天冬氨酸生产工艺的研究进展.doc

天冬氨酸生产工艺的研究进展发酵科技通讯第41卷天冬氨酸生产工艺的研究进展冯志彬殷日彩米阳孙雨(鲁东大学生命科学学院烟台264025)摘要:天冬氨酸是20种蛋白质氨基酸之一,和谷氨酸同属酸性氨基酸,常用于氨基酸输液和营养增补剂,又是甜味剂天冬甜素的合成原料,在医药,食品及化工合成领域具有广泛的应用前景.本文概述了天冬氨酸的研究概况,主要对天冬氨酸的生产方法7L_v_艺进展进行了综述.关键词:天冬氨酸酶法合成生物拆分天冬氨酸(Asparticacid)又称氨基丁二酸,是构成机体蛋白质的主要氨基酸之一.结构式为:HOOCCH2一CH(NH2)一COOH,分子量133.10.它有两种旋光异构体:D型和L型.通常所说的天冬氨酸是指等量的D型和L型的混合物,为无色单斜棱柱形结晶,溶于水,微溶于75%(质量分数)乙醇,不溶于乙醚,熔点278一280;L型为无色菱形片状结晶,溶于水,微溶于醇,熔点269qC271;D型溶于水,盐酸,不溶于乙醇及乙醚,熔点251oC.1天冬氨酸的功能与应用天冬氨酸含有1个氨基和2个羧基,是生命体中合成赖氨酸,苏氨酸,蛋氨酸,异亮氨酸等氨基酸及嘌呤,嘧啶碱基的前体,其残基广泛存在于各种生命体中,能够传递大脑兴奋信号,调节脑和神经的代谢功能.L一天冬氨酸参与乌氨酸循环,促进氨和二氧化碳生成尿素,降低血液中氨和二氧化碳的含量,增强肝功能,因此广泛用做氨解毒剂,肝机能促进剂,疲劳恢复剂等医药用品和各种清凉饮料的添加剂IIJ.天冬氨酸与L一苯丙氨酸(LPhenylalanine)合成的二肽甜味剂阿斯巴甜(Aspartame),甜度高,热量低,适于糖尿病,高血压等患者,安全可靠;以L一天冬氨酸为原料合成的新型强力甜味剂纽甜21,不仅适用于包括儿童,孕妇,哺乳期妇女以及肥胖,心血管病和糖尿病患者在_内的所有人群,还适用于不能食用阿斯巴甜的苯酮尿症患者.天冬氨酸的外消旋体DL一天冬氨酸(DLAsp)作为和Mg的载体,能够向心肌输送电解质,从而改善心肌收缩功能,同时还能降低氧消耗,在冠状动脉循环障碍缺氧时,对心肌有保护作用,因此可用于合成DL一天冬氨酸钾镁盐(脉安定),可用于治疗心律失常,心动过速,心力衰竭,心肌梗塞,心绞痛,肝炎和肝硬化等疾病31.DL一天冬氨酸还可作为合成多肽的原料,它的氨基酸的取代衍生物(NMDLA)可以作为治疗神经类疾病和大脑疾病的药物【4,如天冬氨酸的衍生物N一甲基一D一天冬氨酸(NMDA)明显增强视神经单元放电单元的兴奋作用,可作为哺乳动物中枢神经系统中重要的兴奋神经递质受体之一嘲.目前,D一天冬氨酸作为一种手性药物,日益受到人们的重视.它在药物合成中主要用作药物合成的前体,中间体.田边制药公司(TanabeseiyakuCo.Ltd)把它作为一种重要的中问体来合成阿扑西林(Aspoxicillin,ASPC)m-7.阿扑西林是临床上使用的第一个氨基酸型青霉素注射药.Vila等8以D一天冬氨酸为前体合成D一天冬氨酸一p一羟胺(DAH).DAH是一种治疗病毒感染的药物,尤其是对一些逆转录病毒具有抗性,可用来治疗AIDS,肿瘤等疑难病症.D一天冬氨酸还参与合成一些抗生素的侧链,作为B一内酰胺抗生素的侧链能提高抗生素的抗菌活性.第41卷第2期2012年4月发酵科技通讯2主要合成方法:2.1化学合成法化学法主要用于生产天冬氨酸的外消旋体DL一天冬氨酸.近年来,波兰,日本,德国用经顺丁烯二酸酐(马来酸酐)和氨化剂直接进行加成反应合成出天冬氨酸.这种方法具有原料易得,过程简单,反应条件温和及产物易分离等特点,更适合于大规模生产.波兰的MachowskiS等人用顺丁烯二酸酐和过量氨水与NHCI反应,反应在一间歇反应釜中,于140C,0.4MPa下反应2.5h.