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Western Blotting原理：与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。一、蛋白样品制备实验器材及试剂：两个泡沫盒（装入碎冰）；提前灭菌的大中小三种枪头；微量移液器；4预冷的PBS液；裂解液及Ripa；废液缸；起码3套根据干预培养孔顺序标记的EP管；离心机（预先调温到4）1、若蛋白需保持活性，那么全部操作需在冰上进行，并且在裂解液中加入蛋白酶抑制剂PMSF，抑制丝氨酸蛋白酶和巯基蛋白酶，防止蛋白降解。2、如果需要检测磷酸化的蛋白，那么裂解液中必须加入磷酸酶抑制剂。 组织中总蛋白的提取： 1、将少量组织块置于12ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。 2、加400ul单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中进行匀浆。然后置于冰上。 3、几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。 4、裂解30min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4下13,200rpm离心5min，取上清分装于0.6mlEP管中并置于-20保存。 单层贴壁细胞总蛋白的提取： 1、吸除培养液，并将皿倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将皿直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 2、将10cm皿或6孔或12孔培养板置于冰上略倾斜，每皿细胞加3ml 4预冷的PBS（0.01M pH7.27.3）清洗3次，平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液，最后1次需要彻底吸净剩余PBS，倒扣在吸水纸上1min，更换小枪头吸除壁上残留的PBS（因为其内含有蛋白，影响细胞蛋白定量）3、加PBS1ml，用白色长柄刷子（蓝色酒精桶里拿出，先用自来水水冲洗再用5水冲洗）将细胞刮下，转入1.5mlEP管中，置于碎冰中。4、预冷离心机：调温至4，盖好盖子，按键“Fast Temp”，直至降温至4。5、取出1.5mlEP管，放入预冷的离心机中10,000rpm2min6、吸弃上清，再放入4离心机中离心10,000rpm1min，小枪头吸弃上清，放入冰中。7、向1.5mlEP管中加入180l无PMSF的蛋白裂解液+20l10mM的PMSF（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合，混合后终浓度刚好可以稀释到1mM，若其它浓度的PMSF则体系不是这样，同样稀释到1mM即可），平面VORTEX震荡混匀，然后放入碎冰中裂解30min，每隔10min取出于平面VORTEX上最大转速震荡56次，再放入冰中，至均匀透明8、于4下13,200rpm离心20min。（提前开离心机预冷）9、提取上清蛋白提取液至相应标记的0.6mlEP管中（每管45l左右），-80保存 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取： 由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取： 1、将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min。 2、弃上清，加入4ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。 3、用枪洗干上清后，加100ul裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。4、将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4、12000rpm离心5min，取上清分装于0.6mlEP管中并置于-20保存。 二、蛋白定量 1、从-80冰箱中取出待测蛋白样本放入碎冰中2、取BSA标准品(2mg/ml)，在1.5mlEP管中用0.15 mol/L NaCl配置0.25g/l、0.5g/l 、1g/l 、2g/l的标准品3、取出BCA试剂盒，按每孔加200l A+ B混合液来计算所需A 和B的量。制做标准曲线需要5个标准蛋白孔，若样本数为N，则所需A+B混合液体积为200l /孔（5+N+1）（多配一个孔防损失），再按大瓶（A）：小瓶（B）=49：1的比例算出所需A液和B液的体积。按算好的体积量将A液和B液分别加入1.5mlEP管中，震荡混匀(如果二者体积大于1.5ml则放入白色长离心管中吹打混匀)，插入碎冰中。