逆境胁迫对转基因ZmPP2C2烟草生理特性的影响.doc

I 目目 录录 摘摘 要要 1 ABSTRACT 3 英文缩写符号及中英文对照表英文缩写符号及中英文对照表 5 1 1 引言引言 6 1 1 逆境胁迫与信号转导 6 1 1 1 细胞信号转导系统 7 1 1 2 蛋白质的可逆磷酸化 8 1 2 蛋白磷酸酶 8 1 2 1 蛋白磷酸酶的发现 8 1 2 2 植物中的蛋白磷酸酶 9 1 2 3 植物中 PP2C 的生化特性与蛋白质结构 10 1 2 4 PP2C 的进化 11 1 2 5 植物中 PP2C 的功能 12 1 3 本课题研究目的及意义 16 2 2 材料与方法材料与方法 18 2 1 材料的选择与种植 18 2 1 1 材料的选择 18 2 1 2 材料的培养 18 2 2 材料处理 18 2 2 1 低温处理 18 2 2 2 NaCl 处理 18 2 2 3 PEG 处理 18 2 3 试验方法 19 2 3 1 转基因烟草植株筛选 19 2 3 2 转基因植株的表型分析 19 2 3 3 转基因植株生理指标的测定 21 2 4 试验数据处理 23 II 3 3 结果与分析结果与分析 24 3 1 转基因烟草植株的表型分析 24 3 1 1 转基因和野生型烟草植株在 1 2 MS 培养基及在含 NaCl 甘 露醇的 1 2MS 培养基的萌发情况 24 3 1 2 转基因植株烟草的 PCR 检测 25 3 2 低温胁迫对转基因烟草植株生理特性的影响 25 3 2 1 转 ZmPP2C2 基因烟草植株耐冷性分析 25 3 2 2 低温胁迫对转基因烟草和野生型烟草膜脂电解质外渗的影响 25 3 2 3 低温胁迫对转基因烟草和野生型烟草叶片脯氨酸和可溶性糖 含量的影响 26 3 2 4 低温胁迫下转基因烟草和野生型烟草 SOD 和 POD 含量的变化 27 3 3 盐胁迫对转基因烟草植株生理特性的影响 29 3 3 1 盐胁迫对转基因烟草和野生型烟草叶片气体交换参数的影响 29 3 3 2 盐胁迫对转基因烟草和野生型烟草叶片荧光参数的影响 30 3 3 3 盐胁迫对转基因烟草和野生型烟草膜透性的影响 30 3 3 4 盐胁迫对转基因烟草和野生型烟草丙二醛的影响 31 3 3 5 盐胁迫对转基因烟草和野生型烟草抗氧化酶活性的影响 32 3 3 6 盐胁迫对转基因烟草和野生型烟草叶片 Pro 和 WSS 含量的影 响 33 3 3 7 盐胁迫对转基因烟草和野生型烟草叶片可溶性蛋白和叶绿素 含量的影响 34 3 4 PEG 处理对转基因烟草生理特性的影响 35 3 4 1 PEG 处理对转基因烟草和野生型烟草叶片气体交换参数的影 响 35 3 4 2 PEG 处理对转基因烟草和野生型烟草膜透性的影响 36 3 4 3 PEG 处理对对转基因烟草和野生型烟草丙二醛含量的影响 36 3 4 4 PEG 处理对转基因烟草和野生型烟草抗氧化酶活性的影响 37 III 3 4 5 PEG 处理对转基因烟草和野生型烟草叶片 Pro WSS 含量的影 响 38 3 4 6 PEG 处理对转基因烟草和野生型烟草叶片可溶性蛋白含量的 影响 39 4 4 讨论讨论 40 4 1 转基因烟草对低温胁迫的响应 40 4 2 转基因烟草对盐胁迫的响应 40 4 2 1 盐胁迫下转基因烟草叶片光合能力的维持 40 4 2 2 盐胁迫对转基因烟草叶片膜脂过氧化及体内保护系统的影响 41 4 3 转基因烟草对干旱胁迫的响应 41 5 5 结论结论 42 参考文献参考文献 43 致谢致谢 53 硕士期间发表的论文硕士期间发表的论文 54 山东农业大学硕士学位论文 1 转ZmPP2C2基因烟草对逆境胁迫的响应 研 究 生 萧蓓蕾 指导教师 李德全 教授 摘摘 要要 蛋白质磷酸化与去磷酸化是细胞信号转导的重要过程 主要通过蛋 白激酶和蛋白磷酸酶来完成 蛋白磷酸酶2C PP2C 是蛋白磷酸酶家族 的一个分支 其生化性质 蛋白质组成与结构都和其他磷酸酶显著不同 但都在细胞信号转导中扮演重要角色 高等植物中的PP2C广泛参与脱落 酸 ABA 的各种信号途径 包括ABA诱导的种子休眠 保卫细胞及离子 通道调控和气孔关闭 逆境胁迫等 PP2C也参与植物创伤反应 生长发 育以及抗病性等 作为大多数信号途径的负调控因子 PP2C能直接与激 酶结合 与其他调控蛋白结合 以及直接与DNA结合调控相关基因的表达 本文以转ZmPP2C2基因烟草和野生型烟草为材料 溶液培养幼苗 采 用低温 盐胁迫 水分胁迫的处理方式 研究转ZmPP2C2基因烟草对逆境 胁迫的响应 为改良农作物抗逆性提供依据 主要结果如下 1 对转ZmPP2C2基因烟草植株进行基因组 PCR 鉴定 筛选阳性植株 进行生理指标测定 2 逆境胁迫 低温 盐胁迫 干旱 下 两种类型烟草叶片的相对 电导率 MDA的含量都呈上升趋势 膜透性增大 电解质外渗量增多 膜 脂过氧化作用增强 但转基因烟草相对电导率和MDA含量较野生型烟草低 说明转基因烟草膜脂过氧化程度低于野生型烟草 这有利于膜功能的维 持 3 逆境胁迫 低温 盐胁迫 干旱 下 转基因烟草相容性物质如 脯氨酸 可溶性糖的积累明显高于野生型烟草 在低温胁迫下 两种类 型烟草叶片的SOD活性都呈上升趋势 但转基因烟草高于野生型烟草 在 转 ZmPP2C2 