19乙肝病毒大表面蛋白通过诱导内质网压力激活S启动子.doc

JOURNAL OF VIROLOGY, Oct. 1997, p. 73877392原 文：Activation of Hepatitis B Virus S Promoter by the Viral Large作 者：ZHICHANG XU, GREGORY JENSEN, AND T. S. BENEDICT YEN作者单位：Department of Pathology, University of California, San Francisco, and Pathology Service, Veterans Affairs Medical Center, San Francisco, California发表刊物：JOURNAL OF VIROLOGY, Oct. 1997, p. 73877392以下为中文翻译稿 ：乙肝病毒大表面蛋白通过诱导内质网压力激活S启动子乙肝病毒 (HBV) 编码三种形式的表面蛋白。其中，数量较少的大表面蛋白由preS1启动子调控的转录物翻译而来，中、小表面蛋白则由下游的S 启动子调控的转录物翻译而来。当大表面蛋白过量表达时, 亚病毒和病毒颗粒的分泌都被阻滞在分泌路径中。我们发现，大表面蛋白的过量表达，可导致S 启动子高达10倍的激活（对于无关启动子，则不能激活）。中、小表面蛋白，和可分泌的大表面蛋白，都不能激活S 启动子 。但是，一些可诱导内质网(ER)压力的化学试剂，却具有与大表面蛋白相同的激活效果。大表面蛋白也能在整个病毒基因组的背景中激活S 启动子。因此，HBV 似乎已经进化形成了一种反馈机制：大表面蛋白的积累诱导产生ER压力，ER压力使中、小的表面蛋白的合成增加，然后，它们与大表面蛋白一起，组装成混合的、可分泌的颗粒。另外，像其他可诱导ER压力的试剂一样，大表面蛋白也能激活细胞的 grp78 和 grp94 启动子,这增加了它改变宿主细胞生理特性的可能。乙肝病毒（HBV）是一种具外膜的嗜肝性DNA病毒，已经在全世界范围内感染了大量人群。在这种病毒的外膜中，发现了三种HBV表面（外膜）蛋白。大表面蛋白由开放阅读框的第一个ATG密码起始翻译而来，中、小表面蛋白是由更远的下游的内部ATG密码起始翻译而来（图1）。三种表面蛋白都是跨膜蛋白，因此翻译之后，都插入在内质网上（ER），它们与外膜胞质核心（核衣壳）一起，组装成成熟的病毒体，通过组成型分泌途径，被分泌到胞外。另外，在没有其它的病毒蛋白存在的情况下，中蛋白和/或小蛋白则会出芽进入ER内腔，以球状或丝状的亚病毒颗粒的形式分泌出去。相反，如果只单独表达了LS，则LS就不会被分泌出去，而是以ER腔内颗粒的形式滞留下来。如果LS与其它种类的表面蛋白共同表达，它们就会形成异质性多聚体，这种多聚体的表型依赖于不同表面蛋白的相对含量的多少：LS相对含量较低，多聚体分泌，而LS相对含量较高，则多聚体滞留。多聚体的滞留，不仅影响非感染性亚病毒颗粒的分泌，而且也会影响感染性病毒颗粒的分泌。因此，对病毒的生命周期产生危害1。所以，并不令人奇怪的是，在感染性细胞中，LS的量，比中、小蛋白少得多。HBV的这种差别性的调控方式，是通过两个独立的启动子实现的（图1）。上游的preS1启动子所调控的转录物，主要翻译成LS，而下游的S启动子所调控的转录物，则被翻译成中蛋白和小蛋白。因为前S1mRNA的量通常比SmRNA少得多，所以，LS的量总是不足的，不能阻止颗粒的分泌。因为LS与中、小表面蛋白的相对含量比，对于病毒的复制是关键的，所以我们推测，可能存在一个反馈机制，来确保均衡的合成这些蛋白。在本研究工作中，我们证明了这样的机制确实存在，LS可显著激活S启动子。这种激活与LS细胞内阻滞相关联，并且能被可诱导ER 压力的化学试剂模拟。相反，LS也能激活细胞内的能对ER压力产生应答的启动子，而其它不相关的启动子则不行。因此，LS的过量表达以及随后的胞内颗粒滞留，似乎是通过由ER压力诱导的一种胞内信号途径来激活S启动子。