4、加样：在酶标板的5+N孔中依次每孔加入200l A+ B混合液，再在前5孔依次加入不同浓度0（代表不加，即空白孔）、0.25g/l、0.5g/l 、1g/l 、2g/l的标准品10l，空白孔加10l的16水；后面的N孔中依次每孔加10l稀释的样本（样本取2l加8l16水稀释）5、将酶标板放于37孵箱中孵育30分钟，酶标仪570nm读数，记录实验数据，输入EXCEL表中，绘出标准曲线并计算样本蛋白浓度选中标准品吸光度和相应蛋白浓度值-插入图表-XY散点图-下一步-下一步-下一步-完成；选中一个点，右键点击“添加趋势线”-“选项”中选显示公式，显示R平方值-确定 R平方值0.99较好6、计算各孔的蛋白浓度并推算至冻存标本的蛋白浓度（5，2l稀释至10l，稀释了5倍），一个浓度算出后可选中该框并将鼠标移动至边框右侧，当出现“”时下拉即得其它蛋白浓度，然后算出加入20g、40g、80g蛋白所需要的冻存蛋白液体量，有助于跑Western蛋白量的控制三、制备电泳凝胶实验器材及试剂：橡皮手套（DB有神经毒性）；装EP管的漂浮板；微量移液器；预先灭菌的大中小型号枪头；16水；预先清洗好玻板并晾干；梳子(一定要与玻板配套，如果玻板1.5mm则梳子也要用1.5mm的)；胶条；1M Tris-HCl(ph 6.8)；1.5M Tris-HCl(ph 8.8)；30AB(双丙烯酰胺)；10% SDS；10% AP(过硫酸胺，最好现配)；TEMED注：TEMED是促凝剂最后加根据蛋白上样量决定玻板大小（30ul 1.5mm）根据蛋白分子量大小决定分离胶浓度（胶浓度越高对分子量小的蛋白区分越好，10的分离胶多用），一般地，6的凝胶可用于57212kDa的SDS变性蛋白质分子的分离，8用于25200kDa，10用15100kDa，12用于1070kDa，15用于1245kDa。步骤：1、准备好配浓缩胶和分离胶的50ml离心管。用过的50ml离心管可挖除里面的胶先用自来水冲洗再用16水冲洗，冲洗包括盖子。2、清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗洁精轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用16水冲洗干净后立在烤箱中烘干。3、将玻璃板（小板向外）放入绿色夹板中对齐后夹紧（要同时按住两头再夹上夹子），然后垂直卡在放有胶条的白色架子上准备灌胶。注意：在上紧螺丝之前，必须确保凝胶玻璃板与胶条上部的表面平滑紧密地接触，有细微的不匹配就会导致凝胶的渗漏。4、按需要配好足量分离胶，（1块板10ml；2块板20ml），最后加AP和TEMED，加入后立即水平摇匀即可灌胶。凝胶很快会聚合，操作速度要快。灌胶时，可用1ml枪吸取分离胶沿玻板一边边缘放出，尽量不要留有气泡，待胶面升到绿线下高度时即可，多余的胶弃不用。然后胶上加16水封，速度要慢，沿一边边缘加，直至加满，水平轻摇，这使凝胶表面变得平整。5、当水和胶之间有一条折光线时，说明胶已凝了（约需20min左右，此时间可以用来煮沸电饭煲中的水；蛋白变性；配置电泳缓冲液）。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸吸干胶上未倒掉的水，注意轻轻放到胶面上。6、按需要配好足量浓缩胶（一般配3ml）,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。沿玻璃板一边边缘灌下，不要使胶中产生气泡，将剩余空间灌满浓缩胶然后立即将梳子插入浓缩胶中(一定要与玻板配套，如果玻板1.5mm则梳子也要用1.5mm的)，插梳子时要使梳子保持水平（大孔有10个上样孔可用，每孔最大上样体积40l，小孔有15个上样孔可用，每孔最大上样体积25l）。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶（其实说经常有点过了，补1-2次就行了，不补胶问题也不大）。一般50ml离心管中剩余的浓缩胶凝固了则上样的浓缩胶也就凝固了。 7、测完蛋白含量后，计算含20-50g蛋白（根据自己的实验需要进行选择，没有固定的量）的溶液体积即为上样蛋白体积。上样总体积一般30l，取200l的EP管中，加入loading buffer，再加入上样蛋白，不足30l的用16水补足（最好用1loading buffer补足），然后于VORTEX上震荡数秒混匀，再在离心机上离心数秒，以使管壁上的液体流下。将混匀好的上样EP管于沸水中煮5-10min使蛋白变性，变性好后放于碎冰中（本人心得：可以使用PCR仪进行变性，加快速度，这样就不用将水煮沸了，同时在水中煮蛋白样品有下面弊端：1.EP管容易炸开，样品丢失、2.容易进水，使样品体积增加，超过电泳最大上样量）。2loading buffer就是要用同体积的buffer和样品混合；5loading buffer就是要buffer用1样品用4，即最终loading buffer都稀释为1工作浓度使用若Nloading buffer则上样体积为M(N的整数倍)，此体积中loading buffer体积为M(1/N)四、电泳实验器材及试剂：电泳装置；1running buffer(电泳液) 500ml；16水；protein marker（Fermentas 0671）；电磁力搅拌机步骤：1、安装电泳装置：将制备好胶的玻板固定于电泳架上（小板向槽内，大板向槽外），若配一块胶则电极板另一端需加一块白色塑料板，然后加制胶板和白色塑料板（有字面向外）一块插进电极板的两侧再一起放入电泳架中夹紧（要同时按住两头再夹上夹子），最后一起放入电泳槽中2、将一定体积的电泳缓冲液加入电泳槽中，先中间加满，从中间溢向两侧，两侧要比中间液面低，加至两侧液面达到槽内小板的高度即可停止，观察中间槽的液面是否会下降以判断有没有漏，若漏的利害则拿出电泳架重新安装一下各板，再加入一定体积的电泳缓冲液观察直至不漏或少漏3、加好电泳缓冲液后，拔去梳子上样。