实验方法-AFLP实验操作指南.doc

AFLP实验操作指南一、 实验操作流程1 DNA样本的准备把DNA样本用紫外光（或荧光）分光光度计精确的测取浓度，然后将其稀释成浓度为50ng/ul，体积为50ul的溶液，如果DNA样本不多，在保证浓度的情况下体积可以适当减少。2 DNA酶切（1） 反应体系 成 分体 积（ul）双蒸水11.4缓冲液（Yellow buffer）4EcoRI (10u/ul)0.5Mse I (10u/ul)0.1模板DNA（50ng/ul）4总体积20（2） 反映程序37反应3个小时，最后保存于4。（3） 检测 取46ul酶切液进行酶切效果检测，跑出的带以弥散状、无明显主带为好。琼脂糖电泳用6loading buffer：名称用量（武汉）用量（广州）Ficell 400 （蔗糖）12g40gEDTA(0.5M PH=8.0)12ul10% SDS（十二烷基四磺酸钠）6mlBromphenol Blue（溴酚蓝）25mg25mgXylene Cyanole FF（二甲苯青FF）25mg25mgddH2Oadd to 100ml100ml3 连接接头（1） 接头的制备a、 按公司说明书将引物单链稀释成高浓度(一般是5OD稀释成1650ng/ul)溶液储存于20冰箱。b、 取部分引物单链稀释成100uM/l，然后两条正反单链混合，体积比如下：10ul EcoR1正链、10 ul EcoR1反链和180ulTE混合成200ulEcoR1接头；100ul Mse I正链、100 ul Mse I反链混合成200ul Mse I接头。 c、反应程序： 95下5min，65下10min，37下10min，25下10min，保存于4。最终储存于20冰箱。（2） 连接反应体系 成 分体 积（ul）双蒸水7.6反应缓冲液（T4DNA连接酶自带）2.5EcoR1接头1Mse I接头1T4DNA连接酶（5u/ul）0.4酶切反应后溶液12.5总体积25（3） 反应程序 21保存过夜。附：酶切和连接之间不要停止。（4） 稀释按1：10的比列稀释，已稀释的和未稀释的均可长时间储存于20备用。实验进行到此处可以暂停。4 预扩增（1） 反应体系成 分体 积（ul）双蒸水10.3缓冲液（10x Tag酶自带）2dNTPs(10Mm)0.4EA00(50ng/ul)1MC00(50ng/ul)1MgCl2(25mM/l)( Tag酶自带)1.2Tag聚合酶（5u/ul）0.1稀释后已连接DNA模板4总体积20（2） 反映程序 a、94 2min b、94 30s c、56 1min d、72 1min e、重复bd 25次 f、72 5min g、保存于4（3） 稀释取部分预扩增后溶液按1：25的比例稀释(稀释比例可以自己适当调整)。将已稀释的和未稀释的保存于20储存。实验进行到此处可以暂停。（4） 检测取未稀释的预扩增产物46ul进行琼脂糖电泳检测。5 选择扩增（1） 反应体系成 分体 积（ul）双蒸水1.6缓冲液（10x Tag酶自带）1dNTPs(10mM)0.2EA-(15ng/ul) *2MC-(15ng/ul) *2MgCl2(25mM/l)( Tag酶自带)0.6Tag聚合酶（5u/ul）0.1预扩增稀释后模板2.5总体积10*:EA-,MC后面两个碱基因不同引物对而不同。（2） 反应程序a、第1个循环：94 4min, 94 30s, 65 1min, 72 1min；b、第213个循环：94 30s, 65 1min, 72 1min（退火温度每隔一个循环降低0.7）；c、第1436个循环：94 30s, 56 1min, 72 1min；d、72 5min, 4保存。6变性 （1） 变性剂（Loading buffer）配方 组 分体 积去离子甲酰胺（Deionized Formamide）50mlEDTA(0.5M PH=8.0)1ml二甲苯腈FF(Xylene Cyanole FF)0.125g溴酚蓝（Bromphenol Blue）0.125g（2） 变性 将3/4体积（或者1/2即可）的变性剂加入PCR反应产物，95变性5min，立刻保存于4或置于冰上直到上样电泳。（3）新的变性剂配方组 分体 积终浓度去离子甲酰胺（Deionized Formamide）95ml95%溴酚蓝（Bromphenol Blue）50mg0.05%二甲苯腈FF(Xylene Cyanole FF)50mg0.05%NaOH (100M)1ml(或直接称0.04g)1M 7. 