基因烟草对逆境胁迫的响应 2 盐和水分胁迫下 两种类型烟草叶片的SOD活性是先升高后降低 但转基 因烟草下降幅度小 仍保持较高的活性 在低温胁迫下 两种类型烟草 叶片的POD活性先升高后降低 但转基因烟草下降幅度小 在盐和水分胁 迫下 POD活性呈上升趋势 转基因烟草叶片上升幅度显著 4 盐分和水分胁迫下 两种类型烟草叶片的净光合速率 Pn 气 孔导度 Gs 都呈下降趋势 胁迫对两种类型烟草叶片的净光合速率 Pn 和气孔导度 Gs 的影响无明显差异 盐分胁迫下 Fv Fm降幅 较小 PS 受伤害较轻 5 盐分和水分胁迫下 两种类型烟草叶片的可溶性蛋白含量先下降 后升高 在150mM NaCl胁迫下 转基因烟草叶片的类胡萝卜素含量呈上 升趋势 野生型烟草则呈下降趋势 关键词 关键词 转ZmPP2C2基因烟草 蛋白磷酸酶 低温胁迫 盐胁迫 水分 胁迫 逆境响应 山东农业大学硕士学位论文 3 Responses of Transgenic Tobacco with ZmPP2C2 to Environmental Stress Graduate Xiao Beilei Supervisor Professor Li Dequan College of Life Sciences Shandong Agricultural University Taian Shandong 271018 Abstract Protein phosphorylation and dephosphorylation which are mainly done by protein kinases and phosphatases two kinds of enzymes possessing converse functions are most important aspects of signal transduction pathways in all kinds of organisms Protein phosphatase 2Cs PP2Cs are a subfamily of protein phosphatases and their biochemical properties and protein structures distinguish themselves from any other subgroups Plant PP2Cs have been demonstrated to play important roles in abscisic acid ABA activated multiple signal transductions such as ABA induced seed dormancy germination guard cell closure ion tunnel regulation and stress acclimation Meanwhile plant PP2Cs have also been shown to be involved in signaling in wound response development and pathogen resistance As negative regulatory factors of many signaling events PP2Cs can interact with kinases other regulatory proteins or directly combine with DNA to regulate expression of corresponding genes Transgenic tobacco with ZmPP2C2 gene and wild type tobacco were taken as material in our research They were cultivated by solution in the mode of sitmulated treatments with low temperature salt and water stresss We investigated the responses of transgenic tobacco with ZmPP2C2 to environmental stress The main results were as follows 1 The transgenic tobaccos with ZmPP2C2 gene were identified by genome PCR The positive plants were selected which were used for physiological measurement 2 Under environmental stress low temperature salt and drought the 转 ZmPP2C2 基因烟草对逆境胁迫的响应 4 relative electrical conductivity and MDA content in both wild type and transgenic tobacco increased which resulted