张小茜-中药常用检验方法介绍

1 中药常用检验方法介绍 药品检验包括性状 鉴别 检查 浸出物 含量测定等 一 性状 药材首先要从其来源进行判断 对于多品种来源的药材 要注 意区分 因为有些检验项目的限度可能不同 比如砂仁 其来源有阳春砂 绿 壳砂和海南砂 它们的挥发油含量测定限度就不同 阳春砂 绿壳砂种子团含 挥发油不得少于 3 0 ml g 而海南砂种子团含挥发油不得少于 1 0 ml g 其次要对药材进行以下几项特征的描述 如形状 大小 长短 粗细 厚度等 色泽 表面 质地 断面 折断面或切断面 气味等 制剂性状的描述要按颜色 外形 气 味依次描述 如有两种颜色 应先 描述浅的 后描述深的 如本品为无色或微黄色的澄清液体 如果用两种色调 复合描述颜色时 以后一种色调为主 如棕褐色 即以褐色为主 黄棕色即以 棕色为主 中药在储存期间颜色往往变深 描述时可根据实际情况规定幅度 如本品为黄色至棕褐色的水丸 二 鉴别 包括经验鉴别 显微鉴别 理化鉴别 1 经验鉴别 用简便易行的传统方法观察样品的颜色变化 浮沉情况以及爆鸣 色焰等 特征 如 麝香中的鉴别 2 取麝香粉末少量 置手掌中 加水润湿 用手搓 之能成团 再用手轻柔即散 不应粘手 染手 顶指或结块 血竭的鉴别 1 取本品粉末 置白纸上 用火隔纸烘烤即熔化 但无扩散的油迹 对光照视呈 鲜艳的红色 以火燃烧则产生呛鼻的烟气 2 显微鉴别 显微镜观察药材切片 粉末或表面等的组织 细胞或内含物等特征 有些 药材既有横切面的显微特征 又有粉末的特征 如黄芪 有些药材则仅有横切 面的特征 如黄连 麻黄等 另外要注意多品种来源的药材 其显微上的差异 如黄连有味连 雅连 云连之分 味连在皮层 中柱鞘有石细胞 髓部无石细 胞 雅连在皮层 中柱鞘 髓部均有石细胞 而云连在皮层 中柱鞘 髓部均 无石细胞 3 理化鉴别 用化学和物理的方法 对药材中所含某些化学成分进行鉴别试验 色谱鉴 2 别都归于理化鉴别 1 用荧光法鉴别 将药材 包括断面 浸出物等 制剂经酸 碱处理后 在紫外光灯下观察所产生的荧光 如芦荟 取粉末 0 5g 加水 50ml 振摇 滤 过 取滤液 5ml 加硼砂 0 2g 加热使溶解 取溶液数滴 加水 30ml 摇匀 显绿色荧光 置紫外光灯 365nm 下观察 显亮黄色荧光 2 用微量升华法鉴别 如大黄微量升华后 可见菱状针晶或羽状针晶 3 显色 沉淀 泡沫反应等 比如黄酮类的盐酸镁粉反应 生物碱的沉淀反 应 皂苷类的泡沫反应等 4 一般鉴别试验 指钙盐 钠盐等鉴别反应 此类鉴别一般列有一项以上的 试验 应逐项进行试验 不得任选其中之一作为依据 如硫酸盐的鉴别共有 3 项 第一项为与氯化钡试液生成白色沉淀 沉淀在盐酸或消酸中不溶解 第二 项为与醋酸铅试液生成白色沉淀 在醋酸铵试液或氢氧化钠试液中不溶解 加 盐酸不能生成白色沉淀 最后一项是硫酸盐与硫代硫酸盐的区别 所以不能只 做前 1 项或 2 项 否则不能下 硫酸盐呈正反应 的结论 5 薄层色谱鉴别 采用最多的一种色谱鉴别方法 A 薄层板 市售薄层板 普通薄层板和高效薄层板 有硅胶薄层板 硅胶 GF254 薄层板 聚酰胺薄膜等 临用前 110 活化 30 分钟 聚酰胺薄膜不需活化 自制薄层板 常用固定相有硅胶 G 硅胶 GF254 硅胶 H 硅胶 HF254 微晶纤维 素等 制备时 一般 1 份固定相和 3 份水在研钵中按同一方向研磨 铺好的薄 层板室温晾干 110 烘 30 分钟 置干燥器中备用 B 点样 一般为圆点状或窄细的条带状 普通薄层板高效薄层板 点样基线距底边 mm 10 158 10 原点直径 mm 