白细胞疾病的实验诊断↑◇◇.doc

白细胞疾病的实验诊断第一节 概 述 一、白血病疾病诊断试验的应用 外周血细胞检测、骨髓细胞学检测、骨髓病理学检测、细胞免疫性及遗传学检测二、常见白细胞良性疾病分类：白细胞减少症中性粒细胞功能异常症传染性单核细胞增多症单核细胞吞噬功能异常症 如反应性组织细胞增多症类白血病反应三、白细胞肿瘤性疾病分类骨髓增殖性肿瘤骨髓增生异常综合症急性髓系白血病和相关前体细胞肿瘤前体淋巴细胞肿瘤成熟B-细胞肿瘤成熟T和NK-细胞肿瘤霍奇金淋巴瘤等第二节 白细胞疾病的常用实验检测 一、血液常规 检验二、骨髓细胞形态学 检验适应证 造血系统疾病考虑某些寄生虫感染可能原因未明的系列表现：发热；肝、脾、淋巴结肿大；骨痛或骨质破坏；皮肤损害；血沉异常增快，或蛋白尿。禁忌症：凝血因子缺乏患者如血友病。标本采集骨髓穿刺取材部位：髂后、髂前上棘，胸骨，棘突或局部病灶。骨髓液采集：涂片：0.2ml；骨髓培养：23ml，抗凝。涂片染色：瑞氏染色。【参考范围】判断骨髓增生程度骨髓增生程度以骨髓中有核细胞的数量来反映，一般直接在低倍镜下观察骨髓成熟红细胞与有核细胞之间的比例作出判断。 Proliferative degree of BM nucleated cellsProliferative degreeErythrocytes：Nucleated cellscausesExtreme activ Proliferation1：1leukemiaObvious Proliferation10：1leukemia、hyperplastic anemiaActive Proliferation20：1Normal BM、anemiaHypoplasia50：1Hypoplasic anemiaExtreme hypoplasia300：1Acute aplastic anemia骨髓增生程度分级有核细胞：成熟红细胞有核细胞占全部细胞百分率有核细胞/1000个成熟红细胞常见原因范围平均范围平均极度活跃1:0.52.01:150238.96521.07351.96白血病明显活跃1:5121:101043.78230.77114.51增生贫血增生活跃1.16321:2011021.5363.6735.34正常骨髓增生减低1:35701:500.517.4119.6110.53慢性再障极度减低1:3001:3000.51.967.414.85急性再障正常骨髓各种细胞及数量粒细胞系统：约占有核细胞的40%60%。原粒细胞2%，早幼粒细胞5%，中幼粒、晚幼粒细胞各约15%，杆状核粒细胞分叶核粒细胞；嗜酸性粒细胞5%，嗜碱性粒细胞1%，大多为成熟型；细胞形态染色基本正常。红细胞系统：约占有核细胞的20% 原红细胞1%，早幼红细胞5%，以中、晚幼红细胞为主，各占10%左右。细胞形态染色基本正常。成熟红细胞大致正常。粒红比值(M/E)：粒系细胞与幼红细胞百分率之和的比值。24:1。淋巴细胞系统：约占有核细胞的20%，小儿可达40%成熟淋巴为主，原淋、幼淋巴细胞很少见。巨核细胞系统：1.5cm3cm的涂片中有735个。原巨05%，幼巨010%，颗粒巨10%50%，产板巨20%70%，裸核巨030%。其他细胞：单核细胞4%，成熟型为主。浆细胞2%，成熟型为主。纤维细胞、内皮细胞、脂肪细胞、肥大细胞、成骨细胞等非造血细胞成分。核分裂细胞为0.1%。【临床意义】造血系统疾病某些血液病及其相关疾病某些寄生虫感染性疾病恶性肿瘤骨髓转移某些类脂质沉积病【评价】急性白血病时，骨髓内大量低分化的白血病细胞在分类有困难时，可根据外周血中某些分化较好的细胞来推测出原始细胞的系列归属。