微生物常规鉴定技术.doc

微生物常规鉴定技术一、 微生物检验中常用的生化反应、糖发酵试验不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。试验方法：以无菌操作，用接种针或环移取纯培养物少许，接种于发酵液体培养基管，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。接种后，置361.0培养，每天观察结果，检视培养基颜色有无改变（产酸），小倒管中有无气泡，微小气泡亦为产气阳性，若为半固体培养基，则检视沿穿刺线和管壁及管底有无微小气泡，固体培养基则出现裂隙,有时还可看出接种菌有无动力，若有动力、培养物可呈弥散生长。本试验主要是检查细菌对各种糖、醇和糖苷等的发酵能力，从而进行各种细菌的鉴别，因而每次试验，常需同时接种多管。一般常用的指示剂为酚红、溴甲酚紫，溴百里蓝和Andrade指示剂。糖发酵试验是鉴定细菌最常见的生化反应,特别是肠杆菌科细菌的鉴定.2、甲基红（Methyl Red）试验 肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH 4.5以下，使甲基红指示剂变红。试验方法：挑取新的待试纯培养物少许，接种于通用培养基，培养于361或30（以30较好）35天，从第二天起，每日取培养液1ml，加甲基红指示剂12滴，阳性呈鲜红色，弱阳性呈淡红色，阴性为黄色。迄至发现阳性或至第5天仍为阴性、即可判定结果。甲基红为酸性指示剂，pH范围为4.46.0，其pH值为5.0。故在pH 5.0以下，随酸度而增强黄色，在pH 5.0以上，则随碱度而增强黄色，在pH 5.0或上下接近时，可能变色不够明显，此时应延长培养时间，重复试验。3、V-P试验某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称VP（+）反应。试验方法： OMeara氏法：将试验菌接种于通用培养基，于361培养48 h，培养液1ml加OMeara试剂（加有0.3肌酸Creatine或肌酸酐Creatinine的40氢氧化钠水溶液）1 ml，摇动试管12 min，静置于室温或361恒温箱，若4 h内不呈现伊红、即判定为阴性。亦有主张在4850水浴放置2h后判定结果者。 Barritt氏法：将试验菌接种于通用培养基，于361培养4天、培养液2.5 ml先加入5萘酚（2-na-phthol）纯酒精溶液0.6 ml,再加40氢氧化钾水溶液0.2 ml，摇动25 min，阳性菌常立即呈现红色，若无红色出现，静置于室温或361恒温箱，如2 h内仍不显现红色、可判定为阴性。 快速法：将0.5肌酸溶液2滴放于小试管中、挑取产酸反应的三糖铁琼脂斜面培养物一接种环，乳化接种于其中，加入5-萘酚3滴，40氢氧化钠水溶液2滴，振动后放置5 min，判定结果。不产酸的培养物不能使用。本试验一般用于肠杆菌科各菌属的鉴别。产气肠杆菌和大肠埃希氏,前者VP试验阳性,后者VP试验阴性。在用于芽胞杆菌和葡萄球菌等其它细菌时，通用培养基中的磷酸盐可阻碍乙酰甲基醇的产生，故应省去或以氯化钠代替。4、靛基质（Imdole）试验（又称为吲哚试验）某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。试验方法：将待试纯培养物小量接种于试验培养基管，于361培养24 h时后，取约2 ml培养液，加入Kovacs氏试剂23滴，轻摇试管，呈红色为阳性，或先加少量乙醚或二甲苯，摇动试管以提取和浓缩靛基质，待其浮于培养液表面后，再沿试管壁徐缓加入Kovacs氏试剂数滴，在接触面呈红色，即为阳性。实验证明靛基质试剂可与17种不的靛基质化合物作用而产生阳性反应，若先用二甲苯或乙醚等进行提取，再加试剂，则只有靛基质或5-甲基靛基质在溶剂中呈现红色，因而结果更为可靠。5、硝酸盐（Nitrate）还原试验有些细菌具有还原硝酸盐的能力，可将硝酸盐还原为亚硝酸盐、氨或氮气等。亚硝酸盐的存在可用硝酸试剂检验。试验方法：临试前将试剂的A（磺胺酸冰醋酸溶液）和B（萘胺乙醇溶液）试液各0.2 ml等量混合、取混合试剂约0.1 ml、加于液体培养物或琼脂斜面培养物表面，立即或于10 min内呈现红色即为试验阳性，若无红色出现则为阴性。用-萘胺进行试验时，阳性红色消退很快、故加入后应立即判定结果。进行试验时必须有未接种的培养基管作为阴性对照。-萘胺具有致癌性，故使用时应加注意。