将得到的混合物冷却至7Occ后用盐酸酸化至pH2.5,再冷却至室温,此时天冬氨酸沉淀析出,将沉淀过滤,4下水洗后得到产品,产率为55%.日本的FujiiG等将母液回收,反应产品的收率可达86%.德国的Basf公司则用管式反应器实现了连续反应,前苏联的GasparyanEEtol提出了反应的机理,并认为NHCHO3是最佳的氨化剂.美国的RadhakrishnAS”1报道了一种用邻一(2,4一二硝基苯)羟胺氨化丁二酸酯的方法,收率为61%;成都有机化学研究所的邓润华等采用微波法合成的收率为61.4%.该方法采用苯亚甲氨基乙酸乙酯为原料,在相转移催化剂(TEBA)催化下进行卤化反应,经水解生成天冬氨酸外消旋体.2002年,浙江大学的邢亚军等l3在一钛材高压釜中,对顺丁烯二酸酐)进行氮化反应合成了DL一天冬氨酸.通过实验研究对原有合成工艺作出了改进,使产品收率提高到7O%以上,并且对产品的分离提纯采用顺丁烯二酸(马来酸)代替盐酸进行酸化结晶从而提高了反应物的利用和减少反应剩余物的污染.2003年天津大学的王亚权等【提出了一种简便的,不使用任何催化剂的化学合成法.实验在聚四氟衬里的250ml高压釜中进行.实验步骤如下:将32.5g顺丁烯二酸酐(分析纯)溶于70ml水中,加入氨水(分析纯)至pH8,充1MPa氮气,然后在电磁搅拌下加热至453K,反应6h,反应后冷却至室温,过滤后得无色晶体,收率63.1%,熔点338oC.产物的红外光谱与DL一天冬氨酸的标准谱图吻合,容量分析表明天冬氨酸含量98%.2.2生物酶法生物酶法又可分为IC法和FWC法.该种方法是目前工业上合成左旋单体的主要方法,这种方法不仅收率高而且光学纯度高.酶法是用天冬氨酸酶催化氨与富马酸发生加成反应而得(见下式).HOOCCHCHCOOH+NHH0occHNHCH,COOH2.2.1IC法(固定化细胞法或固定化酶法)L一天冬氨酸的工业化生产始于1974年的日本I】7i,我国在八十年代中期也成功地进行了该产品中试,随后也进行了工业化生产,方法都是利用固定化细胞法.1973年,ChibataI等Il5将大肠杆菌中提纯的天冬氨酸酶,包埋在交联聚丙烯酰胺中制成固定化酶,富马酸和氨水由固定化天冬氨酸酶催化合成L一天冬氨酸.1974年,ChibataI等61进一步将高天门冬氨酸酶活力的大肠杆菌直接用聚丙烯酰胺包埋,制成固定化细胞.提高了酶的稳定性,避免了酶提取的复杂过程,首次实现了由富马酸转化为L一天冬氨酸的工业化生产,转化率达到99%,开创了细胞固定化应用于工业生产的先例.1979年,SatoT等刀对固定化细胞的方法进行了改进,用天然产物K一角叉菜胶代替聚丙烯酰胺包埋大肠杆菌细胞,并用戊二醛,戊二醛及环己二胺处理固定化细胞,以可溶性天冬氨酸酶为对照,研究了这三种固定化细胞中酶的性质.三种固定化细胞的酶促反应的最适pH为9,而可溶性天冬氨酸酶的最适反应pH为9.5.固定化酶的最适温度比可溶性天冬氨酸酶高5IOC.固定化细胞的表观Km值大约为可溶性天门冬氨酸酶的Km值的5倍.细胞经固定化后,热稳定性得到提高.固定化细胞柱在pH8.5时比在天冬氨酸酶反应最适pH下操作稳定性高.1981年一1983年居乃琥等.9J利用大肠杆菌菌株,制备固定化大肠杆菌细胞,用于连续生产天冬氨酸,小试每g湿细胞的天冬氨酸的产量最高可达1007g(30天).中试每g湿细胞的天冬氨酸产量为722g(25天).该法所用的戊二醛的浓度和添加量,比一般方法的低.