荧光偏振与荧光偏振免疫分析法.doc

化学化工学院 仪器分析荧光偏振与荧光偏振免疫分析法【摘要】本文简单介绍了荧光偏振原理和荧光偏振免疫分析（FPIA）的原理，并就荧光偏振及FPIA在环境、食品安全、医疗卫生和蛋白质研究等方面的实际应用进行了简单介绍和举例。【关键词】荧光偏振 免疫分析 应用从1852年，Stokes首次提出“荧光（fluorescence）”一词，人们对荧光现象的研究就不断深入，并发展出了荧光分析技术，荧光分析是指利用一些物质被电磁辐射激发后产生反映该物质特性的荧光而对该物质进行定性定量分析的方法。随着相关理论和仪器的发展，荧光分析的手段和技术水平也不断发展，现在荧光分析以其高灵敏度、高选择性、低样品用量、方法简便等诸多优点，在化学、医药、环境、信息、生命科学等领域被人们广泛使用。基于荧光偏振发展的荧光偏振免疫分析法是荧光分析中一个重要的组成部分。一、 荧光偏振原理荧光偏振的原理最初是1920年由Perrin建立的。溶液中荧光分子受偏振光激发，如激发时分子保持静止，则发射的荧光仍有偏振性，且如分子分子旋转或翻转，发射荧光的偏振平面会不同于激发光偏振平面。虽然实际测量常得消偏振的荧光，但荧光偏振技术有着重要应用1。荧光偏振光强度P定义为：P=（I-I）/（I+I）其中，I和I表示荧光子被激发后，发射光在垂直和水平方向上的强度。对于荧光偏振仪器，检测到的荧光强度：P=（Ivv-GIvh）/（Ivv+GIvh）式中，下标分别代表起偏器和检偏器方向，v为垂直方向，h为水平方向，G为校正因子，G=Ihv/Ihh。荧光偏振光强度P与测定体系中各因素的关系可用Perrin方程表示:（1/P-1/3）=1/P0+（1/P0+1/3）（RT/V）(/)其中，P0为极限荧光偏振光强度，R为气体常数，T为绝对温度，V为摩尔分子体积，为荧光寿命，为溶液的粘度。由上式知当溶液的温度和粘度都固定时，P值主要取决于荧光子的分子体积。荧光偏振光强度与荧光物质受激发时分子转动速度成反比，所以小分子物质在溶液中旋转速度快，P值较小；大分子物质在溶液中旋转速度较慢，P值较大2。二、 荧光偏振免疫技术原理荧光偏振免疫方法(fluorescence polarization immunoassay, FPIA)依据荧光标记抗原和其抗原抗体结合物之间荧光偏振程度的差异，用竞争性方法直接测量溶液中小分子的含量2。在反应体系内加入未标记抗原（待测抗原）和一定量用荧光素标记的小分子抗原，使二者与特异性大分子抗体竞争结合。当待测抗原浓度高时，大部分抗体被其结合，荧光素标记的抗原多呈游离的小分子状态，小分子在液相中转动速度较快，测量到的荧光偏振程度也较低。反之，大部分荧光素标记抗原与抗体结合，形成大分子的抗原抗体复合物，检测到的荧光偏振程度也较高。荧光偏振程度与待测抗原浓度呈反比关系，利用这一原理，可以精确地得知样品中待测抗原的相应含量。FPIA还可以对抗体进行检测。三、 荧光偏振与荧光免疫偏振技术的应用由相关原理可以看出，荧光偏振和FPIA技术很适合研究分子间相互作用，可用于评价pH、温度、盐浓度等对分子结合的影响，同时这项技术低毒、灵敏、快速、样品可重复利用等优势，被广泛应用于环境监测、食品安全监督、疾病诊疗和化学、生命科学的相关分析中。1、 环境监测丁草胺FPIA在环境监测中有着重要应用，具有高灵敏度，高精确度，检验过程简单等优势。例如，丁草胺，即2-氯-N-(2,6-二乙基苯基)-N-(丁氧甲基)乙酰胺，是水稻等农作物种植中常用的高效除草剂，丁草胺进入水体会造成污染，尤其对鱼类呈高毒性，所以对丁草胺的检测十分重要。而传统的各种检测技术都存在灵敏度不佳、耗时、成本高等缺点，相比下FPIA则显示出巨大优势。Hongtao Lei等人用荧光标记物3-(2-(butoxymethyl)(2,6-diethylphenyl)amino)-2-oxoethyl- thio)-N-(6-(3-(3,6-dihydroxy-3-oxo-3H-spiroisobenzofuran-1,9-xanthene-5-y1) thioureido)hexylpropanamide (Tracer C) 等对丁草胺进行荧光偏振免疫分析，取得了良好结果3。2、 食品安全ORB在食品安全检验方面，FPIA技术也展示了同样的优势：灵敏、快速。