单克隆抗体制备 生物学功能的鉴定提供必要条件 目前 检测细胞因子水平主要包括两类方法 一是生物学活性的检测 这类方法是利用细胞因子 某一特定的生物学作用所设计的检测方法 如 IL 2 维持活化 T 细胞的增殖 IFN 能保护病 毒对正常细胞的感染 TNF 选择性杀某些肿瘤细胞等 因此敏感性也较高 二是定量的 检测 常用酶联免疫吸附试验 ELISA 如多克隆抗体与单克隆抗体 识别不同表位两种单 克隆抗体的双抗体夹心法 生物学和定量的检测方法各有优缺点 在必要时可同时进行检 测 一 白细胞介素 1 IK 1 生物学活性测定 白细胞介素 1 是一种重要的细胞因子 主要由单核 巨噬细胞产生 IL 1 不仅对多种 免疫活性细胞有重要的调节功能 而且与发热 炎症发生以及某些疾病的病理变化有关 目前对 IL 1 产生水平的检测主要应用生物学活性检测的方法 ConA 刺激小鼠胸腺细胞检测 IL 1 生物学活性 一 原理 小鼠胸腺细胞在丝裂原刺激下表达 IL 1 受体 在有 IL 1 同时存在的条件下 IL 1 可 协同丝裂原促 T 细胞的增殖作用 根据加入 IL 1 后增殖水平 H TdR 掺入率 的增加可计 算出样品中 IL 1 的活性单位 或计算出刺激指数 二 操作步骤 取 6 8 周龄 C57BL16 小鼠 拉颈处死 无菌取胸腺 置不锈钢网筛上 用注射器针蕊研磨成细胞悬液 调整细胞数为 1 5 10 ml 细胞悬液内加入 ConA 使终浓度为 3 g ml 在 96 孔 培养板中加 100 l 1 5 10 细胞 加入不同稀释度待测样品和 IL 1 标准品 100 l 孔 ConA 终浓度为 1 5 g ml 37 CO 孵箱 66h 每孔加 H TdR 0 5 ci 37 CO 孵箱 6h 多头细胞收集仪收获于 9999 型玻璃纤维纸上 烤干 移入液闪瓶中 加适量闪烁液 于液闪仪上测 计数 计算 1 从 IL 1 标准曲线上测得 IL 1 的活性单位 2 也可用刺激指数 SI 表示 实验组 cpm SI 100 对照组 cpm 三 试剂和器材 1 10 FCS RPMI1640 96 孔培养板 CO 孵箱 2 标准 IL 1 ConA 3 H TdR PPO POPOP 二甲苯 4 9999 型玻璃纤维滤纸 细胞收集仪 5 液闪计数仪 四 注意事项 1 不同品系小鼠对 IL 1 的反应性有差异 据国内资料报道以 C57BL 为好 2 不同周龄小鼠胸腺细胞对 ConA 反应性不一 一般选用 6 8 周龄 小于 5 周或大 于 10 周龄小鼠胸腺细胞对 ConA 反应不稳定 3 ConA 促丝裂原作用要进行预试 一般采用亚适剂量 应用 EL 4 CTLL 检测 IL 1 生物学活性 IL 1 是一种十分重要的免疫调节因子 同时也是一种可引起发热和导致多种病理损伤 的重要的内源性致热原和炎症介质 目前 IL 1 检测方法有多种 主要包括 小鼠胸腺细 胞法 黑素瘤细胞增殖抑制法 纤维母细胞法 T 淋巴细胞系法以及 EBV 转化 B 细胞法等 原理 小鼠胸腺瘤细胞系 EL4 的某些亚克隆细胞表面具有高密度 IL 1 受体 在 IL 1 诱导下产生高水平的 IL 2 通过用 IL 2 依赖株 CTLL 2 检测 IL 2 的生物学活性 从 而反映检测样品中 IL 1 的水平 操作步骤 1 用 EL 细胞两步法检测 IL 1 活性 收集处于对数生长期的 EL 细胞 洗涤后 用 1 FCS RPMI1640 重悬细胞 并 调整细胞浓度 2 10 ml 加处 96 孔板中 100 l 孔 加入不同稀释度的 IL 1 或 IL 1 100 l 孔 同时设 1 FCS RPMI 1640 对照 5 CO 37 培养 18 24 小时 按终稀释度为 1 10 20 转入另一块 96 孔板中 用 