外周动脉闭塞症中通过吲哚布芬降低中性粒细胞活化.doc

外周动脉闭塞症中通过吲哚布芬降低中性粒细胞活化Chello, Massimo; Mastroroberto, Pasquale; Celi, Vittoria; Romano, Ferdinando; Marchese, Antonietta R.; Colonna, Alfredo Chello作者信息Dipartimento di Medicina Sperimentale e Clinica, Facolt di Medicina e Chirurgia, Catanzaro; and *Cattedra di Igiene, Facolt di Medicina e Chirurgia “G. DAnnunzio,” Chieti, Italy1995年6月19日收到，1995年11月27日同意修订。地址通信和副本联系Dr. M. Chello at Via S. Giacomo dei Capri 29, 80128 Napoli, Italy。摘要在缺血再灌注临床模型中，我们评估吲哚布芬降低中性粒细胞活化的有效性。三十位稳定患者随机分为两组，他们因腿部闭塞性外周动脉病导致间歇性跛行。第一组患者用吲哚布芬治疗（200 mg口服，每日两次 (p.o. b.i.d.)，持续一个星期）；第二组患者接受安慰剂治疗。两组患者在标准跑步机上练习，直到发生跛行。在股静脉引流缺血腿血液样本上，对血栓素B2（TxB2）和6酮前列腺素F1（6-k-PGF1alpha）中性粒细胞过滤性和中性粒细胞活化（使用硝基四氮唑蓝试验法）的血浆水平进行评估，在休息时和出现跛行5、30和60分钟后测量数值。在休息时和跛行出现后1小时，测定尿白蛋白排泄。安慰剂组出现跛行后5分钟，血栓素TxB2和6酮前列腺素F1血浆水平显著增加，而吲哚布芬治疗组只是略有增加。血小板和中性粒细胞活性偏高，被认为在病理生理上和外周血管疾病相关，可通过增加小血管闭塞和血液粘度（低剪切速率）导致微循环功能不全。以往的研究表明，间歇性跛行的患者可能出现凝血活性，增加血液粘度（增加红细胞和血浆纤维蛋白原引起），增加白细胞活化以及僵硬性（1-3）。与正常人相比（4,5），严重缺血患者全血过滤性受到损害；在静脉引流缺血区，过滤性能的降低，具有系统性和局部性。在缺血条件下，中性粒细胞局部包封能够损害灌注，并可以确定不良的系统性影响，因为它们可以和血管内皮细胞发生相互作用（6），并释放各种化合物，例如花生四烯酸代谢产物（7）、氧自由基（8）和血小板活化因子（9），这将导致内皮细胞损伤和血管通透性增加。先前证明能反映血管通透性的尿白蛋白排泄，在跛行者运动后将显著增加，并与中性粒细胞过滤性降低和血清溶菌酶活性增加相关（10）。吲哚布芬是一种环氧化酶可逆抑制剂。它在改善外周血管阻塞疾病临床症状的疗效，已通过不同时间（11,12）的临床实验进行评估。我们希望在临床缺血再灌注情况下，确定吲哚布芬的服用对中性粒细胞活化的影响。方法三十名明显间歇性跛行患者按照医院编号随机分成两组，这种间歇性跛行因血管造影证实的腿部外周血管闭塞疾病造成。第一组患者用吲哚布芬治疗（200 mg口服，(p.o.)每日两次，(b.i.d.) 持续一个星期）；第二组患者接受安慰剂治疗。在研究前2周或研究期间，无患者报告在休息时疼痛或呈坏疽症状或接受主动的血液流变性用药。慢性肺病、糖尿病、下肢骨关节病或限制他们步行距离的其他疾病患者被排除在外。在所有下肢间歇性跛行症状患者中，踝关节及上肢收缩压之间比值0.99），从中算出流速为（每分钟毫升数）。中性粒细胞存活率大于98%，和胎盼兰拒染试验结果相同。