制胶溶液 （1） 一块胶的配方将12ml 5X TBE和25.2g尿素（Urea）混合加水定容至51ml，向其中加入9ml 40的丙烯酰胺溶液，400ul 10%过硫酸胺（APS）和30ul四甲基一二胺（TEMED）。（2） 各组分配方 5X TBE：54g Tris碱（Tris-base）,27.5g硼酸（B-acid）和20mlEDTA(0.5M,PH=8.0)混合定容至1000ml。（室温放置） 尿素储备液：270g尿素，加入120ml5X TBE，再加少量的水即可定容到510ml。切记加水要慢！非常容易过量，大约100ml左右即可。（室温放置） 40丙烯酰胺溶液：2g甲叉丙烯酰胺（N、N-Methylene Bisacrylamide）,38g丙烯酰胺（Acrylamide）混合加水定容至100ml。（4度保存） 10过硫酸胺溶液：1g过硫酸胺（APS）加水定容至10ml。（4度保存） 8. 亲水和疏水处理及灌胶 （1） 长玻璃（亲水玻璃）处理： a、亲水剂制备：1.5 ml 95%酒精，3ul亲水硅烷（Binding Silane）,7.5ul冰醋酸混合。此为一块板用量。 b、洗净玻璃板，以水沿玻璃板均匀下流为好。待晾干后再开始亲水处理。 c、先用约2ml 95的酒精涂擦玻璃板，保证板子清洁。d、用手巾纸浸亲水剂涂擦玻璃板。 e、干燥5分钟，用约2ml 95的酒精再轻轻涂搽玻璃板（以均一方向）然后再垂直方向涂擦一遍。 e、晾干约10min（不少于10min）。 （2） 短玻璃（疏水玻璃）处理 a、换手套，以防亲水剂和疏水剂交叉污染。如果出现污染情况，可将玻璃浸入10的NaOH溶液中。 b、洗净玻璃板，以水沿玻璃板均匀下流为好。待晾干后再开始疏水处理。c、 用纸巾浸疏水剂(Repel-silane ES)涂搽玻璃板，要均匀。d、 用约2ml 95的酒精涂擦玻璃板，保证板子清洁。 e、干燥5分钟，用约2ml 95的酒精再轻轻涂擦玻璃板（以均一方向）然后再垂直方向涂擦一遍。 f、晾干约10min（不少于10min）。 g、疏水处理做一次大约可以跑5块胶再做或当出现轻微扯胶情况时再做。 （3） 将长玻璃放在水平的泡沫垫上，亲水面向上，将两个胶条平行分置于其较长的两边，然后轻轻放上疏水玻璃，疏水面向下。这样在两玻璃间形成了一个矩形空隙。用夹子夹住固定。 （4） 用胶带将左右两边和底边封上，留出插梳子的边（有凹边的那一边），封时要均匀不留气泡。 （5） 将梳子插入有凹边的缝隙，看是否容易均匀，不行要适当调整。 （6） 将有凹边的那边稍稍垫高，然后配胶用注射器筒灌入，要从一边均匀灌入，胶中不留气泡。 （7） 将梳子平直边插入凹口缝隙，以形成一个胶的平直端。注意其端线应与玻璃板的长边垂直。 （8） 让胶至少聚合两个小时。 9. 电泳 （1） 将电泳槽底盒装入400ml 1X TBE 缓冲液，上盒装入500ml 1X TBE缓冲液。 （2） 轻轻拔掉梳子，固定玻璃于电泳仪上，到入上盒缓冲液，用1000ul枪冲洗凹口缝隙，冲干净为好，65W预电泳30min。 （3） 预电泳完毕断开电源，再次冲洗缝隙，然后将梳子齿端插入凹口缝隙，其齿尖端轻轻的插进胶中，以构成点样孔。 （4） 点入3.04.5ul变性后的样品。 （5） 65W电泳约两个半小时，直到上边那条浅蓝色的指示带到离顶端2/3为好。 （6） 电泳完毕，分开两玻璃板，将固着胶的亲水板放入预先准备好的10的醋酸固定液中浸泡固定脱色。 10. 银染 （1） 脱色：2升10冰醋酸溶液（固定/停止液），轻轻摇20分钟至全部脱色。附10%冰醋酸配方：200ml冰醋酸与1800ml双蒸水混合。 （2） 冲洗：用双蒸水漂洗三次，每次5分钟。 （3） 染色：加染色液，染色2030分钟。附染色液配方（用前10分钟配）：在两升双蒸水中加入2g AgNO3，3ml 37甲醛。 （4） 漂洗：双蒸水冲洗胶板不超过5秒钟。 （5） 显影：在2升冷却的显影液中轻轻的摇动，直至带纹的出现。附显影液配方：在2升双蒸水中加入60g NaCO3，完全溶解后放入4冰箱冷却至4（可在使用前5小时配）；使用前5分钟加3ml甲醛，10mg/ml硫代硫酸钠400ul。 （6） 定影：加入等体积的固定/停止液（即脱色中所用的），固定2分钟。 （7） 冲洗：用双蒸水冲洗2次，每次2分钟。 （8） 胶的干燥：室温下自然干燥。 10. 新银染方法：（1）将凝胶浸在固定液（10% 乙醇，0.5% 冰醋酸）中5 min；（胶面向下？）（2）将凝胶浸在染色液 （10%乙醇, 0.5% 冰醋酸, 0.2% AgNO3）中8 min；（胶面向下？）（3）在水中短时间地冲