in the increase membrane permeability and electrolyte leakage The structure and function of cell membrane was damaged But the MDA and relative electrical conductivity of transgenic tobacco was lower than that of wild type tobacco that indicated the extent of the membrance lipid perioxidation in transgenic tobacco was smaller than that in wild type tobacco It is favorable to maintain the function of cell membrane 3 Under environmental stress low temperature salt and drought the contents of proline and soluble sugar in transgenic tobacco accumulated more than in wild type tobacco Under low temperature stress the anti oxidant enzyme SOD activities of both wild type and transgenic tobacco increased while the transgenic type increased more Similary results observed in POD activaty under salt or drought stress Interestingly the SOD activity in both transgenic and wild type tobacco reached a peak and then decreased under salt or water stress so POD activity was the same under low temperature 4 Under salt or drought stress Pn and Gs in both wile type tobacco and transgenic tobacco decreased while there was no obvious difference between wild type and transgenic plants However the level of Fv Fm in transgenic tobacco decreased less compared with wild type tobacco under salt stress It indicated that injury of PS was lower in transgenic tobacco plants 5 Under salt or drought stress the change of soluble proteins content was similar in two type tobacco exhibiting decreased and then increased The Car content of transgenic tobacco increased while that in wild type tobacco decreased under 150mM NaCl stress Keywords Transgenic tobacco with ZmPP2C2 gene Low temperature stress Salt stress Drought stress Responses to environmental stress 山东农业大学硕士学位论文 5 英文缩写符号及中英文对照表英文缩写符号及中英文对照表 英文缩写英文缩写英文名称英文名称中文名称中文名称 bpBase pair碱基对 TGTransgenic tobacco转基因烟草 CiIntercellular CO2 concentration细胞间隙 CO2浓度 CTABCetyltrimethylammonium bromide十六烷基三乙基溴化铵 WTWild type tobacco野生型烟草 FmMaximum fluorescence in the dark暗适应下的最大荧光 FoInitial fluorescence in the dark暗适应下的初始荧光 Fv Fm Maximum photochemical efficiency of PSII at open centers in the absence of NPQ PSII 最大光化学效率 Gs Stomatal conductance气孔导度 MSMurashige and Skllg mediumMS 培养基 PCRPolymerase chain reaction聚合酶链式反应 