通过在此程序中复制血液样本，我们评估该技术重现性；每个复制样本流量差异5%。氮蓝四唑（NBT）：中性粒细胞活化特性是可以降低NBT染色，这与增强性超氧阴离子自由基有关。这是中性粒细胞激活后的呼吸爆发主要现象。按照Neumann及其同事所述方法在新鲜血液做NBT测试（5）：0.2ml肝素化血液在37下培养10分钟，之后添加0.2ml 0.1% NBT溶液（在磷酸盐缓冲盐水中）。该混合物37C下培养15分钟，然后在室温（21C25C）下保持15分钟。涂片制备时，使NBT和血液混合物快速滴落到预先清洁的载玻片上。空气干燥后，涂片用瑞氏色素染色。在每个载玻片上，100个中性粒细胞计数。以含有甲臜沉积物（至少1核叶大小）的中性粒细胞百分比作为Positive NBT得分。类花生酸测量：血栓素B2（TxB2）和6酮前列腺素F1（6-k-PGF1alpha）评估用的血液样，取自研究方案所述4个时间点的股静脉；血栓素B2和6酮前列腺素F1分别表示体内TxA2和前列环素产生的情况。对于每个样品，用聚丙烯注射器抽取5 ml血液（含0.2 mg阿司匹林），并放到含0.05 ml 15% EDTA溶液的试管中。在室温下，管子在摆动篮转头中离心15分钟（2300 g）。然后收集血清，在-20C时冷冻，直到使用标准免疫技术检测类花生酸检测（13）。所有的结果报告，均使用每毫升血清复合物皮克数。尿肌酐/白蛋白比值：从每位患者中获取尿液样品，并使用Hickey及其和同事所述方法（10）。受试者排净膀胱尿液，并休息1小时，然后排净膀胱，获取中段尿（MSU）样本。受试者在跑步机上行走，其中12仰角和3公里/h速度，等到疼痛时停止。再休息1小时后，获取第2个中段尿（MSU）样本。使用标准比浊法（Cobas Mira Plus, Hoffman-Roche，巴塞尔，瑞士）测定尿白蛋白，并用尿白蛋白-肌酐比值（每微摩尔毫克数）表达，以补偿尿流在研究过程中的变化。统计分析数据为平均值 SEM：在组内测试随时间过程出现的重大变化时，首先对变异进行重复测量分析，然后采用Scheff多重对比分析。比较两组时，使用Students t test方法。由于观测值的分布存在异常值，因运动产生的ACR变化通过Wilcoxon配对秩和检验进行分析。变量之间的关系通过线性回归分析确定，计算所选择生化变量之间的相关系数；p 0.05被认为具有统计学意义。只由一名不清楚药物情况的人员来分析数据。和生化及血液流变学测量有关的人员，则完全不清楚研究设计情况。结果在入院时，两组具有相似的间歇性跛行特征。在两组患者中，下肢动脉血管病变明显为单侧主导型。在髂/股-腘区，两组具有类似的血管狭窄闭塞分布。在吲哚布芬或安慰剂治疗前，无痛行走距离平均分别为161.4 15.5 m和155.6 16.7 m（p值 = NS）。经过1周有效药物或安慰剂治疗，此参数无明显改变（吲哚布芬组167.7 15.4m，安慰剂组158.5 16.4m，p = NS）。两组具有相似的心血管风险（吸烟、高血压、高脂蛋白血症和肥胖）、家族心血管疾病和代谢性疾病历史。治疗组平均年龄为55 3岁（45-70岁），安慰剂组平均年龄为57 4岁（43-71岁），p = NS。在吲哚布芬治疗时，没有观察到主观或客观性副作用。这两组（治疗组和安慰剂组）整个试验过程中，没有观察到血小板计数、红细胞压积、纤维蛋白原水平方面的差异（表1）。两组患者出现疼痛后5分钟，观察到中性粒细胞总的显著增加（p 0.05）。原文右侧有表1，下面有图1等，请核实乳酸释放运动前，两个治疗组的乳酸含量在正常范围。发生跛行5分钟后，两组患者乳酸大幅释放（图1）。发生跛行后30和60分钟，观察到逐步回复到基线值。