CTLL 2 检测 IL 2 活性 检测方法见 IL 2 检测 2 用 EL4 细胞一步法检测 IL 1 活性 用 5 FCS RPMI 1640 调整 EL4 细胞浓度至 2 10 ml CTTL 2 浓度至 4 10 ml 加入 96 孔板中 两种细胞各加 50 l 孔 加入不同稀释度的 IL 1 或待测样品 同 时设 EL 和 CTLL 2 细胞对照 置 5 CO 37 培养 24 28 小时后加入 H TdR 0 5 ci 50 l 孔 继续培养 6 8 小时 收集样品 计数 试剂和器材 1 EL 细胞 2 CTLL 2 细胞 3 标准 rIL 1 4 H TdR POPOP PPO 二甲苯 5 玻璃纤维滤纸 细胞收集仪 6 计数仪 7 96 孔板 无菌吸管 滴管 试管及加样器头 8 FCS RPMI 1640 CO 培养箱等 注意事项 1 在一步法检测 IL 1 时 其 EL 细胞浓度不宜超过 1 10 孔 血清终浓度应 5 2 在二步法检测 IL 1 时 其 EL 细胞浓度在 2 10 孔时 犉 d 转移上清稀释度不 宜低于 1 8 其诱导时间应 12 24 小时间为佳 诱导血清浓度应 1 3 在检测经诱导的上清中 IL 1 时 应避免使用 A23187 TPA 和 ConA 等较强的能诱导 EL 细胞产生 IL 2 的诱导剂来刺激 IL 1 的产生 二 白细胞介素 2 IL 2 的生物学活性测定 一 原理 IL 2 主要由活化 T 细胞产生 又为 T 细胞增殖所必需 故称 T 细胞生长因子 T Cell Growth factor TCGF IL 2 产生的水平反映 T 细胞的功能 牪 仅是免疫调节重 要的研究对象 而且与临床多种疾病密切相关 CTLL 是 C57BL 6 来源的 犘 鼠杀伤性 T 淋巴细胞细胞系 由 Gills 1977 年建立 只有在 IL 2 存在的培养基中才能生长 因此可 作为指示细胞来测定待检样品中 IL 2 的水平 除 CTLL 外 丝裂原活化的 T 淋巴母细胞亦 可作为检测 IL 2 活性的指示细胞 二 方法 可根据实验室条件 选用 H TdR 掺入法和 MTT 法 1 H TdR 掺入法 IL 2 依赖的 CTLL 用 10 FCS RPMI1640 洗涤 2 次 每次 1000rpm 5min 除去原培养液中的 IL 2 调整活细胞数 1 10 ml 96 孔平底培养板中每孔加 100 l CTLL 悬液 1 10 孔 加入不同稀释度标准 IL 2 和待测样品 37 CO 孵箱 培养 18 24h 每孔加 H TdR 0 5 ci 50 l 4 6h 用细胞收集仪收获于玻璃纤维纸上 干燥后 移入液闪瓶中 加入 1ml 闪烁液 于液闪仪中测 射线的 cpm 值 计算 举例 将标准 IL 2 不同浓度和待测样品不同稀释度时所获得的 cpm 值作图 犠 轴采用概率 座标 probit 横座标为 Log2 稀释倍数 从 50 的最高 cpm 值画一横线 犛 k 标准和待 检斜线的交点 即可计算出待检样品 IL 2 的活性单位 如标准品 50 最大 cpm 值时为 1u ml 则待测标本 1 4 时为 1u ml 原液则为 4 ml 2 MTT 法 MTT 3 4 5 dimcthylthioazol 2 yl 2 5 diphenyl tetrazolium bromide 四甲 基偶氮唑盐 可作为线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物 当有活细胞存在时 线粒体内琥珀酸脱 氢酶可将淡黄色的 MTT 还原成紫兰色的甲 Formazan 将结晶的甲 溶解释放 可根据 所测的 OD 值反映活细胞的数量和活性 从而推知待检样品中 IL 2 的水平 在掌握良好的 实验条件下 