鉴别诊断：某些疾病血象相似而骨髓变化显著不同，如非白血性白血病与再障；某些疾病骨髓无明显变化而血象变化显著，如传单；某些疾病血象无明显变化而骨髓变化显著，如多发性骨髓瘤。疗效判断：如白血病的疗效判断需要同时观察骨髓和血象。骨髓中原始或幼稚细胞5%，外周血中原始或幼稚细胞消失。三、骨髓病理学 检查【正常骨髓的组织形态学】造血组织幼红细胞岛定位于骨小梁间区内静脉窦窦壁四周，幼红细胞以巨噬细胞为中心，内层至外层逐渐分化成熟。粒细胞系细胞主要位于远离静脉窦之造血索状组织深部，原粒细胞与早幼粒细胞常单个分布于骨小梁旁以及小动脉和微动脉四周，较成熟时定位于小梁间区。巨核细胞多聚集于静脉窦窦壁外。淋巴细胞和单核细胞常定位于造血主质小动脉四周。骨质。间质脂肪细胞、血管系统、神经纤维、结缔组织间基质、网状纤维支架及网状-巨噬细胞【临床意义】较全面地衡量造血细胞增生程度，以及造血组织、脂肪组织和纤维组织的容积比例，如再障、骨髓增殖性肿瘤。骨髓“干抽”时，骨髓病理可反映造血情况及纤维组织增生情况，如骨髓纤维化。协助诊断，如骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病、淋巴瘤累及骨髓。活检比涂片有助于预测疾病的预后，如准确地反映白血病治疗效果。可以观察骨髓组织学变化，如骨小梁变化、转移瘤、血管栓塞、骨髓坏死等。【常见血液病的骨髓病理学】1）骨髓纤维化（MF） MF是骨髓造血组织被纤维组织增生所替代，伴有肝脾等髓外造血为特征的一组疾病。骨髓活检呈不同程度的纤维化。根据骨髓纤维组织增生程度，病理学分为三期： 细胞期：骨髓纤维细胞及成纤维细胞增生，总面积占切片的1/3。造血细胞大致正常，网状纤维染色“+”。胶原形成期：纤维细胞及胶原纤维面积占2/3，造血细胞显著减少，网状纤维染色“+”。硬化期：胶原纤维广泛增生，造血细胞显著减少或消失，网状纤维染色“+”。2）骨髓增生异常综合征（MDS）MDS是一组克隆性造血干细胞疾病，其特征为一种或多种血细胞减少伴病态造血、无效造血和调亡增强。MDS骨髓病理表现如下：基质改变：血窦变性、破裂，间质水肿，网状纤维增多。造血组织增生极度活跃或正常，少数低下。造血细胞定位紊乱与形态异常：幼红细胞“热点”现象，即同一阶段幼红细胞成堆分布。形态异常成熟障碍如巨幼样变、奇数核。粒系未成熟细胞异常定位（ALIP），原粒细胞和早幼粒细胞在小梁间形成集丛。核浆发育失衡。巨核细胞分布异常并出现形态改变如淋巴样小巨核细胞。3）再生障碍性贫血造血细胞减少，非造血细胞增多；脂肪组织增多。四、细胞化学染色主要用于了解细胞代谢、细胞种类鉴别，尤其是白血病的诊断与鉴别诊断。髓过氧化物酶染色血细胞中的髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)经染色后形成蓝黑色的颗粒，沉着于胞质中。胞质中无蓝黑色的颗粒为阴性反应，出现小颗粒、分布稀疏为弱阳性反应，颗粒粗大而密集为强阳性反应，用、表示，计数100个原始和幼稚细胞，计算阳性率并可进行积分值计算 。【参考范围】 原粒细胞呈阴性反应，早幼粒以下呈阳性反应，越成熟阳性越强，中性粒细胞阳性率98%；嗜酸性粒细胞强阳性，嗜碱性粒细胞阴性。原单细胞呈阴性，幼单核细胞和单核细胞弱阳性。 淋巴细胞、红细胞系、巨核细胞系呈阴性。【临床意义】主要用于急性白血病类型的鉴别。 