奥比沙星（Orbifloxacin, ORB），即1-环丙基-5,6,8-三氟-7-(顺式-3,5-二甲基哌嗪)-1,4-二氢-4-氧代喹啉-3-羧酸，是第三代喹诺酮类抗菌药物，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有较好的抑制作用，一直被作为重要的兽药而广泛使用，在食品中残留的ORB的检测也显得十分必要。Tiejun Mi， Xiao Liang等人使用荧光标记物LOM-BDF对牛奶中的奥比沙星进行FPIA分析，检测限可达3.9ng/ml，IC50达24.5ng/ml（Z=0.81）4。另外，粮食及其制品中的真菌霉素也可以使用FPIA进行检验，尤其适合大量粮食样品的快速检验。但FPIA在这方面的进一步应用还需要解决许多问题，比如相比酶联免疫分析（enzymelink immunosorbent assay，ELISA）等传统技术，其灵敏度仍有待提高，需要发展专门的仪器和试剂等，但FPIA技术展现出的前景是十分乐观的5。在其它农药、兽药及一些小分子，如阿特拉津、本菌灵等的检验中FPIA发挥着巨大作用，有实力发展为该领域的主要技术手段之一6。3、 医疗卫生医疗诊断中常常需要对生物样本中某一或某几个物质进行定性或定量的检测，FPIA技术便可大显身手。例如，凝血酶的检测在临床和基础研究中都有重要意义。蔡晓坤，徐顺清等人使用荧光标记的凝血酶配适分子G-15D，在37，PBS缓冲液条件下对人血样本中的凝血酶进行了直接检测，阈值可达0.09IU/ml7。对药物在人体中代谢的研究也可以用到FPIA技术。Erik Mannaert和Paul Daenens就利用FPIA检测尿液样本中N-Desmethylzopiclone含量，在相关实验条件下，检测限可至30ng/ml，展现了实际应用的广阔前景8。4、 蛋白质研究前文已经提到荧光偏振及FPIA技术适合研究分子间相互作用，由此，在对蛋白质的结构、运动、变性，以及蛋白质小分子抑制剂和相关药物靶点筛选等进行研究的过程中，人们也将目光投向这一检测方法9、10。荧光偏振与荧光偏振免疫技术是既成熟又有着巨大发展空间的检测技术，FPIA技术有其灵敏、快速、样品量少等优点，但在实际应用中仍有荧光标记物不易找、仪器要求较高等诸多问题。这也体现了在仪器分析中，没有哪一种方法是完美和万能的，根据实际需要选择合适手段进行检测才能扬长避短，得到良好的实验结果。而不断改进、完善已有技术，发展新的技术是仪器分析领域始终不变的主题。【参考文献】1许金钩，王本尊.荧光分析法M.3版.北京科学出版社，2006.2朱广华，郑洪，鞠先.荧光偏振免疫分析技术的研究进展J.分析化学,2004 32(1):102-106.3Hongtao Lei, Gang Xue. Fluorescence polariza as a tool for the detection of a widely used herbicide, butachlor, in polluted watersJ.Analytical Methods，2011,3,2334.4Tiejun Mi，Xiao Liang. Development and optimization of a fluorescence polarization immunoassay for orbifloxacin in milkJ.Analytical Methods，2014,6,3849.5王战辉，米铁军，沈建忠.荧光偏振免疫分析检测粮食及其制品中的真菌毒素研究进展J.中国农业科学，2012，45(23):4862-4872.6王战辉，张素霞，沈建忠，Sergei A Eremin.荧光偏振免疫分析在农药和兽药残留检测中的研究进展J.光谱学与光谱分析，2007 27(11):2299-2306.7蔡晓坤，徐顺清，张志仁，刘志伟，鲁文红.一种基于适配分子的偏振荧光检测法J.分析化学，2002 30(3):352-354.8Erik Mannaert，Paul Daenens. Development of a Fluorescence Polarization Immunoassay for the Routine Detection of N-Desmethylzopiclone in Urine Samples. Analyst，1996，121，857.9Tina L.Mann，Ulrich J.Krull. Fluorescence polarization spectroscopy in prote