PnNet photosynthetic rate净光合速率 PEGPolyethylene聚乙二醇 ProProline脯氨酸 PODPeroxidase过氧化物酶 PS Photosystem 光系统 SODSuperoxide dismutase超氧化物歧化酶 TrisTrishydryxymethy laminomethane三羟甲基氨基甲烷 转 ZmPP2C2 基因烟草对逆境胁迫的响应 6 1 1 引言引言 植物在生长发育过程中 经常遭遇不良环境如干旱 高盐 低温等 胁迫因子的影响 使植物生长发育受到抑制 严重时会导致植物死亡 由于植物生长在土壤中 本身不能移动 经过长期的进化和演变 植物 形成了对环境感知和响应来适应逆境胁迫的本领 这种感知和响应的机 制是一个复杂的逆境信息的转导过程 Shinozaki et al 1997 刘强等 2000 Neill et al 1999 自20世纪90 年代以来 对细胞信号转导的研究已成为国内外生物界 关注的热点 并开始深入到生命科学的各个领域 成为解决许多重要理 论及实践问题的重要途径 涉及此过程的重要细胞生物学事件就是蛋白 质的可逆磷酸化 概括起来说 这种翻译后修饰可以改变信号通路中许 多关键蛋白质的性质 如酶活性 细胞内定位等 从而影响细胞的增殖 分化和凋亡 Stark et al 1994 Stone et al 1993 Francois et al 1992 过 去对蛋白质可逆磷酸化的研究主要集中在蛋白激酶的调控方面 随着研 究的进一步深入 现在认为蛋白磷酸酶和蛋白激酶同样起着重要的调控 作用 目前 对蛋白磷酸酶的研究远不如蛋白激酶深入 但两者的协同调 节机制在细胞信号转导途径中的作用是不言而喻的 多数蛋白磷酸酶和 蛋白激酶一样 是受到精确调节的 许多蛋白磷酸酶位于信号转导途径 的下游或末端 是信号调节的对象 这种对蛋白磷酸酶调节过程的存在 就说明了蛋白磷酸酶的重要性 Hunter 2000 研究发现在骨骼肌收缩 过程中 糖原的合成和降解就是通过对蛋白磷酸酶的活性调节而实现的 Bolger 1994 因此 分离蛋白磷酸酶基因及其编码蛋白 并研究其 在信号转导中的作用机制 对于阐明植物的信号转导网络 并在此基础 上 利用基因工程技术提高植物抗逆性具有重要意义 1 11 1 逆境胁迫与信号转导逆境胁迫与信号转导 环境胁胁指由于环境因素如温度 水分等条件的变化 使植物不能 正常生长的一种状况 植物在复杂多变的环境中生长 阵发性和短暂性 的胁迫经常发生 由于植物生长在土壤中 不能像动物那样通过移动来 山东农业大学硕士学位论文 7 躲避逆境 因而在长期的进化过程中演变产生了多种多样的抗逆机制 其中关键的一步就是对胁迫信号的感受 识别 传递及转导过程 植物 是如何感受并识别逆境信号 传递逆境信息 激活一系列信号分子并调 控相关基因的表达及生理生化反应以适应逆境 从而维持其正常的生长 发育 即植物细胞信号转导问题 现已成为生命科学研究的热点 1 1 11 1 1 细胞信号转导系统细胞信号转导系统 生物体的新陈代谢和生长发育主要受遗传信息和外界环境信息的调 控 遗传信息决定代谢和生长发育的基本模式 其实现在很大程度上依 赖于环境的刺激 其中 对于细胞而言 环境刺激信息包括生物体的外 界环境和体内环境信息两个方面 而外界环境刺激在控制细胞的基因表 达 增殖 分化和发育过程中发挥着重要的调节作用 20 世纪下半叶以 来 随着信息论 控制论和耗散理论等科学思想的影响和生物学自身的 发展 逐渐产生了 细胞信号转导 这一概念 通常将生物遗传信息传 递过程 即由DNA mRNA 蛋白质 称之为遗传信息传递的中心法则 而细胞信号转导的分子途径就是细胞信息传递的中心法则 孙大业等 2001 生物体内的大分子 细胞器 细胞 组织和器官在空间上是相互隔 离的 生物体与环境之间更是如此 根据信息论的基本观点 两个空间 隔离的组分之间的相互影响和相互协调一致 不管采用何种方式 都必 须有信息和信号的传输或交流 各种参与细胞内外信号感受 传递和应 答的细胞组分共同构成了细胞信号转导系统 细胞信号转导主要分以下 几个阶段 细胞膜上或胞内受体感受逆境信息并引起相应的生物学效应 主要是胞内第二信使浓度的改变 依赖第二信使的酶尤其是蛋白激酶被 激活 使相应的酶和底物蛋白发生磷酸化 引起信号放大 调控相关基 因表达并产生相应的生理反应 或蛋白磷酸酶被激活发生去磷酸化 使 具有活性的酶失活 从而缩小或关闭信号通路 植物具有对环境变化快速感知和主动适应的能力 而这种快速感知 和主动适应的策略就是植物体内胞间和胞内逆境信息的传递和转导 这 一过程涉及植物对逆境刺激的感受与识别 逆境信使的产生与传输 以 及反应部位对逆境信使的识别与转导过程 Davies et al 1991 转 ZmPP2C2 基因烟草对逆境胁迫的响应 8 1 1 21 1 2 蛋白质的可逆磷酸化蛋白质的可逆磷酸化 蛋白质的可逆磷酸化是生物体内普遍存在的一种调节机制 在细胞 的信号识别与转导中起着重要的作用 同时还是传递和放大信号的必要 途径 蛋白磷酸酶 protein phosphatase PP 和蛋白激酶 protein kinase PK 是调控这一过程的两类关键酶 蛋白质磷酸化反应是由蛋白 激酶催化把ATP或GTP上 