由于戊二醛用量少,交联不充分,所以固定化细胞酶活力的回收率高,成本低,但稳定性较差,使用寿命短,所以要适当增加戊二醛的用量.1996年张波采用三种不同发酵培养基,经过不同发酵时间取样测定酶活(EA),pH值,生物一发酵科技通讯第41卷量(Biomass),确定选用培养基A;经不同底物浓度,不同金属离子对固定化细胞转化率的影响的实验,确定使用较高浓度底物及含Mg的底物为佳,经实验测得固定化细胞的使用寿命为3个月,即3个月之内能保持转化率在85%以上,固定化细胞的转化时间为3.5h.1997年石屹峰等2l设计了用于固定游离细胞生物转化的反冲式膜反应器(图1),利用膜将游离细胞阻挡于反应器内,同样达到固定化目的而又不损伤细胞(酶).反冲式操作是底物由膜反应器的外腔进内腔出,而生物催化剂在外腔,它可以提供底物与生物催化剂较好的接触.1一底物2一泵3一调节阀4一过滤膜5一反应器6一微滤膜7一磁力搅拌8一恒温槽9一酶10一产物图1搅拌反冲式膜反应器张今等1221围绕天冬氨酸酶的活性部位,末端缺失突变,蛋白质工程菌的固定化等方面进行了研究.将突变菌株用琼脂凝胶包埋法进行固定,固定菌量为95%,表观酶活力为82000单位,半衰期184d.实验表明,lkg固定化细胞,每24h约得L一天冬氨酸30kg,产品质量达1987年日本药局方(第九版)规定的标准.LASP的IC法合成,可提高单位菌体LASP的产量.实现自动控制,可直接从反应后的液体中回收LASP,提高收率.2.2.2FWC法(游离细胞法或游离酶法)与固定化细胞法生产L一天冬氨酸相比,游离整体细胞法(图2)具有较高的工作活力和生产能力,简洁的工艺流程,较少的设备投资,较低的生产成本和优良的品质,具有较强的市场竞争力TT上摇瓶种子底物溶液干燥TT上斜面种子反丁二烯成品图2游离栏体细舱.法生产I一天冬氨酸的工艺流程1996年,南京化工大学徐虹等231以大肠杆菌培养液作酶源,采用游离酶法由富马酸转氨生成天冬氨酸.取培养26h左右的培养液,37酶反应6d,可转化富马酸9kg/L.2000年,王雪根,徐虹等124又实现了游离整体细胞法工业化生产L一天冬氨酸,游离整体细胞可以在较短的时间内转化为较多的富马酸,且转化较为彻底,转化率平均在99%以上,有的接近100%.2003年北京化工大学唐芳等利用较为便宜的水解棉籽蛋白代替蛋白胨作为氮源,用葡萄一糖部分代替富马酸作为复合碳源,培养产天冬氨酸酶的大肠杆菌.结果表明,改变培养基配比后,对菌体的总体酶活力(即对底物转化能力)影响不大,转化率可达99%以上,通过上罐发酵初步估算可以节约培养基碳氮源成本大约60%.2.3生物拆分法:生物拆分法主要用来合成D一天冬氨酸.2_3.1利用LAspo【一脱羧酶进行拆分LAspo【一脱羧酶能立体特异性地脱去LAsp的o【位羧基生成B一丙氨酸(BAla)和CO:而第41卷第2期2012年4月发酵科技通讯对LAsp不起作用.随着CO:的释放,该反应基本上是不可逆的,因而可以实现产物的高转化率,并能同时得到两个有用产物.其中的BAla可用于泛酸的合成,其衍生物已被用作电镀业中的缓冲液.由于直接从自然界中筛选能产该酶的高活力菌株比较困难,1996年美国NSC技术有限公司通过基因重组的方法,构建含该酶的菌株(NS3291).该菌在最适反应条件(37pH7.0)下酶活为1146lxmol/g?ht26j.但该方法涉及到基因工程对菌的改造,目前还处在初级阶段,酶活力仍较低.2-3.2利用LAspB一脱羧酶进行拆分自然界中含高活性LAspB一脱羧酶的微生物较多.该酶能专一催化LAsp脱除B位羧基生成L一丙氨酸(LAla),因此可以利用该酶把DLAsp中的LAsp转化成LAla,而获得DAsp.利用LAspB一脱羧酶进行的拆分是目前研究较为成熟的一种方法.2008年韩铭海等提出了一种利用L一天冬氨酸一B一脱羧酶生物转化拆分DL一天冬氨酸得到D一天冬氨酸的方法.