32 条带宽度 mm 5 104 8 点间距离 mm 85 展开距离 mm 8 155 8 C 展开 浸入展开剂的深度为距原点 5mm 上行展开 展开前如需溶剂蒸气预 3 平衡 可在展开缸中加入适量展开剂 密闭 保持 5 30 分钟 溶剂蒸气预平衡 后 展开 如需使展开缸达到溶剂蒸气饱和状态 则须在展开缸的内侧放置与 展开缸内径同样大小的滤纸 达到饱和后展开 此外 还有紫外鉴别 香加皮 液相鉴别和气相鉴别 安宫牛黄丸 等 三 检查 常见的有杂质 水分 总灰分 酸不溶性灰分 重金属及有害 元素 砷盐 有机氯农药残留量 含氮量 总固体等 本版药典药材在杂质 水分 总灰分 酸不溶性灰分等四项有了大幅增长 1 杂质 包括来源与规定相同 但其性状或部位与规定不符 来源与规定不同 的物质 无机杂质 如沙石 泥块 尘土等 计算时分别计算三者 如麻黄 银杏叶等 2 水分 第一法第二法第三法第四法 烘干法甲苯法减压干燥法气相色谱法 适用范围 不含或少含挥发 性成分的药品 含挥发性成 分的药品 含有挥发性成 分的贵重药品 贵重药品 取样2 5g 约相当于含 水 1 4ml 0 5 1g 约相当于含 水 0 2g 供试品先破碎成直径不超过 3mm 的颗粒或碎片 直径在 3mm 以下的可以不 破碎 减压干燥法需要通过二号筛 第一法 烘干法 首先将空称量瓶干燥至恒重 再称取 2 5g 一般取 2g 供试品于该称量瓶中 厚度不超过 5mm 疏松供试品不超过 10mm 精 密称重 100 105 干燥 5h 冷却 30 分钟 精密称重 再干燥 1h 冷却 时 间与前一次相同 称重 后两次差异不超过 5mg 为止 恒重的概念 连续两次干燥或炽灼后称重的差异在 0 3mg 以下的重量 一 般叙述为 干燥至恒重 炽灼至恒重 干燥至恒重的第二次及以后各次称重均 应在规定条件下继续干燥 1 小时后进行 炽灼至恒重的第二次及以后各次称重 均应在规定条件下继续炽灼 30 分钟后进行 4 注意 空称量瓶和取样后的称量瓶放入烘箱 应将瓶盖半开或打开 放入 干燥器后应盖住瓶盖 称量瓶在干燥器中放置时间应严格掌握 几次称量放置 时间应一致 以黄柏举例 水分 g 天平型号 天平编号 105 空瓶恒重 21 3342 21 3343 取样 2 0560 105 干燥 5 小时 23 2198 105 干燥 1 小时 23 2187 水分 8 3 标准规定 不得过 12 0 结论 符合规定 21 3342 2 0560 23 2187 计算 100 8 34 2 0560 第二法 甲苯法 以广藿香为例 首先是如何取样 广藿香水分限度是不得过 14 0 按照规定取样约相当 于含水 1 4ml 那么最少要取 10g 按照 14 0 计算 相当含水 1 4ml 水分测定仪包括两部分 短颈圆底烧瓶和水分测定管 全部仪器应清洁 并置烘箱中烘干 将样品放入 500ml 的短颈圆底烧瓶中 加甲苯约 200ml 必 要时可加少许玻璃珠或沸石 防止暴沸 安装好后 从冷凝管顶端加入甲苯 使充满水分测定管 用电热套进行加热 注意回流速度 2 滴 秒 回流时间 水分完全蒸馏出来 水分读数不再增加 这时用甲苯冲洗冷凝管 用铜丝将 5 水分测定管支管壁的水分推下 继续蒸馏 5 分钟 最后应放置 使水分与甲苯 完全分离后方可读数 计算比较简单 用出水量除以取样量即可 水分 天平型号 天平编号 取样 15 0025 g 出水量 1 2ml 水分 8 0 标准规定 不得过 14 0 结论 符合规定 第三法 减压干燥法 样品应过二号筛 空称量瓶与加样后的称量瓶干 燥条件应一致 减压至 2 67kPa 