烟草中NAC类转录因子基因的克隆与分析.doc

河南农业大学硕士学位论文烟草中NAC类转录因子基因的克隆与分析姓名：王菲菲申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：刘卫群201105 表 达 模 式 表 明 这两个 基 因表 达 量 下 降。 在研究生三年 的时 间里 ，我的成长 离 不开 方方面 面 的关爱 和帮 助。 期 间，有幸聆听 了 河 南 农业 大 学 生命 科 学 学 院 的诸 位专 家 学 者 的教 诲，从 他 们 身 上汲取 学 科 知识 与 人 生智 慧 ； 在整 个 实 验 过 程 中 ，郭宏 祥 副教 授，石 永 春 博 士 给予大 力 支持 和 热 情 帮 助，为我顺 利 完 成学 业 提 供 了 很 大 帮 助，在此向他们 送 上我最诚挚的感谢和 祝 福。 菌等 各 种 生 物 和非生 物 胁 迫 ， 通 过 一系列 的 信 号传 递， 激 发转录 因 子 的 产 生 ， 转录 因 子 与相应的 顺 式作 用 元 件 结 合 ， 激 活下 游逆 境相关 基因 的 表达 ， 最 后 通 过 基因 产 物 的 作 用 对 外界 信号在生 理生 化 等 方 面 作 出 适 合 的 调 节反应。 由 此 可 见 ， 转录 因 子 在基因 的 表达 调 控 中 起 关 键 端 则存在高 度差异， 被 认 为 是 转录 激 活区圳 钔 。 调 节植 物 生 长 发育 看 永 苯 分 蟹掷 胫罥 类 转 录因子 ，该 牧 呀 猓 庖 步 徊街 鱐 蜃B 己 蟮 骺 氐 闹匾 P浴 甿 ， 的 影响 烟碱 合 成的胁 迫因素胁 迫因素 ，如 伤 害、干 旱 、 不 均 衡 等 和诸 多生 物 因素 如 食 草 类 动物 啃食 、昆 虫叮 咬 、 材料 、 试剂与 仪 器大 肠 杆 菌 、 甌 牵珺 挥 舛 縋 仪 ， 狪 ； 凝 胶 成像 系 统， ； 高速 冷 冻 离 心 实验 方 法 躌 的提 取清转 移 到 另 一 离 心 管 中，小 心 不 能抽到 蛋白 和有 机 物。 尤氲忍寤 囊 毂 汲 恋 鞷 ，室温 下 静置 分钟 。 离 心 分钟 。 用 电 泳 检测 柿 浚 涎 縧此 。 第一链 的制备 软件 设 计 荧光 定 疌 疓 隩 疓 疉 疌 疉 疓 滩 軳基 因 的 克 隆 。列 。以烟 草 根 尖 组织 总 姆 醋 B疾 颿D 澹蠵 扩增在 离心 管中加入 以下组分： 正 转化操 作过 程 ： 猤 痬 ， 并 让 其移至 离 心管中 ， 条 件下 摇菌 。 痬 湃 冰 箱 ，使 蓝白 斑 颜 色 分 明 。 基因 从 绦 蛲 步 骤。 滩 莞 庾 橹 躌 反 转 录产 物 杂 交 检 测 湫 郧碇 悄 旱 缬 痉掷隦 兹 湫 越旱 缬 最 后 用 焦 碳 酸二 乙 酯 的 水 溶 液 彻 底清洗 。 ， 宸 永 】 。 变性 ， 期间 可 将电泳缓 冲 液 混合 一 下 。外 灯 下 照相 。 D蚏 固定叠 略 小 于滤纸 的 吸水 纸 置 于滤纸 上 ， 在 纸 上 平 放 一 玻璃板， 然后 在 玻璃板上 压一 重物 ， 室温下 转 膜 或 过 夜 。 预杂 交 、 杂 交 和 显 色 ， 其 间 缓 慢摇 动 。 吸 取 湫 缘 奶 秸爰 拥郊涸 鹊 脑咏灰 褐校 浞只煸 龋 灰 4灯鹌 泡 沫可 引起 、 用 显色 底 物避 光 显色 ， 在 此 反应 过 程中不 可 摇动 。用 蚗 在 大 肠 杆 菌中的 诱 导 表 达取 未 诱 导 培 养 与 诱 导 培 养 换 位 置 ，具体 方 法 同上 。 