位的磷酸基团转移到底物蛋白氨基酸残基上的 过程 而其逆转过程由蛋白磷酸酶催化完成 称为蛋白质的去磷酸化 大量研究表明蛋白质的可逆磷酸化在信号转导中占有极其重要地位 是 生物体内普遍存在的信号转导调节方式 几乎涉及所有的生理和病理过 程 如糖代谢 细胞的生长发育 光合作用 基因表达 神经递质的合 成与释放 甚至癌变等等 Bollen et al 1992 Cohen 1989 Mumby et al 1993 Shenolikar et al 1991 Shenolikar 1994 Chenk et al 1999 Stone et al 1995 据报道 目前已鉴定了500 多种蛋白激酶和100 多种蛋白磷酸酶 Hunter 1995 Taylor et al 1995 蛋白激酶和蛋白磷酸酶同时受到时 间和空间的调节 从而影响它们对靶蛋白的修饰程度 蛋白质的可逆磷 酸化过程存在多种多样的调节途径 同时蛋白磷酸酶和蛋白激酶有多种 底物并可在单个或多个位点发挥作用 这些特性都决定了蛋白磷酸酶和 蛋白激酶具有多种功能 Jans 1995 细胞对信号分子的响应主要取决 于蛋白磷酸酶和蛋白激酶的相互作用 1 21 2 蛋白磷酸酶蛋白磷酸酶 1 2 11 2 1 蛋白磷酸酶的发现蛋白磷酸酶的发现 在真核生物基因组中 编码蛋白磷酸酶的基因远少于蛋白激酶 一 般只有蛋白激酶基因数的三分之一到四分之一 同时 蛋白质可逆磷酸 化研究的重点也都针对蛋白激酶 现在越来越多的研究显示 与蛋白激 酶一样 蛋白磷酸酶在信号转导中也同样有重要作用 以往我们对于蛋 白磷酸酶的认识主要来自动物和酵母 植物中了解较早 较多的蛋白磷 酸酶是丝氨酸 苏氨酸蛋白磷酸酶 Mackintosh 和Cohen 以兔的磷酸酶激 酶的 亚基为底物 首次在油菜 Brassica napus 种子的提取液中均 山东农业大学硕士学位论文 9 检测到不依赖于二价阳离子的蛋白磷酸酶的活力 Mackintosh et al 1989 随后 人们相继从拟南芥 Arabidopsis thaliana 苜蓿 Medicago stiva 烟草 Nicotiana tobacum 冰叶日中花 Mesembryanthemum crystallinum 小麦 Triticum aestivum 水稻 Oryza sativa 玉米 Zea mays 中克隆到编码蛋白磷酸酶的基因 部分相关蛋白已被分离 纯化 Smith et al 1996 Meyer et al 1994 Miyazaki et al 1999 Yu et al 2001 Meskiene et al 1998 Awotunde et al 2000 Dong et al 2001 同蛋白激酶相比 植物蛋白磷酸酶的研究还只是刚刚起步 大部分 已克隆的蛋白磷酸酶基因还没有得到深入细致的研究 其编码的相关蛋 白也没有得到分离纯化 它们在信号转导中的作用机制及其所处的地位 也不是很清楚 可以预见 随着生物化学和分子生物学的发展 人们对 蛋白磷酸酶的作用将越来越重视 蛋白磷酸酶在植物生长发育中的功能 也将得到更深入的了解 1 2 21 2 2 植物中的蛋白磷酸酶植物中的蛋白磷酸酶 植物中存在为数众多的蛋白激酶和磷酸酶 参与体内庞杂信号网络 的各个方面 例如拟南芥基因组中编码蛋白磷酸酶的基因有112个 Kerk et al 2002 植物蛋白磷酸酶通常分为两大类 即丝氨酸 苏氨酸蛋白 磷酸酶 protein Ser Thr phosphatases PSPs EC 3 1 3 16 和酪氨酸蛋白 磷酸酶 protein Tyr phosphatases PTPs EC3 1 3 48 PSPs专一去除底 物蛋白上丝氨酸或苏氨酸残基的磷酸基团 而PTPs 则专一去除底物蛋白 上酪氨酸残基的磷酸基团 此外 还有一类对丝氨酸 苏氨酸以及酪氨酸 都能起作用的双专化磷酸酶 dual specificity phosphatases DSPs 根据催化亚基的不同 PSPs 分为PP1 PP2 其中PP2 则因对金属 离子的不同要求进一步细分为PP2A PP2B PP2C 等亚类 PP2A 维持 其生物活性不需要离子参与 PP2B 需要Ca2 参与 而PP2C则需要 Mg2 PP1 PP2A PP2B 间有较高的序列同源性 组成一个蛋白磷酸 酶P protein phosphatase P PPP 家族 PP2C 则与需要Mg2 的丙酮酸 脱氢酶磷酸酶和另外一些丝氨酸 苏氨酸磷酸酶 Ser Thr phosphatases STs 组成蛋白磷酸酶M protein phosphatase M PPM 蛋白磷酸酶分 转 ZmPP2C2 基因烟草对逆境胁迫的响应 10 类见图1 蛋白酪氨酸磷酸酶 PTPs 双专化酸磷酸酶 DSPs 蛋白磷酸酶1 PP1 蛋白磷酸酶2A PP2A 蛋白丝氨酸 苏氨酸磷酸酶 PSPs 蛋白磷酸酶2B PP2B 蛋白磷酸 酶P PPP 蛋白磷酸酶2C PP2C 蛋 白 磷 酸 酶 蛋白丝氨酸 苏氨酸磷酸酶 STs 丙酮酸脱氢酶磷酸酶 蛋白磷酸 酶M PPM 图1蛋白磷酸酶的分类 1 2 31 2 3 植物中植物中 PP2CPP2C 的生化特性与蛋白质结构的生化特性与蛋白质结构 PP2C家族是与其他的蛋白磷酸酶关系最远的一个亚族 虽然较早被 