这种激活反过来会增加中、小表面蛋白的合成，这样，使亚病毒颗粒和病毒颗粒得以分泌。我们的发现不仅揭示了HBV基因表达调控的新的一层复杂性，而且提出了一种机制，LS通过这种机制，在慢性HBV感染过程中，影响宿主细胞的生理特性。图. 1. (顶部) HBV 基因组编码表面蛋白的区域的示意图。 阴影框表示的是开放阅读框。preS1 启动子引发编码LS (含 preS1, preS2, 和表面域)的 2.4-kb 转录物。S 启动子引发2.1-kb转录物，横跨了一个内在ATG密码，从而，引发中、小表面蛋白(分别含preS2和表面域或仅含表面域). 在质粒 pCMVLM-S-中,内源性 preS1 启动子 被CMV立即-早期取代，并且编码中、小表面蛋白的起始密码子ATG被突变成ACG。, 即多聚腺苷酸化信号。(底部)显示的是 S 启动子的一部分序列。CCAAT元件被加框显示，两个在体内与Sp1 结合的位点加了下划线。每个位点的簇生点突变序列标注在主序列下面。材料与方法质粒。所有的操作，酶的处理，和质粒的生长都按照标准技术流程进行27。所有的HBV基因组DNA都得自于病毒株adw229。质粒pSVLM-S- (2)含有猿猴病毒40（SV40）增强子-早期启动子，这个启动子位于含S、X基因及多聚腺苷酸信号的HBV DNA片段的上游。中、小表面蛋白的起始ATG密码已被突变；这样，含有这种质粒的细胞就只表达LS和X蛋白，而不表达中、小蛋白。除了一个编码-内酰胺酶信号序列的DNA片段被融合到LS开放阅读框的5端外，质粒pSVsignalLM-S- (2)与pSVLM-S-相同。这一改变的结果是，可分泌型的LS的合成2。除了SV40启动子被细胞巨化病毒（CMV）立即早期启动子取代（通过替换一个pCMVL 33的片段），质粒pCMVLM-S-与pSVLM-S-相同。pSVLM-S-的SalI到EcoRI的片段，PCR扩增时使用的引物为 5GGCGTCGACCGAGCTTGCATGCCTGCAGG和5GTGGAATTCCAC TGCGTGGCC（注意后者有一个核苷酸发生了变化划线，所以就像在pSVLM-S-中一样，中、小蛋白的起始密码ATG被改变为ACG）。已确认扩增片段的序列没有出现其它的突变。质粒pCMVL-M-S-在LS基因内含有一个移码突变，所以不能合成全长的LS。这种质粒的来源是：先将pCMVL-M-S- 用内切核酸酶EcoRI处理，然后用DNA聚合酶I的Klenow片段修复交错末端，最后重新连接。质粒pSVLM-S-X-在X基因内有两个损伤：一个是在1682与1683位残基之间插入一个额外的G残基，造成一个移码突变；另一个是将1685位的残基突变为A，造成一个早期终止密码子。最初，这些突变是用诱变引物在全长的HBV结构(pHBV1.2) 31中经重叠PCR扩增形成的，然后，通过把后者的自SpeI至KpnI的片段更换为前者质粒的自SpeI至ApaI的片段（KpnI- 和 ApaI-的消化末端都是用DNA聚合酶I的Klenow片段修复的），最后将这些突变引入质粒pSVLM-S-。质粒pSAgDHin 38含调控中、小表面蛋白表达的天然S启动子，而质粒pCMVS含有调控小表面蛋白表达的CMV启动子。质粒pRVL- (1)含整个HBV基因组的超过全长的片断，它不含任何外源启动子，它也含有一个点突变，这个突变不影响任何其它的HBV基因产物的表达，只是使LS不能表达。质粒突变I32含有整个HBV基因组的超过全长的片段，其中，含有CCAAT元件的S启动子出现了一个129-bp的框内缺失。这个缺失导致了中、小表面蛋白合成的减少，而增加了LS在转染细胞中的合成，因此，将会使表面蛋白颗粒在小囊泡中堆积。质粒pS1CAT含130-bp的S启动子片段，它是由PCR扩增产生的，并通过DNA测序确认，插入在无启动子的氯霉素乙酰转移酶(CAT)报告基因pCAT-basic (Promega)的限制内切酶位点HindIII 和 XbaI之间。