20mmHg 以下持续半小时 室温放置 24 小 时 分别只需称取一个数 不像烘干法每个至少需要两个数 注意 用五氧化二磷干燥时 干燥剂应保持在有效状态 结块或结膜时应 更换 干燥失重与水分减压干燥法的区别 项目干燥失重水分减压干燥法 空称量瓶恒重 至少两个数 与样品相同 称量瓶 样品恒重 至少两个数 减压后 室温放置 24 小时 3 总灰分 首先确定一下炽灼的温度 要求是 500 600 比如固定为 550 将空的 坩埚炽灼至恒重 将样品过二号筛后 称取 2 3g 如须测定酸不溶性灰分 取 样 3 5g 置上述恒重的坩埚中 称定重量 在电炉上炽热至完全炭化 再置 马福炉中至灰化并恒重 根据残留量计算总灰分的百分含量 4 酸不溶性灰分 在灰分的基础上做 取上述灰分 在坩埚中小心地加入稀盐酸 10ml 用表 面皿覆盖坩埚 水浴上加热 10 分钟 表面皿用热水 5ml 冲洗 洗液并入坩埚中 用无灰滤纸滤过 坩埚内的残渣用水洗于滤纸上 不断洗涤 至洗液不显氯化 物反应为止 将洗液滴至 AgNO3 溶液中 不再生成白色沉淀 滤渣和滤纸置同 一坩埚中 干燥 炽灼至恒重 根据残留重量计算酸不溶性灰分的百分含量 以当归为例 实验中坩埚应加盖 6 总灰分 g 天平型号 编号 空坩埚 550 恒重 28 5625 28 5624 取样 3 0245 缓缓炽灼 炭化 550 完全灰化 坩埚 样品恒重 28 6691 28 6688 结果 3 52 标准规定 不得过 7 0 结论 符合规定 28 6688 28 5624 计算 100 3 52 3 0245 酸不溶性灰分 上项所得灰分 加入稀盐酸 10ml 表面皿覆盖 水浴 10 分钟 洗涤 定 量滤纸滤过 残渣用水洗于滤纸上 并洗至洗液不显氯化物反应 滤渣连同滤 纸移至同一坩埚内 干燥 炽灼恒重 550 坩埚 样品恒重 28 5788 28 5787 结果 0 5 标准规定 不得过 2 0 结论 符合规定 28 5787 28 5624 计算 100 0 54 3 0245 5 重金属及有害元素 按照附录铅 镉 砷 汞 铜测定法测定 2005 版药典收载的六个品种要 做这一项 否则不能算全检 六个品种是 黄芪 甘草 白芍 丹参 金银花 西洋参 测定方法有两种 任选其一 原子吸收分光光度法 AAS 和电感耦合 7 等离子体质谱法 ICP MS 虽然后者最为先进 但其价格很高 所以目前还 是以 AAS 应用最为普遍 按照原子化方式不同 分为四种测定方式 Cu 采用 火焰法 Hg 采用冷吸收法 Pb Cd 采用石墨炉法 As 采用氢化物法 供试品消解的方法有三种 A 微波消解 B 湿法消化 C 干法灰化 测定元素消解方法 铅A B C 镉A B C 砷A B 汞A B 需控制温度 120 左右 铜A B C 三种消解方法 A 微波消解 取样 0 5g 加硝酸 5 7ml 微波消解炉内进行消解 以温度控制方式进行消解最好 严格遵守操作规程和安全使用守则 目前 最先进的元素分析样品前处理方法 在 2005 版药典中列为首选方法 第 一法 B 湿法消解 以硝酸 高氯酸 4 1 的混合溶液为消化液 电加热板通过调整电压 控制反应液温度以硝酸 高氯酸 4 1 的混合溶液为 消化液 C 干法灰化 样品 干燥 除去水分 450 500 高温灰化 放冷后加少量硝酸润湿 在 450 继续灰化 放冷 以 2 硝酸溶解 6 农药残留量测定 农药分类 按照用途 杀虫剂 杀螨剂 杀菌剂 杀线虫剂 除草剂 植物生长调节剂等 8 按照结构特点 有机氯类 有机磷类 菊酯类 氨基甲酸酯类 有机硫类 有 机杂环类 砷汞类等 