在整个研究过程中，两组之间在血清乳酸水平上没有观察到显著差异。TxB2和6-K-PGF1alpha在整个实验中，与安慰剂组比较，吲哚布芬组的6-kPGF1alpha和TxB2值显著降低（对基线值而言）（见表1）。疼痛出现后5分钟，安慰剂组患者的6-kPGF1alpha和TxB2显著增加，即与基线值比较（6-kPGF1alpha：450.3 41.4 vs. 313 24 pg/ml, p 0.01；TxB2：308.6 43.4 vs. 177.5 25.6 pg/ml, p 0.01）。而在同一时间点上，吲哚布芬组6-kPGF1alpha和TxB2只是略微增加。发生跛行后30和60分钟再次测量时，这两个值向基线值回归。过滤性和基线值相比，所有跛行患者在疼痛发作后5分钟，他们的中性粒细胞过滤性明显减少（图2）。在两组患者中，疼痛发作后30和60分钟，可观察到向基线值回归的趋势。用Wilcoxon检验分析表明，和安慰剂组比较情况下，在发生跛行后，吲哚布芬组的血细胞比容过滤显著降低（即5分钟时为0.39 0.03 vs. 0.51 0.03 ml/min, p 0.05，30分钟时为0.43 0.02 vs. 0.55 0.03 ml/min, p 0.05）。NBTNTB得分值见图3。疼痛发作后5分钟，两组患者NBT得分显著高于基线值；然而，吲哚布芬组NBT得分值均显著降于安慰剂组（7.98 0.9 vs. 11.78 1.2, p 0.05）。在两组患者中，NBT得分表明发生跛行后30和60分钟时出现正常化趋势。直线回归分析表明TxB2和NTB得分之间呈正相关性（r = 0.6, p 0.01）（图4），而NTB和中性粒细胞过滤性之间呈负相关性（r = -0.65, p 0.01）（图5）。ACR在安慰剂组和吲哚布芬组之间，基线平均ACR值没有显著差异。在静息值相比，这两组在运动后，平均ACR值显著增加（安慰剂组：7.1 1.1 vs. 4.3 1.3 mg/mmol, p 0.05；吲哚布芬：6 1.1 vs. 3.9 1.1 mg/mmol, p 0.05）。Wilcoxon秩和检验表明，组间平均ACR值在运动后没有显著差异。讨论越来越多的数据支持这一假设，即中性粒细胞在外周动脉闭塞性疾病的发病机制中具有关键作用。在间歇性跛行患者中，一系列研究表明，活动导致的肌肉缺血和中性粒细胞变形（为中性粒细胞活化证据）以及血清溶菌酶和过氧化脂质含量增加（3,10）有关。这个假设特别从缺血腿中的静脉回血得到清楚证实（5）。纳什及其同事证明，导致截肢的重要下肢缺血，与中性粒细胞活化和变形损失相关联（4）。截肢和治疗后，这种情况得到改善。多形核白细胞（PMN）活化机制仍不清楚。缺氧条件下细胞延期包封或补体（14）激活或缺血组织血栓素释放后，中性粒细胞可能被激活或在（15,16）。虽然缺血损伤的局部和全身影响中，环氧化酶和脂氧合酶衍生物可能发挥作用，但肢体缺血后再灌注损伤时血栓素-PMN相互作用才至关重要（17-19）。因此，再灌注时血栓素水平增加，它的合成抑制或其受体阻断将防止躯干下部缺血损伤。Anner及其同事（20）清楚地证实，缺血引起的中性粒细胞氧化爆发呈血栓素依赖性，报告说，肺微血管中PMN包封是血栓素产生的结果，而血栓素的产生是内皮细胞上LTB4和C5a刺激而导致。此外，已有报道说，跛行患者运动后的血清TxA2（21）和尿血栓素代谢产物将增加（22）。虽然血小板可产生丰富的TxA2，但许多研究表明，血小板没有被缺血激活而合成TxA2（23,24）。首先，它们在再灌注期间没有积累于缺血组织（通过骨骼肌（25）活体显微镜和使用作为跟踪物的111In标记型血小板进行证明）。