使用的启动子为5CACAAGCTTAACAATTCCTCCTCCTGCCTCCAC 和 5CAGTTCTAGACTGCAGAGGTTGGTGCAAGGCAG。类似的在CCAAT元件和S启动子Sp1结合位点出现突变的报告质粒，是将含有这些突变的HBV变异体（先通过重叠PCR产生）作为模板而产生的。质粒pSBCAT含调控CAT 基因 38的HBV preS1启动子。质粒pgrp78(2457)CAT 13 和pgrp94(2357)CAT 23分别含有调控CAT 基因的启动子grp78 和 grp94，这是承蒙A. S. Lee (University of Southern California)惠赠的。质粒 pSp1CAT(3) (12)含minimal人类免疫缺陷性病毒I型启动子，它含有三个串联的Sp1位点，用以调控CAT基因，这是承蒙K. T. Jiang (National Institutes of Health) 通过S. Tong-Starksen (University of California, San Francisco)惠赠的。质粒pSp1CAT(3) CCAAT含HBV启动子的CCAAT元件，插入在pSp1CAT 的PstI 和 SalI 位点之间。这个插入是通过将序列为5GCCACCAATCGGCAGTCAGGAAGGCAGA 和5TCGATCTGCCTTCCTGACTGCCGATTGGTGGCTGCA两个寡聚核苷酸退火得来的。细胞培养与转染。将HuH-7肝细胞瘤细胞,置于37，外加10%胎牛血清的Dulbeccos改良 Eagles培养液，含7%CO2的空气中培养。将质粒DNA用磷酸钙方法转染细胞，在转染的第2天收集。细胞在收集前的最后16个小时用如下试剂处理：2-脱氧葡萄糖（10mM，由1M贮存液稀释而来），衣霉素(50g/ml, 用二甲基亚砜DMSO稀释5 mg/ml贮存液而来), EGTA (5 mM,由0.25 M贮存液稀释而来),毒胡萝卜素(4g/ml，用DMSO 稀释5mg/ml 贮存液而来)，A23187 (200g/ml,500mg/ml 贮存液稀释于DMSO而来), DMSO (0.8l/ml)。CAT测定和RNA分析。转染细胞中的CAT活性用薄层层析法定量。必要时，稀释细胞抽提液，所以活性能保持在测定的线性范围内（50%的氯霉素的乙酰化）。转染细胞的RNA用RNAzolB（Biotex）纯化，而引物延伸则被用于preS1和S转录物的定量，就像前面提到的那样37。结果与讨论LS与ER压力对S启动子的激活。为了检测LS对S启动子活性的影响，我们共转染两种质粒进入HuH-7肝细胞瘤细胞。一种质粒是pS1CAT，含有S启动子调控的CAT 报告质粒。另一种质粒是pCMVLM-S-, 由CMV立即早期启动子调控表达LS；为了阻止中、小表面蛋白的表达,已将它们的起始密码进行了突变2。如图. 2A中所示, 与共转染了pUC18的细胞相比，pCMVLM-S-的LS表达使转染细胞中CAT活性增加了10倍以上。当因为一个移码突变(pCMVL-M-S-)，LS的表达被消除时，就观察不到CAT 的活性(图. 2A)。由于这些表达质粒也含有HBV X 基因 (图. 1)，X 基因可编码一个转录的反式作用因子36，所以有可能X基因的产物对于激活也是必需的。质粒pCMVLM-S-X-，在X 基因内同时含移码突变和链终止突变，但它含有一个完整的表面（蛋白）基因，将它转染入HuH-7肝细胞瘤细胞，仍然导致了CAT 活性的显著增加(图. 2A), 这表明LS对于S启动子的激活，既是必要的，也是充分的。当LS从SV40 增强子-早期启动子起始表达时，也观察到了相同的结果(pSVLM-S-图. 2A)。LS的活性对于CAT 基因表达的影响并不是非特异性的。因为不论是HBV preS1 启动子调控的CAT报告质粒，还是由minimal HIV-1 启动子pSp1CAT(3)调控的无关CAT报告质粒，都不能被LS显著激活(图. 3)。