发现 但却是了解最少的一类丝氨酸 苏氨酸型磷酸酶 在结构上 虽然 PP2C被发现在许多分子结构上作为模块 module 存在 但却没有发现 独立的亚基可以调节PP2C的活性和定位 PP2C物理化学性质十分特殊 在PSPs 各亚类中只有PP2C 没有调控亚基 PP2C酶活性严格依赖Mg2 或者Mn2 离子 Ca2 Zn2 Ni2 等其他离子 一般通过竞争Mn2 或 Mg2 而使PP2C 的活性丧失 Baudouin et al 1999 Klumpp et al 1998 加入螯合剂EDTA 后 PP2C也不再具有生物活性 而对其他一 些PSPs 有显著抑制作用的海绵酸 okadaic acid 环孢霉素 cyclosporin 等对PP2C活性没有影响 Hunter 1995 植物PP2C蛋白C端有保守的催化结构域 N端还具功能各异的延伸 区 N 端延伸区是植物PP2C所特有的 这些不同长度延伸区赋予PP2C 不同功能 如PP2C成员之一与激酶关联的蛋白磷酸酶 kinase associated protein phosphatase KAPP 的N端携有与激酶直接相互作用的激酶 KI 结构域 Stone et al 1994 Li et al 1999 烟草的一个PP2C蛋 白D N A 结合的蛋白磷酸酶1 DNA binding proteinphosphatase 山东农业大学硕士学位论文 11 1 DBP1 的N端具有转录因子的序列特征 能够与防卫相关基因启动 子区域结合 Carrasco et al 2003 拟南芥中参与脱落酸 ABA 信号 途径的PP2C蛋白ABI1的N端还对C端催化结构域所决定的酶活性有一定 的调控作用 Sheen 1998 更有甚者 拟南芥PP2C成员POL蛋白N端区 域抑制了其酶活性 Yu et al 2003 植物体内PSPs为数众多且功能多样 缺少调控亚基的PP2C可能需要其多样化的N端在其蛋白质活化以及底物 专化性识别中起重要作用 PP2C催化结构域十分独特 Das等 Das et al 1996 首次利用X 晶体衍射观察到人PP2Ca的晶体结构 其催化结构域 的主要特征为两平行 折叠 当中包含双金属离子的三明治结构 其间4 个水分子与2个金属离子结合 为去磷酸化反应提供亲水核 这个三维结 构解释了PP2C对Mn2 或Mg2 的严格依赖性 并且发现PP2C大多数保守 残基都是位于PP2C本身功能的核心区域 如与二价离子结合的序列 DGH 60 62位氨基酸 在几乎所有的PP2C中都是保守的 Das et al 1996 一些保守序列对于PP2C的重要性 还在突变体中得到验证 例 如拟南芥多数abi1 abi2 突变体以及回复突变体都位于保守序列或其附 近 Sheen 1998 Gosti et al 1999 Leung et al 1997 依据催化结构 域的保守性 发现拟南芥中有69个PP2C基因 其中大多数在进化上与其 他植物的关系更为密切 形成不同的簇 cluster 而少数则独立进化为 单独的簇 植物PP2C基因与动物 真菌PP2C基因彼此有显著的不同 归 为不同的簇中 Kerk et al 2002 1 2 41 2 4 PP2CPP2C 的进化的进化 PP2C 基因分布十分广泛 存在于除病毒之外的所有生物 在高等生 物中 同一生物体内 PP2C 还往往为数众多 生物的长期进化过程中 变异是必然的 但是仍然有一定的保守性 根据人 PP2Ca 的晶体结构 发现 PP2C 大多数保守残基都是维护 PP2C 本身功能的核心区域 如与二 价离子结合的序列 DGH 60 62 在几乎所有的 PP2C 中都是保守的 Das et al 1996 另外一些保守序列对于 PP2C 性质的重要性 在突 变体中得到验证 多数 abil abi2 突变体以及回复突变体都位于保守序 列或其附近 Gosti et al 1999 Leung et al 1997 对保守序列的点 突变分析也证明这些序列对 PP2C 活性十分重要 Sheen 1998 如今 转 ZmPP2C2 基因烟草对逆境胁迫的响应 12 保守序列已经成为筛选 PP2C 候选基因的重要依据 根据对保守的催化 结构域的分析 发现拟南芥中 PP2C 基因有 69 个之多 Kerk et al 2002 PP2C 基因存在久远 因而进化上十分复杂 冰叶日中花 Mesembryanthemum cristallnium 中的 10 个 PP2C 基因有几个彼此间 存在密切的同源性 而另外几个则与其他植物中 PP2C 亲缘性更近 Miyazaki et al 1999 对拟南芥的 59 个 PP2C 基因同源性分析表明 大多数 PP2C 基因与其他植物的关系更为密切 它们一起形成不同的簇 cluster 而少数拟南芥 PP2C 基因则独立进化为单独的簇 植物 PP2C 基因与动物 真菌 PP2C 基因彼此有显著的不同 归在不同的簇中 Kerk et al 2002 1 2 51 2 5 植物中植物中 PP2CPP2C 的功能的功能 1 2 5 11 2 5 1 参与参与 ABAABA 调控的各类信号途径调控的各类信号途径 ABA 是一种重要的植物激素 在植物生长发育及对逆境胁迫的适应 中发挥重要作用 其作用机制主要通过 ABA 依赖的信号转导途径 