MTT 法的敏感性可接近 H TdR 同位素掺入法 IL 2 依赖的 CTLL 用 10 FCS RPMI1640 洗涤 2 次 每次 1000rpm 5min 除去原培养液中的 IL 2 调整活细胞数 1 2 10 ml 96 孔平底培养板中每孔加 100 l CTLL 悬液 1 2 10 孔 加入不同稀释度标准 IL 2 和待检样品 100 l 孔 每份设 3 个重复孔 CO 孵箱培养 18 24h 每孔加 10 l MTT 5mg ml 溶于 PBS 4h 37 轻轻吸出 150 l 上清 加入 150 l 二甲亚砜 DMSO 或酸性异丙醇 异丙醇溶于 0 04N HCl 溶解 10min 测 OD 值 570nM 三 试剂和器材 1 IL 2 依赖的 CTLL 2 10 FCS RPMI1640 3 H TdR 4 标准 IL 2 5 MTT 酸性异丙醇 二甲亚砜 DMSO 6 PPO POPOP 二甲苯 7 9999 型玻璃纤维滤纸 8 96 孔平底培养板 9 细胞收集仪 10 CO 孵箱 11 液闪计数仪 四 注意事项 1 CTLL 细胞洗涤要充分 但操作必须轻柔 离心速度不宜过高 否则影响细胞的增 殖 2 避免同位素污染 3 加标准 IL 2 或待测样品时 按从低浓度到高浓度顺序加 4 加入 H TdR 最适时机是阴性对照细胞开始全部死亡 5 CTLL 细胞冻存后复苏较困难 用含有丝分裂原条件培养基长期培养容易发生变异 三 白细胞介素 6 IL 6 生物学活性检测 白细胞介素 6 IL 6 是一种具有多重免疫调节功能的细胞因子 HTLV 1 感染的 T 淋巴 母细胞系 单核细胞 血管内皮细胞 成纤维细胞以及某些肿瘤细胞均可产生 IL 6 某些 急性炎症 自身免疫性疾病 淋巴细胞恶性肿瘤 如多发性骨髓瘤 等与病人体内 IL 6 水平 异常增高有关 原理 IL 6 在体外能促进 B 细胞杂交瘤的生长 故又称为杂交瘤生长因子 HGF 小鼠 B 细胞杂交瘤 7TD1 是一株对 IL 6 依赖的细胞系 由 Van Snick 1986 年建立 只有在 IL 6 存在的培养基中才能生长 可以作为指示细胞来测定待检样品中 IL 6 水平 这类 IL 6 依赖的小鼠 B 细胞杂交瘤细胞系还有 MH60 BSF2 B9 等 方法 主要为 H TdR 掺入法 IL 6 依赖的 7TD1 细胞用无 FCS 的 RPMI1640 洗涤 2 次 每次 1000rpm 5min 除去原培养液中的 IL 6 用 10 FCS RPMI1640 调整活细胞数 2 10 ml 96 孔平底培养板中每孔加 100 l 7TD1 悬液 2 10 孔 加入不同稀释度标准 IL 6 和待检样品 100 l 孔 37 5 CO 孵箱培养 48 72h 每孔加 H TdR 0 5 Ci 50 l 10h 用多头细胞收集仪收获于玻璃纤维滤纸上 干燥后移入液闪瓶中 加入 1ml 闪烁液 于液闪仪中测 射线的 cpm 值 计算 1 根据 cpm 值 将能使 7TD1 细胞 H TdR 掺入 cpm 值达到最大值 50 的 IL 6 的活 性定为 1u ml 2 以刺激指数 SI 表示 试剂和器材 1 IL 6 依赖的 7TD1 细胞系 2 10 FCS RPMI1640 及无 FCS 的 RPMI1640 3 H TdR 4 标准 IL 6 5 PPO POPOP 二甲苯 6 9999 型玻璃纤维滤纸 7 96 孔平底培养板 8 多头细胞收集仪 9 CO 孵箱 10 液闪计数仪 注意事项 1 7TD1 细胞洗涤要充分 轻柔 每次弃洗涤上清力求彻底 2 避免同位素污染 3 加样品时 应从低浓度到高浓度顺序加 4 加入 H TdR 最适时机是阴性对照 95 以上死亡 5 为了增加检测方法的敏感性 可采用新复苏 