需要进一步注意的是，即使在中、小表面蛋白在胞内存在的情况下，野生型LS的过量表达也能激活S启动子（资料未呈现）。这表明，在质粒pCMVLM-S-和pSVLM-S-中，LS对S启动子的激活，不能被归因为，为了阻止中、小表面蛋白的表达，在LS中引入的两个甲硫氨酸苏氨酸的突变，使它们的起始密码突变的结果。因为LS作为跨膜蛋白在ER中中转，以出芽形式进入囊腔形成直径20nm的颗粒，并在ER居间区室中积累33，所以，LS不太可能通过直接作用于细胞核而影响转录。另一方面，众所周知的是，错误折叠或突变的蛋白不能被分泌出去，堆积在ER中对ER造成一定的压力，ER压力再通过细胞内相应的信号途径，影响转录14，21，30。因此，我们猜测，可能的过程是，LS滞留在分泌途径中，对ER造成了压力， ER压力产生相应的信号，而这种信号则会影响S启动子。如果是这样的话，S启动子的激活，就必须依赖于（分泌）颗粒在细胞中的积累。实际上，经过修饰的可分泌的LS (pSVsignalLM-S-)是无法激活S启动子的；作为一般的分泌蛋白，中、小 表面蛋白 (pSAgDHin)也不能激活S启动子(图. 2A)。于是，我们就检测不同的可诱导ER 压力的化学试剂对S启动子的影响效果(相关综述，见参考 14): 2-脱氧葡萄糖和衣霉素，两种不同的糖基化的抑制剂：EGTA，一种钙离子螯合剂，A23187，一种钙离子载体；和毒胡萝卜素，一种ER ATPase的抑制剂。确实，所有四种化学试剂都可导致S启动子调控的CAT 表达的大幅上升(图. 2B)。反过来，LS能够激活的两个被认为是由ER压力调控的细胞启动子（这两个启动子调控grp78 和 grp94 基因) 23, 25 (图. 3)。图. 2. (A) 在pS1CAT中，不同表达质粒对于CAT 表达（由S启动子调控）的影响。 HuH-7细胞置于60-nm-直径培养盘中，以2.5 g pS1CAT与2.5 g质粒图中所示的质粒共转染，转染后两天的CAT活性被标准化为共转染了pS1CAT和pUC18的细胞中的活性。结果用三盘转染细胞的平均值标准差表示。(B) 各种可诱导ER压力的诱导物对于CAT表达的影响。HuH-7细胞置于60-nm-直径培养盘中，以5g 质粒pS1CAT转染，并用图中所示的化学试剂处理16 h。CAT活性被进行标准化，用被DMSO处理过的细胞的活性表示。其中，DMSO使用的量与用于溶解毒胡萝卜素(Tg)的DMSO的量相同。结果以三盘转染细胞的平均值标准差表示。Tunica, 衣霉素；Deoxyglc，脱氧葡萄糖。在应答ER压力时，NF-Y（细胞核因子Y框结合因子）的作用。虽然ER压力调控转录的详细机制还不清楚，但已经很明了的是，细胞的grp78 (26),grp94 (23),和ERp72 (28) 基因的激活，需要转录因子NF-Y 和CCAAT 元件与其结合。由于S 启动子含有一个重要的与NF-Y结合的CCAAT 元件16 (图. 1)，很可能的是，这个元件也被包含在S 启动子对ER压力应答的过程中。因此，我们将三个簇生点突变引入位于CAT 报告质粒S启动子中的CCAAT 元件，这种突变使CCAAT 元件不能与NF-Y 结合38 (M2在图1)。这种突变体，果然完全不能对ER 压力产生应答，不论这种ER压力是由LS(图. 4)还是由各种化学诱变物所引发的(资料未呈现)。正如ER压力激活含CCAAT 元件的基因时，CCAAT元件是必需的一样， ER压力如要激活S 启动子，也需要CCAAT元件。对于grp78 (26), grp94 (23), 和ERp72 (28) 基因来说，除了CCAAT 元件，其他的结合另外一组细胞因子的DNA元件，对于应答ER压力也是必需的。为了确定这些元件是否也是激活S启动子的必要条件，我们将另外两个S 启动子上游的顺式作用元件，单独或一起(Z1 和 Z2 在 图. 1)地进行突变，然后检测这些突变对ER压力的应答性。