急性髓系白血病（AML）：M1和M0部分病例可呈阴性；M2阳性率可20%；M3阳性程度最强；急性粒单细胞白血病（M4）阳性率可20%； 急性单细胞白血病（M5）呈弱阳性或阴性反应；急性巨核细胞白血病（M6）呈阴性。急性髓细胞白血病（AML）分型 FAB分型（ANLL） WHO分型 M0, 原始细胞30%,MPO3% AML-md, MPO3%M1, 原粒细胞90%,MPO3% AML-wom, MPO 3%M2, 原粒细胞30%,MPO+ AML伴t(8;21)(q22;q22), AML-wmM3, 早幼粒细胞30%,MPO+APL伴t(15:17)(q22;q12)M4, 原粒及原幼单细胞各30%,MPO+， M4Eo AMML, AML伴Inv/del(16)(q22) M5a, 原单细胞80%, M5b, 30%, NSE+AMOLM6, 原幼红细胞50%,原粒20%AEL M7, 原巨细胞30%,PAS+AMegL 原巨20%,急性淋巴细胞白血病（ALL）呈阴性反应，或阳性率3%。【评价】MPO染色结果有时与免疫组化分析MPO抗原可能存在阳性结果不一致。各种急性白血病诊断时仅计数原始和幼稚细胞的MPO阳性率。髓系白血病与淋巴细胞白血病以阳性率3%为界。酯酶染色酯酶包括萘酚AS-D氯乙酸酯酶（NAS-DCE，为粒细胞所特有，又称特异性酯酶）、-乙酸萘酚酯酶（-NAE，为非特异性酯酶）和-丁酸萘酚酯酶（ -NBE，为单核细胞酯酶），经染色后各种酶在不同种类细胞中表现出来。主要用于血细胞的识别及白血病的诊断与鉴别诊断。【参考范围】The esterase stain of normal bone marrow cellsCellular typesNAS-DCE-NAE-NBEMyeloblasts/Promyelocytes/Neutrophils/monoblasts/Promonocytes/Lymphocytes/Nucleated erythrocytes/megakarocytes【临床意义】急粒白血病（M1、M2）的原粒细胞NAS-DCE染色呈阳性，-NAE呈阴性或弱阳性反应，-NBE为阴性。M3 的异常早幼粒细胞NAS-DCE染色呈强阳性，-NAE呈阴性或弱阳性反应，但阳性不被氟化钠（NaF）抑制。急单白血病（M5）原单及幼单核细胞-NAE和-NBE呈阳性或强阳性反应，但酶活性可被NaF抑制；NAS-DCE染色呈阴性或弱阳性。可用于两种白血病的鉴别。中性粒细胞碱性磷酸酶染色白细胞的碱性磷酸酶主要存在于中性粒细胞的胞质中，称为中性粒细胞碱性磷酸酶（NAP）。其活性在某些血液病及感染性疾病中可发生变化，对这些疾病的诊断有重要价值。成熟的中性粒细胞（分叶核与杆状核）呈阳性反应，用、表示阴性、阳性反应细胞分级、积分。一般计数100个成熟中性粒细胞，计算积分及阳性率。【参考范围】 阳性率10%40%，积分751分，各实验室有自己的标准。【临床意义】生理因素：NAP活性受应激状态、月经、妊娠等因素影响。病理情况主要用于:感染性疾病鉴别 急性细菌（尤其化脓菌）感染NAP活性显著增高；慢性感染轻度增高。病毒感染一般不增高。 慢粒白血病（CML）与中性粒细胞类白血病反应鉴别：CML时NAP积分明显降低，积分可为0，CML急变后NAP活性增高，病情缓解期NAP活性可恢复正常；类白血病反应时NAP积分明显增高。 再障（AA）与阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）鉴别： AA时NAP活性增高；PNH时减低。