农药残留量测定 有机氯农药残留量 有机磷类农药残留量 拟除虫菊酯 类农药残留 有机氯类农药残留量按照附录农药残留量测定法中的有机氯类农药残留量 测定法测定 2005 版药典收载的品种有黄芪 甘草 测定六六六 总 BHC 滴滴涕 总 DDT 五氯硝基苯 PCNB 限度 六六六 总 BHC 千万分之二 滴滴涕 总 DDT 千万分之二 五氯硝基苯 PCNB 千万分之一 附录农药残留量测定法中还有有机磷类农药残留量测定法和拟除虫菊酯类 农药残留量测定法 但正文中尚未涉及相关品种 气相色谱法是目前农药残留分析中的最重要的检测手段 主要用于具有一 定挥发性的农药检测 目前 70 以上农药残留量分析是基于气相色谱法完成的 采用的检测器 电子捕获检测器 ECD 只对具有电负性的物质有响应 检测灵敏度可达 1 10 14g ml 线性范围可达 104 在含有卤素的有机氯类 拟除虫菊酯类农药残留分 析中获得广泛的应用 氮磷检测器 NPD 只对含氮 磷的化合物有响应 灵敏度较高 线性范围 103 104 是有机磷类和有机氮类农药残留检测的首选检测器 火焰光度检测器 FPD 广泛用于含硫 含磷类农药残留量的检测 除重金属和农药残留问题外 中药用硫磺熏 以漂白 增艳 防虫虽是传 统加工方法 但现代研究证明由此会使中药材残留大量的 SO2及 As Hg 等重金 属 本版药典将山药 葛根等加工方法中的硫黄熏删除 即表示中药材以后不 允许再用硫黄熏 并拟将在 2005 年版增补本中增加二氧化硫残留量测定法 四 浸出物 分为水溶性浸出物 醇溶性浸出物 挥发性醚浸出物 前两 者中又包含有冷浸法和热浸法 样品均需过二号筛 挥发性醚浸出物中 样品 需过四号筛 9 水溶性浸出物醇溶性浸出物挥发性醚 浸出物 取样量冷浸法 4g 热浸法 2 4g 2 5g 提取溶剂水规定浓度乙醇乙醚 提取方式冷浸 回流索氏提取 提取时间冷浸法 前 6 小时内时时振摇 再静置 18 小时 热浸法 静置 1 小时 回流 1 小时 回流 8 小 时 注意事项 加入的提取溶剂量与取样量有关 冷浸法取样 4g 即加入溶剂 100ml 热浸法取 2g 时加 50ml 溶剂 取 4g 时加 100ml 挥发性醚浸出物原来 采用的时硫酸干燥器 这次改为五氧化二磷干燥器 浸出物的计算药材一定要 按干燥品计算 以当归为例 浸出物 天平型号 编号 1 2 取样 2 0035 2 0052 精密加入 70 乙醇 50ml 密塞 称重 135 27 152 40 静置 1 小时 回流 1 小时 放冷 用 70 乙醇补足减失的重量 135 27 152 40 摇匀 滤过 精密量取 25ml 蒸干 空皿恒重 37 2236 36 5022 37 2235 36 5024 皿 样 105 3hr 37 7787 37 0584 计算 37 7787 37 2235 1 100 60 24 2 0035 50 25 1 8 0 37 0584 36 5022 2 100 60 30 2 0052 50 25 1 8 0 10 平均 60 3 符合规定 不得少于 45 0 需要注意的是 药材浸出物计算时一定要扣除水分 而制剂中按要求计算 如果在标准中提到 本品按干燥品计算 则需扣除水分 否则不用 五 含量测定 1 高效液相色谱法 HPLC 1 色谱柱 最常用的填充剂为化学键合硅胶 反相色谱系统使用非极性填充 剂 以十八烷基键合硅胶最为常用 即 C18 其他还有 C8 柱 氰基柱 氨基柱 等 正相色谱系统使用极性填充剂 常用的填充剂有硅胶等 使用时要注意流 动相的 pH 应为 2 8 大于 8 时可使载体硅胶溶解 