植物 中已经发现多种蛋白磷酸酶参与 ABA 的信号转导 例如 PP2C 参与 ABA 调控的抗逆信号途径 植物对冷冻害 干旱以及高盐等各种逆境胁 迫具有一定的适应性 近年来关于逆境分子机理的研究日益增多 Thomashow 1999 Hasegawa et al 2000 Xiong et al 2002 植物 响应逆境胁迫信号传导过程主要为 信号识别 产生初级信号 蛋白磷酸 化级联 转录因子 逆境相关基因 产生反应 在信号传递过程中 不 仅涉及一些对信号调控及应对逆境的蛋白修饰分子 而且能激发 ABA SA 等植物激素的合成 后者则通过对信号途径的调控 提高植物 对环境的适应性 Xiong et al 2002 ABA 是参与逆境信号传递的重要 分子 Koovnneef et al 1998 Cutler et al 1999 Liotenberg et al 1999 Taylor et al 2000 作为 ABA 信号途径的上游分子 属于 PP2C 的 abi1 abi2 也在植物的逆境反应中起作用 abi1 在冷害处理 30min 到 ld 内逐渐积累 随后下降 abil 基因突变体在冷害 脱水及盐 处理中均受到抑制 T htiharju et al 2001 abi2 基因在冷害处理上与 山东农业大学硕士学位论文 13 abi1 有相似之处 冷害胁迫基因 RABI8 均有表达 Leung et al 1997 但是 ABA 诱导的干旱胁迫下乙醇脱氢酶 alcohol dehydrogenase 在 abi2 中表达 而在 abi1 表达不受影响 Debruxelles et al 1996 相反 干旱条件下生根能力 Vartanian et al 1994 以及水分胁迫基因 ATHB 7 Soderman et al 1996 和冷害诱导基因 COR Glimour et al 1991 则只在 abil 突变体中受到抑制 而在 abi2 中无变化 这说明对于不同环 境胁迫 两者作用既有重叠 也存在分歧 拟南芥 AtPP2CA 是冷害及 ABA 诱导的负调控基因 Sheen 1998 Tahtiharju et al 2001 AtPP2CA 表达模式与 ABll ABI2 不同 它在正常情况下有较弱的本底表 达 受冷害处理后 40 秒开始积累 12h 达到高峰 并能持续 4 一 sd Tahtiharju et al 2001 反义抑制表达的 AtPP2CA 提高了对 ABA 的 敏感性 植株表现得更抗冻害 一些冻害及 ABA 诱导的基因在反义抑制 表达植株中表达量也有提高 abi2 还参与盐逆境信号传递 Zhu 等 1998 从拟南芥中筛选到一 系列盐过度敏感 salt overly sensitive SOS 突变体 其中 SOS 编码 蛋白激酶 Liu et al 2000 酵母双杂交筛选到 SOS2 的专化作用蛋白 为 abi2 缺失突变分析表明这种作用依赖激酶一个保守的 37aa 蛋白磷酸 酶互作花边序列 Ohta et al 2003 与 SOS2 互作的还有另一个蛋白 SOS3 作用区域是紧邻蛋白磷酸酶互作花边序列的另一个保守花边序列 SOS2 与 SOS3 之间的互作并不直接依靠磷酸化 去磷酸化作用 但其复 合体则可调节 Ca2 信号 Ohta et al 2003 因此这种作用可能发生在 盐逆境信号传递的早期 1 2 5 21 2 5 2 参与植物的生长发育参与植物的生长发育 高等植物生长发育过程中 需要维持茎中柱细胞增殖与分化的适当 比例 适时分化出器官 保持正常株形株貌 植物体内有专门的信号途 径 调控形态与器官形成基因的表达 PP2C 也参与植物器官的发育 属 于 PP2C 的 KAPP kinase associated proteinphosphatase 可以与植物受体 样激酶 5 receptor like kinase5 RLK5 相互作用 Stone et al 1994 RLK5 是植物 RLK 家族成员之一 参与把胞外信号转导到胞内 KAPP 除 C 端有催化结构域外 在其 N 端还具有激酶作用结构域 kinase 转 ZmPP2C2 基因烟草对逆境胁迫的响应 14 interaction domain KI 结构域 近年发现 KAPP 与多个控制器官形成 蛋白相互作用 CLAVATA 是拟南芥的一类突变体 表现茎顶端分生组织 膨大 花数量增加和花畸形 已经发现 CLV1 3 基因控制这一表型 Leyse et al 1992 Clark et al 1993 1995 CLV1 编码 RLK 具有 胞外串联排列的富亮氨酸重复序列 LRRs 疏水膜结合结构域 以及 胞内保守的 Ser Thr 蛋白激酶结构域 Cherk et a1 1997 体外分析表 明 CLVI 能与 KAPP 结合 而且这种结合必须依赖 Kl 结构域的存在 同 时 CLVI 抗血清也能与 KAPP 多克隆抗体发生免疫沉淀反应 这种沉淀 反应也同样依赖 Kl 结构域 表明两者作用的专一性 将 KAPP 转化到 clv1 抑制率不等的突变株系中强表达 发现 KAPP 表达量与 clv1 的抑制 率呈反比 表明 KAPP 为 CLVI 的负调控因子 Stone et al 1995 Trotochaud 