如图. 4所示，对于由LS引发的S启动子的激活，这些元件中任何一个单个的突变(pS1CATZ1 和 pS1CATZ2)都能够压制这种激活，但不能消除它。当两个元件被同时突变(pS1CATZ1+Z2 图. 4)，就观察不到有激活的现象。因此S启动子对于ER压力的应答，只有CCAAT 元件是不够的，至少还需要有图. 3. LS对于分别由HBV preS1 启动子(pSBCAT)、minimal HIV-1 启动子pSp1CAT(3) 、grp78 启动子、或 grp94 启动子调控的CAT表达的影响。HuH-7细胞置于60-nm-直径培养盘中，以2.5 g pCMVLM-S- 和 2.5 g图中所示的质粒共转染。转染两天后的CAT活性，标准化为用质粒pCMVL-M-S-代替质粒pCMVLM-S-转染细胞而得到的胞内活性。结果以三盘转染细胞平均值标准差表示。图. 4. LS对于由野生型或突变S启动子调控的CAT表达的影响。HuH-7细胞置于60-nm-直径培养盘中，以2.5 g pCMVLM-S- 和2.5 所示的质粒共转染, 转染两天后的CAT活性，标准化为用质粒pCMVL-M-S-代替质粒pCMVLM-S-转染细胞而得到的胞内活性。结果以三盘转染细胞平均值标准差表示。一个Z位点。现在还不清楚哪些细胞因子对于实现Z位点的功能是必须的。虽然已知道，Sp1可以结合于Z位点 24, 但是，ER压力并不能显著激活含Sp1位点的启动子质粒Sp1CAT(3)CCAAT(图. 4)，该质粒的启动子，在Sp1位点上游还含有一个S启动子的CCAAT元件。因此，这说明Sp1不太可能介导Z位点应答ER压力的功能。LS 和 ER压力 在整个病毒基因组的背景中。前面的实验都是在只含有一部分的HBV DNA的表达质粒或报告质粒中进行的。为了确定这些结果是否在整个基因组的背景中也有效，我们首先检测了在含整个HBV 基因组的质粒中(质粒 pRVL-)中，S 启动子是否对ER压力产生应答。确实，用这种质粒转染HuH-7细胞，然后用A23187处理，结果引物延伸的分析显示，S转录物水平大幅增加(图. 5)，其增加的量与经A23187处理的pS1CAT转染细胞中CAT活性的10-倍增长相同(图. 2B)。 相比而言，preS1转录物的含量变化（增长）则不足两倍(图. 5)。因此说明，在整个HBV 基因组的背景中，ER压力也能激活S 启动子。反过来，在一种突变的HBV 基因组(突变 1)中，LS被过量表达，中、小表面蛋白则表达不足，其中，LS使用的是其天然启动子。这时，LS也能将CAT报告质粒的S启动子激活4.80.4 倍。因此证明，我们的结果，并非是因为使用HBV基因组的片段而产生的赝像。 图.5 图.6图. 5. ER压力对于preS1和S的转录物水平的影响，HuH-7细胞置于100-nm-直径培养盘中，以10 g pRVL-转染，它含有超过全长的HBV基因组，可表达除LS外全部的病毒转录物和蛋白。这种质粒的用处是，排除ER压力对LS转录和分泌产生的任何影响（指对S启动子产生的副作用）。用A23187 或DMSO处理16-h后，从细胞中提纯RNA，并且，preS1和S 转录物以引物延伸来定量。注意以S启动子为特征的多个起始位点。一个重复的实验获得了类似的结果。泳道1， DMSO;泳道2, A23187.图. 6. 表面蛋白的分泌依赖于LS与小蛋白的相对含量比例，而不是LS绝对含量。HuH-7细胞被途中所示数量的质粒转染，其中质粒pCMVLM-S-仅表达LS，pCMVS只表达小表面蛋白，而足够数量的pUC18是用来补足整体5 gDNA的总量的。数据以减去背景后的两类转染的平均值值域表示。LS分泌的重要作用.我们的结果证明，如果LS在分泌途径中积累（滞留），就在转录水平激活了小表面蛋白的合成。我们猜测，最终，小蛋白与LS的在细胞内含量比率的上升，导致了滞留物被释放分泌出去。