真性红细胞增多症与继发红细胞增多症鉴别： 真红NAP活性增高；继发红细胞增多症NAP活性无明显变化。糖原染色血细胞中的糖类物质用过碘酸-雪夫（periodic acid-Schiff，PAS）反应显示。阳性表现为红色颗粒分布于胞质中。分为阴性、弱阳性、阳性、和强阳性反应。对部分血液病的诊断有一定意义。【参考范围】粒系细胞：原粒及早幼粒细胞PAS呈阴性，自中幼粒细胞后PAS呈阳性。巨核细胞呈强阳性。淋巴细胞、单核细胞呈弱阳性。幼红细胞呈阴性反应。【临床意义】急性白血病：ALL白血病细胞呈强阳性；ANLL-M1、M2、M3多为阴性； ANLL-M5呈弱阳性；ANLL-M6强阳性。成熟淋巴细胞增殖性疾病：慢性淋巴细胞白血病多呈阳性反应；病毒感染淋巴细胞呈阴性反应，如传单。幼红细胞增生性疾病：MDS时，幼红细胞可呈阳性反应；MA、HA、AA时幼红细胞多呈阴性反应。 几种常见急性白血病的细胞化学染色结果急淋急粒急单红白血病MPO+ + + + +视合并的白细胞类型而定NAS-DCE + + + +同上-NAE + + + + + 同上-NAE-NaF不被NaF抑制被NaF抑制同上NAP增加减少正常或增加同上PAS+，粗颗粒状或块状或+，弥漫性淡红色或+，弥漫性淡红色+ + +铁染色人体内的铁有一定量以铁蛋白和含铁血黄素的形式贮存在骨髓的单核-吞噬细胞系统内，幼红细胞的线粒体中也含有含铁血黄素。这些铁在酸化的低铁氰化钾溶液中反应，发生普鲁士蓝反应生成蓝色的铁氰化铁沉淀，定位于含铁的部位。细胞外铁：指贮存在骨髓小粒中单核-吞噬细胞系统内的铁。骨髓小粒上见到浅蓝绿色均匀无形物质，或呈蓝色或深蓝色的小球状、粗颗粒状或蓝黑色的小块状物质。 细胞外铁按阳性反应的强度分级： “”骨髓小粒无蓝色显现 “1+”少量的铁颗粒 “2+”较多的铁颗粒和铁小珠 “3+”很多铁颗粒、小珠和少数兰黑色小块 “4+” 极多铁颗粒和小珠，并有很多密集成堆的小块。细胞内铁： 指幼红细胞内的铁。正常幼红细胞（主要是晚幼红细胞）的细胞核周围可见到15个呈蓝色的细小铁颗粒。含有铁颗粒的幼红细胞称为铁粒幼红细胞。分为型（12颗）、（35颗）、 （610颗）。 计数100个幼红细胞，记录铁粒阳性的幼红细胞数，即为铁粒幼红细胞的百分率。环状铁粒幼细胞：如含粗大深染的铁粒在6个以上，并环绕细胞核排列超过核周半圈以上的。【参考范围】 细胞外铁 1+2+ 细胞内铁 19%44%，型为主，无环状铁粒幼细胞。【临床意义】（1）鉴别缺铁性贫血与非缺铁性贫血：缺铁性贫血时细胞外铁减少或消失，铁粒幼细胞减少（常15%）。非缺铁贫如珠蛋白生成障碍性贫血、HA、MA、AA等外铁增加，常2+，铁粒幼细胞多增高。感染性贫血时，外铁正常或增加，铁粒幼细胞减少，提示铁利用障碍。诊断铁粒幼细胞性贫血：铁粒幼细胞性贫血时，细胞外铁显著增高，骨髓中出现环状铁粒幼细胞，其常占幼红细胞的15%以上。(3) MDS-RAS：难治性贫血伴环形铁粒幼细胞增多（RAS）铁粒幼细胞增多，环状铁粒幼细胞占幼红细胞的15%以上。五、白细胞免疫表型 分析细胞免疫标记（表型）检测是用单克隆抗体及免疫学技术对细胞膜表面和/或细胞质存在的特异性抗原进行检测，借以分析细胞所属系列，分化程度和功能状态的一种方法。