这和再灌注组织上中性粒细胞稳定存在的情况相反。第二，尽管刺激血小板是血栓素重要来源，但中性粒细胞更容易在缺血再灌注时产生血栓素，因为循环的中性粒细胞预先几乎完全耗尽，可以抑制血栓素的增加，而不影响血小板计数（25）。目前的数据表明，在缺血情况下，PMN可直接或间接产生大部分血栓素TxB2（26）。由于激活白细胞能够合成TxA2（15），并可调节已增加的血管通透性（27），所以它们可能和再灌注损伤有关。这些因素不排除血小板可能具有的间接作用，其中，它们的血栓素和其他成分分泌可能使中性粒细胞激活。越来越清楚的是，血小板-白细胞的相互作用可能比血小板活化本身更为重要。血小板-中性粒细胞相互作用的存在，已通过对血小板-中性粒细胞悬浮液中的血栓素合成酶抑制剂的研究得到证实。中性粒细胞的研究表明，血栓素合成酶抑制剂可减少化学发光，这是自由基生成的方法。在血小板和中性粒细胞均存在时，化学发光下降非常显著（28）。在患者严重外周血管病和体内血小板活化的关系上，增强型血栓素合成已进行了说明（29）。吲哚布芬通过剂量依赖性血小板环氧合酶的抑制来抑制花生四烯酸代谢（30,31）。在我们研究中，在患者接受吲哚布芬治疗后，观察到的前列腺素血清值降低之结果和这样的机制一致。此外，在本研究中，我们证明了在缺血再灌注临床条件下，吲哚布芬可以减少激活的中性粒细胞数目。由于注意到TxB2血浆水平和NBT得分之间的显著相关性，人们可以很容易推测，吲哚布芬作用与血小板环氧合酶抑制相关，可减少中性粒细胞。反过来，这会导致从活化中性粒细胞中血栓素合成的减少。吲哚布芬在我们研究中使用剂量情况下，也可能直接抑制TxA2从激活性粒细胞中的产生。最后，应考虑和环氧合酶抑制无关的机制Grasselli及其同事（32）证实，服用吲哚布芬（200毫克，每日两次，4周）可显著改善14名阻塞性血管疾病患者的红细胞（RBC）变形。然而，当给6名血管阻塞性疾病患者服用14天（400毫克剂量，每日三次）时，乙酰水杨酸（和吲哚布芬作用一样，即可以阻断环氧合酶）不影响红细胞过滤性。此发现不符合吲哚布芬TxA2介导血液流变学效应假说，表明代谢产物负责药物的作用，或是与红细胞过滤性有关的其他变量在治疗过程中被修改。已观察到间歇性跛行与白蛋白在血管和肾中通透性的增加有关，这和缺血性或中性粒细胞活化程度（10）呈比例关系。我们的研究证实了这些发现，但未能证明在白蛋白肾脏通透性显著性降低中吲哚布芬的治疗效果，尽管在活化中性粒细胞出现显著减少。跛行时血管损伤的确切发病机制仍然不够清楚。中性粒细胞活化以外的因素可能对肾损伤的发病机制有影响。这种伤伤的主要机制被认为在血管扩张药和血管收缩药之间出现不平衡（33）。服用环氧合酶抑制剂（如布洛芬或阿司匹林）后可能出现肾脏损害，这在临床上证实肾脏需要前列腺素（具有血管扩张作用），尽管这些药物抑制血栓素合成（34）。因此，在我们研究中，通过减少活化中性粒细胞来产生保护肾功能的潜在效应，可能被血栓素和前列腺素合成之间出现的不平衡所抵消。可以预见，我们的研究未能证明治疗1周后两组在跛行时间上存在显著差异。事实上，正和许多临床试验所证实的一样，需要至少6个月的吲哚布芬治疗（200毫克剂量，每日两次），才能显著改善跛行时间（11,35）。我们的研究结果表明，在外周血管闭塞性疾病患者中，口服吲哚布芬能够降低中性粒细胞活化，其机制可能与环氧合酶抑制有关。这种积极性疗效及其所确认的血小板抑制性能，可应用于缺血性血管疾病患者的治疗。参考文献1.Dormandy 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