菌液 转 含 尤 农 杆菌 惺 芴 赴 戏 胖 ； 涂 平 板 ，含 羧 参 锉泶 镌 靥 逯柿 呐 司 洌 又 种 羖 含 有用 。 艵 根培养基 上 诱 导生 根，获 得具 有 卡 那 霉 素 抗性 的 转基 因 植株。 转基 因 烟 草 分 子 检 测 芤海 。 离心 厥 誅 沉 淀 。 尤 倍体积 的 掖 家 放 置 掖 记 逑闯 恋砹酱 危 蹈 珊 笕 苡 谑柿 康 拿鹁 鷇 中 。 焊 ： 茎 ： 阂 ： 翰 淮 蚨 讨 悍直 鹞4蚨 、 、 烟 株 明 它 们的扩增 产 物都是特异 的， 没 有 非 特异 扩增产 物或 引 物二 聚 体。 觥 瘛 觥 蔻 卦 樗 股 舅 谩 畊 田 咖 捌熊曩毒 瞳 谝 籓 農皇 枷 叫沣序图 基 因 融 解 曲 线 ， “； ， 知 抽 押 州 ” 鰈， 瘛 觯 癪 时 岫 柚枷 叫 觥 馩 啊 呐 圳 科 哺 嚣，图 基 因 融 解 曲 线 一， ， 一；毯图 基 因 融 解 曲 线 十；，； ； 尹 猧 戮 恻蜊懈安霉引燃囊 一：测川薏巨女 捍 蚨 烟草 的克 隆 的 片 段 。 徊罚 瑅 怀 的 构建电 子 克隆 序 列一 致 。 篋 产 物 质 粒兰王互堇堇基 粥 畖。兀 鉭 嬷 盙 盇 鱼 庇鉍 兀 丁 点直直 灿 蜛 盙 鉉 的 核 苷酸 序 列 和 预 测的 氨 基 酸 序 列 烟草 的序 列分析烟草 的 全 长 ， 由完整的开 放 性 阅 读 框 架 的 撕 ，类在 一起。将 数 据库 邢低 辰 治 图 琋 隢 亲 缘 关系 较 近 。簇 傲郇 珑 ： 嚣 磊 看 二 二 晃 錴 ； 二 憾 郝 鼂 ： 三 三 二 ； 二 五 二 ： 二 ； 番 茄 矮 牵丰 确 ， 洳 黑 色背景 表 示 完全 一样 的氨 基 酸 序 列 图 烟草 甊 肫 渌麼 蛋 白的系 统进 化 树 分析 ：刚 飞姚蛋 白的基 本 结 构。 镢图 的组 织特异 性 分 析 輀 喽 圆 淮 蛳畹 难 讨 辏 抵 蠳 谋 泶锼 绞 墙 档偷模 蚨 灾 岣撸 婧 蟮 和 蚄 拗 菩 阅谇忻付詐 一 重组 质 粒 和 原核 表达 载 体 的原核 表达 鏊瓣 搴 头匆 灞 泶 镌 靥 錺 一 构 建 司 鶳 检测 豳 检测的 表达 量 都 下 降。 阂 吧 椭 仓 ： 反义 转基因 植株 ， 编 码 霭被 幔 哂 蠳 转 录 因 子 家 族 典 型的 保守结构域 ， 富 含 诖 蛳 后表 达水 平 上 升 ， 甶 基 于 表 达序列标 签 略， 是 近 年 来发展 起来 的 一 门 快 速克 隆基 因的 新 技 术 ， 其技 术 核 心 是 利用生物 信 息 学技 术 组装 延 伸 序列， 获得 基 因的 部分 乃 至 全 长 序列。 电 子克 隆技 术 具有 快 捷、 高 效 、简便 等 优 点 ， 为后续 基 因功 能 研究提 供了 重 要 线索 ， 在这 方面已有 成 功 的 报 道【 】。后显 著 减少 蛳钋 柿 衔 捶 。 同时， 在构 建 的 烟草 打 根、 荚 果 和 未 成 熟 种子中 的 表 达量 高 ， 在成 熟 叶的 表 达较 弱 ， 在叶片 表 达量 较 高 。 从 烟草 根系分 离获 得 ， 为了 解 该 基 因在烟 草 根系中 的 表 达与 其它 组织 中 是 否 有 差 觳庖 淮 的 动态 变化 ， 发现 在打顶 后 哂 邢 灾 浠 庥 隨 等 【 】对烟株烟草 根系中 的 鸟 氨 酸脱羧 酶 種 甲基 转移酶 蚇 甲基 腐 胺 氧 化 酶 】 刘 强 ，张 贵友 ，陈 受宜 植 物转录 因