正常骨髓细胞的免疫学标志T淋巴细胞根据免疫学标志特点T淋巴细胞分四个阶段：第阶段为原始或幼稚细胞，第阶段为成熟细胞Antigen expression of normal T-lymphoid cellsphases of T-cellexpression level of T-lymphoid AntigenCD1a、 CD2、CD5、CD7、CD10、 CD34、CD45CD1a、 CD2、 CD4/8、 CD5、CD7、CD10、 CD45CD1a、 CD2、 CD3、 CD4/8、 CD5、CD7、CD10、CD45CD2、 CD3、 CD4/CD8、 CD5、CD7、CD10、CD45 B淋巴细胞分四个阶段：第阶段为B祖淋巴细胞，第阶段为前B淋巴细胞， 第阶段未成熟B淋巴细胞，第阶段为B成熟细胞。Antigen expression of normal B-lymphoid cellsphases of B-cellexpression level of B-lymphoid AntigenCD10、 CD19、 CD20、CD34、CD45 、TdTCD10、 CD19、 CD20、CD34、CD45CD5 、CD10、 CD19、 CD20、CD22、CD45CD19、 CD20、 CD22、 CD23、CD45粒系细胞分五个阶段：第阶段为原粒细胞，第阶段为早幼粒细胞， 第阶段为中性中幼粒细胞，第阶段为中性晚幼粒细胞，第阶段为中性成熟粒细胞。Antigen expression of normal myeloid cellsphases of M-cellexpression level of M-cell Antigen CD13、 CD33、 CD34、CD45 CD13、 CD15、 CD33、CD45 CD11b 、 CD13、 CD15、CD33、CD45 CD11b、 CD13、 CD15、 CD16、 CD33、CD45 CD11b、 CD13、 CD15、 CD16、 CD33、CD45 单核系细胞：分三个阶段：第阶段为原单细胞，第阶段为幼单细胞， 第阶段为成熟单核细胞。红系细胞 分三个阶段：第阶段为原红细胞，表达CD45、CD71 。第阶段为幼红细胞，表达CD71和血型糖蛋白。第阶段为脱核红细胞，表达血型糖蛋白。 巨核系细胞 表达CD41、CD42、CD61等。【临床意义】急性白血病/淋巴瘤ALL与AML细胞免疫表型特点。ALL和AML的免疫表型CD7 CD13 CD19 CD33 HLA-DR TdT MPOe AML -/+a + - + +-c +B-ALL -+-+d -T-ALL +-b +-白血病亚型诊断。 急性淋巴细胞白血病的免疫表型特点系列亚型主要的抗原标记系列亚型主要的抗原标记B系列早期B型CD19+,CD10T系列前T型CD7+,CD2普通型CD19+,CD10+T细胞型CD7+,CD2+前B型CD19+,胞质链+B细胞型CD19+,SmIg+急性非淋巴细胞白血病的免疫表型特点亚型典型的抗原标记亚型典型的抗原标记M0CD34,33,13+ ,HLA-DR+M4CD34,33,15,14,13+M1同上M5CD33,15,14,13+M2CD34,33,15,13+,HLA-DR+M6CD71+,血型糖蛋白AM3CD33, 15,13+（HLA-DR阴性）M7CD34,41,42,61+检测白血病细胞表达的某些与细胞黏附、增殖、分化、调亡、耐药等相关的蛋白成分。微量残留白血病检查、判断疗效或预后。成熟淋巴细胞肿瘤慢性B淋巴细胞白血病：CD19、CD20、SmIg、CD5阳性表达， CD10、CD22阴性。B幼淋巴细胞白血病： CD19、CD20、 CD22 、 SmIg阳性表达， CD5、 CD11c 、CD25阴性。