第一道加marker（5ul）其后再加上样蛋白，空白孔可加1loading buffer（使条带平直）。3、插入电极（黑对黑，红对红），打开电源，开始电泳。电泳可选择恒压（浓缩胶/分离胶：80V/100120V），恒流（一块胶；20/15mA；两块胶：30/20mA，跑过浓缩胶后一般即marker分开后换20mA，浓缩胶30mA约30min,分离胶20mA约1h）。电泳一般在1.5h左右（此时间可用来配转膜液和甲醇浸膜液），一般要让目的条带跑出分离范围即可，但注意电泳线不要跑出分离胶之外。（注意在电泳时在-20冰箱中冻存冰盒，以便在转膜时使用）电泳中常出现的一些现象： 条带呈笑脸状，原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好。 条带呈皱眉状，可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。拖尾：样品溶解不好。纹理（纵向条纹）：样品中含有不溶性颗粒。条带偏斜：电极不平衡或者加样位置偏斜。条带两边扩散：加样量过多。五、转膜实验器材及试剂：转膜装置；1transfer buffer(电泳液)800ml+甲醇200ml=1000ml（用专用的1000 ml的量筒配，配好后用薄膜手套套起防挥发）；冰盒；电磁力搅拌机步骤：1、拿出搪瓷盘，将转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、24层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上，注：个人感觉就垫1张滤纸也没问题）放入搪瓷盘里，倒入转膜液浸泡。2、剥胶：要先将小玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬（应该边撬边用流水缓缓冲洗）。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，胶很易裂，要用巧劲）除去小玻璃板后，将浓缩胶，蓝色电泳线以下及mark对面的无蛋白边缘轻轻刮去，要避免把分离胶刮破，裁好的胶条放入转膜缓冲液平衡1530min。3、膜处理：裁好与胶条同样大小的PVDF膜，剪去膜的右上角，标记为正面。然后将膜放入甲醇中平衡510min，保证膜浸透，再转入转膜缓冲液中平衡510min。剪膜时手不能是湿的，不能用手直接碰，一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。4、转膜：转膜夹从下至上依次按黑面夹、海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜（与凝胶接触的膜面必须为标右上角的正面）、滤纸、海绵、白面夹的顺序放好，每一步都赶走气泡，然后夹好夹子，放入转膜槽中，要使夹的黑面对槽的负极（黑面），夹的白面紧对对槽的正极（红面），而不是夹的白面隔一孔再对槽的正极。然后将整个转膜槽放入白色槽内，在转膜槽的黑端紧挨转膜槽放一冰盒，倒入转膜液，勿倒入冰盒中，倒到不超过冰盒边缘，冰盒浮起为止，盖上电极（红对红黑对黑），将整个转膜装置包埋于大碎冰泡沫盒中。接通电源,恒流250mA，转移2h（根据目标蛋白分子量决定）。目标蛋白分子大小(kDa)胶浓度转移时间(h)80-1408%1.5-2.025-80101.515-40120.7520150.5六、免疫反应实验器材及试剂：摇床；静音混合器；1TBST(1000mlTBS+1mlTween20)；5脱脂牛奶(2.5g脱脂奶粉+TBST配成50ml)或5BSA；一抗；二抗步骤：1、封闭：在小方格塑料盒中加入封闭液（5脱脂牛奶）约25ml，取出PVDF膜，将膜放入塑料盒中，保证膜的正面全部浸入液体中（正面右上方剪角标记），于脱色摇床上平稳低速摇动1小时（室温）；2、一抗孵育：在50ml离心管中按合适比例用5脱脂牛奶稀释一抗（一次配5ml即可），然后放入PVDF膜，保证膜的正面全部浸入稀释的一抗中，4于静音混合器上平稳摇动过夜或室温2小时。1：1000是5ml牛奶+5l一抗；b-actin一抗按1：10000是5ml牛奶+0.5l一抗）。3、洗膜：加1TBST约15ml在室温下脱色摇床上高速摇动洗膜10min3次；4、二抗孵育：在50ml离心管中按合适比例用5脱脂牛奶稀释HRP(辣根过氧化物酶)偶联的二抗（按合适稀释比例用5脱脂牛奶或1TBST稀释，1：2000是5ml牛奶+2.5l二抗），然后将膜放入50ml离心管中，保证膜的正面全部浸入液体中（正面右上方剪角标记），室温于静音混合器上平稳摇动1小时；二抗需根据一抗进行选择，如一抗是鼠抗，则二抗也应该是鼠抗，兔二抗1：5000