当牛肉膏浓度为0.2%,玉米浆为1.0%,蛋白胨为1.0%时,发酵液酶活力可以达到最高.转化过程最适pH值为6-7,转化过程最适温度5O,浓度6.0%以上的丙氨酸能显着提高转化过程中酶的热稳定性.利用D一天冬氨酸和L一丙氨酸的等电点的差异来分离提取D一天冬氨酸的制备工艺,其工艺简单,原料价格适宜,提取方便,工艺路线要比其他方法更便捷,更容易产业化.同年,韩冲等开发了以L一天冬氨酸为原料制备D一天冬氨酸的新方法:以天冬氨酸为原料经过酯化,消旋,拆分和水解制备D一天冬氨酸.使L一2,3一二苯甲酰酒石酸(LDBTA)与DL一天冬氨酸一B一甲酯在水溶液中于6570qC反应形成非对映体盐,冷却到室温,D一天冬氨酸LDBTA盐析出,过滤后再经水解得到D一天冬氨酸,收率78.2%,旋光纯度达到99%以上.3结语天冬氨酸作为一种重要的氨基酸具有广泛的用途,随着新型高分子材料聚天冬氨酸的需求日益增加,作为其合成前体的天冬氨酸市场需求将会进一步提高.微生物酶转化法高转化率,低生产成本是目前主要的工业生产方法,但提取方法仍需进一步改进,近年来一些学者如谭天伟提出的清洁生产工艺必将进一步降低天冬氨酸的生产成本和提高天冬氨酸的得率.参考文献:【1】祝忠群,心血管病学进展,1997,18,47.【2ParakashI,TheprocessforpreparingN一N一(3,3一dimethylbuty1)一0【一L-asparty1一Lphenylalanine1一methylester【P.US6077962,200006203谢荣禄.天冬氨酸镁钾对伴有心衰的心律失常的影响J】.广东药学院学报,1999,15(1):59-60.4N.S.Sapronov,M.Kamfi,L.B.Piotrovsky.PharmacolgyofsomenewDLasparticacidderibativesJ.PharmaeolBehav,1994,48:278285.【5】胡淑辉.天冬氨酸对家鸽顶盖脑片I【af层神经元电括动的影响.四川师范学院学报(自然科学版),1999,20(3):2252296】YanagidaTadasu,KojimaYukio,eta1.Studiesonstruc-tureofdegradationproductsofaspoxieillin.1I.PolymerizationproductsofaspoxieillininaqueoussolutionJ】YaKugakuZasshi,1990,110(6):400-4067YanagidaTadasu,KojimaYukio,eta1.Studiesonstructureofdegradationproductsofaspoxicillin.I.HydrolysisproductsofaspoxicillininaqueoussolutionJYaKugakuZasshi,1990,11O(6):394-399【8VilaJorge(FR),ThomassetNicole(FR).DasparticbetahydroxamateforthetreatmentotviralinfectionsandtumorsP】.US:5571839.1996一l1一O5【9吴正奇,凌秀菊,钙强化剂和钙强化食品的研究进展【J.食品工业科技,2001,22(4):818210GASPARYANEE.ExplosiveaminationofearboxylieacidJ】.ZhFizKhim,1990,64(6):17011703.【11邓润华,宓爱巧,将耀忠,微波快烷基化合成一氨基酸J.应用化学,1993,10(5):108-1