因此，在LS表达过量的情况下，这种反馈机制对于维持病毒的形态发生是有用的。然而，现存文献中的资料并没有直接提到这样一个问题：LS的绝对含量，和LS对于小蛋白的相对含量水平，这两者中，哪一个才是阻滞分泌的重要原因？这个问题很重要，如果答案是前者的话，那么，如果仅增加小表面蛋白的合成，只能导致表面蛋白在ER中进一步的积累，而不是使其分泌出去。为了回答这一问题，我们以两种质粒转染HuH-7细胞，一种质粒只表达LS，而另一种只表达小表面蛋白。正如所期望的，当用1g仅表达LS的质粒转染时，没有出现表面蛋白的显著分泌(图. 6, 左侧条块)。同样的，当用1g仅表达小蛋白的质粒与1g仅表达LS的质粒一起转染，也没有观察到分泌的现象(图. 6, 中间的条块)。然而，当将仅表达小蛋白的质粒增加到4g，而仅表达LS的质粒人维持在1g时，就发现，有大量的表面蛋白被分泌到培养液中(图. 6, 右侧条块)。这些结果表明，是LS对小蛋白的相对含量比率，而不是LS绝对含量，决定了表面蛋白的分泌性。因此，当LS过量合成，积累在分泌途径中时，增加小表面蛋白的含量，确实可以减少表面蛋白在胞内的积累。总结:我们都知道，HBV 不同的表面蛋白，彼此相对含量的适当平衡，对于病毒的生命周期是重要的，因为LS的含量即使出现相对温和的增长，也会导致分泌性的病毒编码颗粒在胞内的滞留5. 我们的结果证明，存在一个先前未知的调控HBV表面蛋白表达的反馈机制。因此，当LS过量表达得足够多时，就会阻滞颗粒分泌，这些颗粒在胞内的积累，引发了一系列导致S启动子在转录水平激活的事件，接着，中、小蛋白的合成增加，使LS与中、小表面蛋白的相对含量达到一个适当的比率。通过这种方式，就能使病毒生命周期免于因LS过量表达而破坏。因此，虽然现在还不知道，当野生型的HBV进行普通感染时，这一调控回路，实际起作用的几率有多少，但它可能也是HBV基因表达的一个重要调控方式（特点）。确实，在过渡转染中，没有观察到野生型HBV合成过量的LS，来激活这一反馈路径（资料未呈现）。 除了存在这种防止LS过量表达的反馈机制外，在慢性HBV感染者的肝脏中，常有个别的肝细胞在胞内积累LS，这可能是由于LS过量表达造成的11。这些所谓的毛玻璃状细胞，在增生的ER和/或居间区室中7，有大量的含LS的丝状颗粒。毛玻璃状细胞形成的原因还不清楚。可能的原因的是，宿主细胞反式作用因子的变化导致了LS过量表达，由于过量表达的太多，使得即使中、小蛋白的合成增加，也无法将其平衡。或者另一种的可能是，在慢性感染过程中，HBV积累的突变，使它失去了对ER压力产生恰当应答的能力。确实，一些研究团队8，19，34已经独立的发现了许多不同的天然发生的HBV突变，这些缺失和/或点突变发生在S启动子CCAAT元件内，而这个元件，不仅对于基本的S启动子的功能16和ER压力激活的应答，而且对于下调preS1转录物的产量，都很重要15。因此，这些突变体，不仅表现出中、小表面蛋白基础合成的减少，而且，对于因为preS1 mRNA 水平的增加而引起的LS的积累，不能产生应答。因此，含有这些突变的肝细胞就会表达过量的LS，积累在ER中。在对这类突变中的一种进行转染研究的培养实验中，已经发现，LS确实在胞内积累。然而，要确认相同的事件也在人体内发生，还要等转基因小鼠和对毛玻璃状细胞HBV基因组进行直接分析的研究结果出来。 人们在过量表达LS的转基因小鼠体内，也观察到了毛玻璃状细胞4。有趣的是，这些小鼠的肝细胞，对于-干扰素9，或是自发的4，表现出突出的脆弱性，这最终导致了肝细胞的损伤或肝炎。我们的结果可以解释LS积累为何对肝细胞造成这么严重的影响，这是因为ER压力能激活几种细胞转录途径14，21，30来对细胞施加影响，。将来进行的实验将会分析从ER到细胞核的信号途径，以及细胞生理由此发生的变化，而这些生理变化，可能与HBV相关疾病的发病机制有关。参考文献1. 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