等 1999 以免疫沉淀分析 CLVI 的受体蛋白 发现与 CLVI 抗血清形成 185kD 与 450kD 两个蛋白复合体 在 450kD 复合体中 含 有 KAPP 以及另一个 Rho GTPase 相关的蛋白 并且复合物中 KAPP 直 接与 CLVI 作用 这个复合物还有必须另外一个蛋白的参与 CLV3 CLV3 功能上与 CVLI 相差无几 在形成的复合物中 两者并不 相互接触 但在 clv3 突变体中不能形成 45OkD 的蛋白复合物 CLV3 可 能扮演辅助蛋白的角色 Trotochaud et al 1999 拟南芥 KAPP 受体蛋 白可能还有更多 Shah 等 2002 研究表明 拟南芥 KAPP 还与另外一 个蛋白 AtSERKI somatic embryogenesis receptor kinase1 SERK1 相互 作用 AtSERKl 也是一个结构上与 CLVI 很类似的基因 同样包含胞外 LRRs 疏水膜结合结构域 胞内保守的 Ser Thr 蛋白激酶结构域 shah et al 2001 Hechet et al 2001 不同的是 它仅在拟南芥胚珠及早期 胚胎发育中表达 Hechet et al 2001 荧光蛋白细胞定位分析表明 KAPP 与 AtSERKI 均能同时定位于质膜与胞内泡囊上 但两者仅在泡囊 上直接接触 即 KAPP 只在 AISERKI 进入到胞内时才与其结合 Shah et al 2002 现在还不清楚是否有其它蛋白参与这一作用 也不清楚是什 么机制使 KAPP 能和不同的蛋白相结合 并且在植物的不同发育阶段行 使不同的功能 拟南芥 POLTERGEST POL 也是参与调控植物茎分生组织发育的 山东农业大学硕士学位论文 15 一个 PP2C 基因 突变体的遗传分析表明 POL 在调控中柱发育中位于 CLVl 下游 Yu et al 2000 POL 结构独特 其 C 端具有催化活性区域 但有一大约 200aa 的插入 其 N 端 233aa 为功能未知区域 C 端催化区域体外表达具有 PP2C 酶活性 但完整的 POL 则无酶活性 表明 N 端区域抑制了其活性 POL 在植物多个器官表达 并且在相当一些植物中保守 Yu et al 2000 2003 其 PP2C 催化域功能有待研究 1 2 5 31 2 5 3 参与植物创伤信号途径参与植物创伤信号途径 植物已经进化了一套应对外界伤害 wounding 反应的防卫体系 Bowles 1993 促分裂原活化蛋白激酶 mitogen activated protein kinase MAPK 参与植物创伤所启动的信号传导途径 Seo et al 1995 Jonal et al 1999 B gre et al 1997 MAPK 级联途径 MAPK cascades 是生物的一个普遍信号传导机制 Waskiewicz et al 1995 生物体内往往存在多个 MAPK 级联途径 当受到外界不同 刺激 如渗透压 UV 辐射及生物因子作用时 启动相应的 M 妙 K 级联 反应 Posada et al 1991 而当逆境信号解除时 则又需要抑制相应的 MAPK 级联反应 MAPK 抑制主要是通过去磷酸化作用 许多蛋白磷酸 酶 包括 PP2A PP2C 都能起去磷酸化作用 Maeda et al 1994 shiozaki et al 1995 Gupta et al 1998 Meskiene 等 1998 从苜蓿中筛选到一个抑制 MAPK 级联系统分支 SAMK Stress cativated MAPK 途径的 PP2C 基因 MP2C 受到创伤的 苜蓿其 SAMK 途径被瞬时激发 随后 MP2C 开始表达 抑制 SAMK 信 号传递 MP2C 作为一个负调控因子起作用 当环境条件改变时 植物 需要适时抑制受到激发的信号 使之恢复到激发前状态 MP2C 还能抑 制酵母 MAPK 证明这种作用的保守性 Meskiene et al 1998 随后 证实创伤反应中 MP2C 直接抑制的是 MAPK 级联系统的另一分支 SIMK stress inducible MAPK Meskiene et al 1998 一些研究还表明 以十八烷途径为基础的脂肪酸也是植物创伤信号 途径之一 不仅表现在植物创伤时激发产生与信号转导相关的磷脂酶 D phospholipase D 磷脂酶 A2 等 Lee et al 1997 Ryu et al 1996 转 ZmPP2C2 基因烟草对逆境胁迫的响应 16 而且还产生一些不饱和脂肪酸 Conconi et al 1996 Ryu et al 1996 这些代谢产物如茉莉酸等能对植株产生整体的调节 Blechert et al 1995 并通过次级信使如 Ca2 进一步精细调控 Knight et al 1993 Bandouin 1999 研究发现 十八烷途径的主要产物 不饱 和脂肪酸 亚麻酸是 MP2C 的最有效抑制剂 与此相反 不饱和脂肪酸 体外却可以激活哺乳动物 PP2C PP2C 的活性 降低酶对 Mg2 浓度的 依赖性 Klulmpp et al 1998 由于这些研究仅针对体外重组蛋白 在 植物体内这些脂肪酸是否能够以及多大程度上增强或者抑制 PP2C 酶活 性