小于 2 时与硅胶相连的化学 键合相易水解脱落 对于新的色谱柱 一般采用甲醇进行洗脱 2 检测器 最常用的检测器为紫外检测器 其他常见的有二极管阵列检测器 荧光检测器 示差检测器 蒸发光散射检测器 电化学检测器和质谱检测器 3 流动相 可采用固定比例 等度洗脱 或按规定程序改变比例 梯度洗脱 的溶剂组成作为流动相系统 若使用 C18 柱 不管是分析还是冲柱子 流动相 中有机溶剂的比例通常应不低于 5 柱子使用后要及时进行冲洗 一般冲柱子 使用的溶剂为 5 甲醇 递增的不同浓度的甲醇 甲醇 最后柱子一般停留在 甲醇或高浓度乙腈中 并将柱子两头封好 避免污染 损坏柱子 当我们使用 含盐流动相测定样品时 应当先用低醇水洗脱 以免柱子中的甲醇与流动相中 的盐作用 形成结晶 堵塞柱子 同样 使用后先以低醇水冲洗 试验中 除固定相种类 流动相组成 检测器类型不得改变外 其余如色 谱柱的内径 长度 固定相牌号 载体粒度 流动相流速 混合流动相各组成 比例 梯度洗脱程序中的时间长度 柱温 进样量 检测器的灵敏度等 均可 适当改变 系统适用性试验中 要考察色谱柱的理论板数 分离度 重复性 拖尾因子 举例 A 等度洗脱 以黄芩为例 色谱柱为 C18 柱 流动相为甲醇 水 磷酸 47 53 0 2 配制 以 1000ml 为例 取甲醇 470ml 加入超纯水 530ml 再加磷酸 2ml 混匀 脱气 11 如果仪器有在线脱气装置 混匀就可使用 无在线脱气就需要脱气 脱气的方 式有多种 比如超声 过滤膜 通氦气 前两种比较常用 如果流动相中含盐 或离子对时 即使有在线脱气也要过滤膜 对照品溶液的制备 黄芩苷对照品 60 减压干燥 4 小时 按规定浓度配制 标准操作规程要求配制 2 份 但中药对照品比较贵 目前可以配制 1 份 但遇 到不合格样品时 需配 2 份复检 供试品溶液的制备 按标准制备 实验中 要考察系统适用性 首先是重复性 对照品连进 5 针 计算 RSD 相对标准偏差 一般要求 RSD 小于 2 0 其次是理论板数 用供试品中 主成分峰 黄芩苷峰 计算 有些仪器可自动给出 计算按下式 n 5 54 tR W 2 n 应大于规定的 2500 分离度和拖尾因子有时根据峰形 即可判断 若两峰完 全分离 分离度一定大于 1 5 这两项药典上都有公式 不再详细介绍了 黄芩苷的含量要按干燥品计算 所以随行要做水分 扣除水分即可 计算 A 样品 对照品取样量 稀释倍数 进样量 100 A 对照品 样品取样量 稀释倍数 进样量 1 水分 B 梯度洗脱 人参 流动相 A 乙腈 B 水 时间 分钟 A B 0 351981 35 5519 2981 71 55 702971 70 10029 4071 60 在这个流动相中 有等度 有梯度 2 薄层色谱扫描法 TLCS 12 使用市售薄层板 测定时可根据不同薄层扫描仪的特点 按照规定方式扫 描测定 一般选择反射式 采用吸收法或荧光法 扫描方法可采用单波长扫描 或双波长扫描 供试品斑点的量应在线性范围内 必要时可适当调整供试品溶 液的点样量 供试品与对照品应同板点样 展开 扫描 测定和计算 通常采 用线性回归二点法计算 供试品与对照品应交叉点样 供试品平行操作 2 份 每份点样不得少于 2 个 对照品每一浓度不得少于 2 个 扫描时 应沿展开方 向扫描 不可横向扫描 注意 对于无须显色的样品来说比较简单 比如中青黛中靛玉红的测定 只须在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板 而对于需要显色的样品来说 结果的 准确与否与显色的均匀