7TD1 细胞 或用 pH4 0 枸椽酸缓冲液 处理培养状态的 7TD1 细胞 四 干扰素 IFN 生物学活性检测 干扰素 IFN 根据其产生细胞不同和理化性质 犐 z 物学特性的差异可分为 干扰素 IFN 干扰素 IFN 和 干扰素 IFN 它们在机体免疫调节 抗病毒感染 中具有重要作用 检测 IFN 的方法主要分为定量测定 常用 ELISA 和生物学活性的检测 后者较为常用 一 原理 干扰素能刺激某些指示细胞 如人羊膜上皮细胞 Wish 株 人喉癌细胞株 Hep 2 以及人 胚肌皮或肺单层细胞 产生抗病毒蛋白 从而使细胞免受水疱性口炎病毒 VSV 的攻击 根 据待测样品不同稀释度的保护能力 计算出干扰素生物学活性单位 二 操作步骤 96 孔培养板中加入不同稀释度的 IFN 和标准 IFN 每个稀释度设 3 孔 每孔 50 l 病毒对照不加 IFN 每孔加入 100 l 1 5 2 10 ml Wish 或 Hep 2 细胞悬液 37 CO 孵箱培养 6 12h 使细胞贴壁为单层 每孔加入 50 l 含 100 个 TCID50 VSV 细胞对照不加病毒液 根据细胞病变状态 终止培养前 3 4h 加入 5mg ml MTT 15 L 孔 加入适量生理盐水 用滴管轻轻吹吸 弃去悬浮病变细胞和死细胞 200 l 孔 二甲亚砜 DMSO 作用 10min 测 OD 570nm 表示活细胞中含甲 的量 也可用刚果红摄入法 结晶紫染色法 测定 IFN 对活细胞的保护水平 计算 以保护半数 50 细胞免受病毒损害的最高干扰素稀释度为 1 个干扰素活性单位 也 可从标准曲线中求得待测样品的 IFN 活性单位 三 试剂和器材 1 VSV 2 WISH HeP 2 细胞株或人胚肌皮或肺单层培养物 3 MTT 3 4 5 二甲噻唑 2 yl 2 5 2 苯基 四唑溴盐 二甲亚砜 DMSO 刚果红 结晶紫等 4 10 FCS RPMI1640 培养板 培养瓶 CO 孵箱 超净台 酶联检测仪 四 注意事项 1 实验时先加 IFN 后加指示细胞 以使细胞均匀分布于培养板底部 2 本法对天然培养上清或重组 IFN IFN 和 IFN 均可检测其活性单位 五 肿瘤坏死因子 TNF 生物学活性测定 肿瘤坏死因子 TNF 是一种主要由单核 吞噬细胞产生的单核因子 不仅具有选择 性地杀伤某些肿瘤细胞 而且有多种免疫调节作用 其检测方法主要包括生物学活性测定 和免疫学检测方法 其中细胞毒生物学检测方法敏感性较高 最为常用 免疫学检测方法 包括酶联免疫吸附试验 ELISA 和放射免疫测定法 一 原理 TNF 受体广泛地分布于多种肿瘤细胞和血细胞 根据 TNF 与相应靶细胞结合后引 起不同的生物学效应 建立了多种检测 TNF 生物学活性方法 某些肿瘤细胞膜表面的 TNF 受体与 TNF 结合后 可导致这些肿瘤细胞的死亡 可通过检测对肿瘤细胞的杀伤 能力 来反映 TNF 的生物学活性 若这种肿瘤细胞先用 3H TdR 标记 则被杀伤后 H TdR 释放至细胞外 牽 I 通过测定肿瘤细胞释放 H TdR 的量来反映 TNF 的杀伤活性 二 操作步骤 0 25 胰蛋白酶消化处于对数生长期的 L929 细胞 用 RPMI1640 洗涤细胞后 调整细胞浓度至 2 10 ml 加入 H TdR 20 ci ml 置 37 5 CO 培养箱中 2 3h 摇动 1 次 30min 用 RPMI1640 洗涤 2 次 800rpm 5min 次 调整细胞浓度至 2 3 10 ml 后 加入 96 孔 培养板中 100 l 孔 加入不同稀释度的待测样本 设三个重复孔 加入放线菌素 D 使放线菌素 D 最终浓度至 1 g ml 用时设放线菌素 完全培基阴性对照和 rTNF 标准 品阳性对照 37 5 CO 培养中 24h 加入