毛细胞白血病：CD11c、 CD19、CD20、 CD22 、 CD25 、 SmIg阳性表达。慢性T淋巴细胞白血病：CD2、CD3、CD5、 CD7阳性表达。反应性淋巴细胞增多症。淋巴细胞免疫表型分析：外周淋巴器官和血液中T细胞分为TH（CD4+，CD8-）和TS（CD4-、CD8+）两个主要亚群，计算TH/TS比值作为机体免疫状态、某些疾病诊断、病期分析、监测治疗和判断预后的参数。骨髓及血液中造血干/祖细胞计数：CD34+细胞计数用于造血干细胞移植。六、染色体分析染色体分析主要包括染色体数目和结构分析，为某些血液病的诊断及预后提供重要依据【临床意义】恶性白细胞疾病的诊断与分型：WHO新的诊断与分类标准，特别强调染色体分析的重要性，对某些伴有染色体和基因重现性异常的急性髓系白血病，即使血象或骨髓象原始细胞数量20%，也可做出诊断。genetic abnormalities of leukemia/lymphomatype of cellsblood neoplasmsaberration of chromosome myeloidcellANLL-M2t(8;21) (q22;q22)ANLL-M4Eoinv(16) (p13.1;q22)ANLLt (16;16) (p13.1;q22)ANLL-M3t (15;17) (q22;q12)ANLL-M7t (16;21) (p11;q22)CMLt (9;22) (q34;q11.2)lymphoidcellB-ALL/lymphomat (9;22) (q34;q11.2)t (5;14) (q31;q32)指导恶性血液病治疗、检测缓解、预后及复发:指导治疗: 靶向治疗，如ANLL-M3 t (15;17) (q22;q12)选用维甲酸治疗；CML t (9;22) (q34;q11.2)选用伊马替尼治疗；B-ALL t (9;22) (q34;q11.2)化疗加伊马替尼治疗，宜早行异基因干细胞移植。判断预后： ANLL-M2伴t(8;21) (q22;q22)，ANLL-M4Eo伴inv(16) (p13.1;q22)， ANLL-M3 伴t (15;17) (q22;q12)预后较好；复杂核型预后差， ALL 伴t (9;22) (q34;q11.2)预后差。复发判断：染色体改变较临床复发早3-6个月。监测遗传性疾病与血液病发生：21-三体综合征易发生急性髓系白血病。监测骨髓移植后细胞的嵌合状态：性染色体监测可判断骨髓移植成功与否。七、基因诊断遗传性血液病、恶性白细胞疾病的发生、发展与基因改变密切相关。已证实部分造血与淋巴组织肿瘤染色体异常形成的融合基因在白血病的发病中起着重要作用，而且这些具有疾病特异性的融合基因对其诊断、治疗及疗效检测、预后判断等也有十分重要的临床意义。【临床意义】RUNX1-RUNX1T1：融合基因RUNX1又称AML1基因，位于染色体21q22；RUNX1T1又称ETO基因，位于染色体8q22。T(8;21)(q22 ; q22）导致RUNX1、RUNX1T1基因断裂、重排，形成RUNX1-RUNX1T1（AML1-ETO）融合基因，引起造血干细胞分化成熟障碍，从而诱发急性髓系白血病。诊断：此融合基因主要见于AML-M2，当骨髓原始细胞20%，若伴有T(8;22）（q22 ; q22）或 AML1-ETO，仍可诊断AML 。治疗及预后： 伴有AML1-ETO的AML对化疗反应好，有较高的完全缓解率及较长的无病生存期。PML-RARA融合基因 P