6、明胶（Gelatin）液化试验有些细菌具有明胶酶（亦称类蛋白水解酶），能将明胶先水解为多肽，又进一步水解为氨基酸，失去凝胶性质而液化。试验方法：挑取1824 h待试菌培养物，以较大量穿刺接种于明胶高层约2/3深度或点种于平板培养基。于2022培养714天。明胶高层亦可培养于361。每天观察结果，若因培养温度高而使明胶本身液化时应不加摇动、静置冰箱中待其凝固后、再观察其是否被细菌液化，如确被液化，即为试验阳性。平板试验结果的观察为在培养基平板点种的菌落上滴加试剂，若为阳性，1020 min后，菌落周围应出现清晰带环。否则为阴性。7、尿素酶（Urease）试验有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生2个分子的氨，使培养基变为碱性，酚红呈粉红色。尿素酶不是诱导酶，因为不论底物尿素是否存在，细菌均能合成此酶。其活性最适pH为7.0。试验方法：挑取1824h待试菌培养物大量接种于液体培养基管中，摇均，于361培养10、60和120 min，分别观察结果。或涂布并穿刺接种于琼脂斜面，不要到达底部，留底部作变色对照。培养2，4和24 h分别观察结果，如阴性应继续培养至4天，作最终判定，变为粉红色为阳性。8、氧化酶（Oxidase）试验氧化酶即细胞色素氧化酶，为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶，氧化酶先使细胞色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。试验方法：在琼脂斜面培养物上或血琼脂平板菌落上滴加试剂12滴，阳性者Kovacs氏试剂呈粉红色至深紫色，Ewing氏改进试剂呈蓝色。阴性者无颜色改变。应在数分钟内判定试验结果。注意，糖代谢产物对此反应右干扰，所以不可以在含糖的培养基上进行这项试验。9、硫化氢（HS）试验有些细菌可分解培养基中含硫氨基酸或含硫化合物，而产生硫化氢气体，硫化氢遇铅盐或低铁盐可生成黑色沉淀物。试验方法：在含有硫代硫酸钠等指示剂的培养基中，沿管壁穿刺接种，于361培养2448 h，培养基呈黑色为阳性。阴性应继续培养至6天。也可用醋酸铅纸条法：将待试菌接种于一般营养肉汤，再将醋酸铅纸条悬挂于培养基上空，以不会被溅湿为适度；用管塞压住置361培养16天。纸条变黑为阳性。10、氨基酸脱羧酶试验细菌产生脱羧酶分解氨基酸使其脱羧，生成胺和CO，由于胺的生成使培养基变为碱性，可用指示剂显示出来。将待检菌接种于（赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸）脱羧培养基中，另一管不加氨基酸作为对照，接种后于每管中加入液体石蜡覆盖，37培养4天后，观察结果。对照管应为黄色。试验管中由紫色变为黄色，再变为紫色为阳性。赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸是肠杆菌科鉴定中常规试验的三种氨基酸。除沙门菌属中的伤寒沙门菌和鸡沙门菌、志贺氏属中的宋氏和鲍氏志贺氏菌外，其余均为阳性。11、三糖铁（TSI）琼脂试验试验方法：以接种针挑取待试菌菌落或纯培养物，穿刺接种并涂布于斜面，置361培养1824 h，观察结果。本试验可同时观察乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气（变黄）；产生硫化氢（变黑）。葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。12、硫化氢-靛基质-动力（SIM）琼脂试验试验方法：以接种针挑取菌落或纯养物穿刺接种约1/2深度，置361培养1824 h，观察结果。培养物呈现黑色为硫化氢阳性，混浊或沿穿刺线向外生长为有动力，然后加Kovacs氏试剂数滴于培养表面，静置10 min，若试剂呈红色为靛基质阳性。培养基未接种的下部，可作为对照。本试验用于肠杆菌科细菌初步生化筛选，与三糖铁琼脂等联合使用可显著提高筛选功效。13、氰化钾试验氰化钾可以抑制某些细菌的呼吸酶系统。细胞色素、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶以铁卟啉作为辅基，氰化钾能和铁卟啉结合，使这些酶失去活性，使细菌的生长受到抑制。将361培养24 h的肉汤培养物接种于氰化钾培养基。并应同时接种不含氰化钾的同样培养基作为对照。在 361培养，连续观察2天。对照管混浊，试验管混浊有细菌生长为阳性（不抑制），对照管混浊，试验管混浊细菌不生长为阴性（抑制）注：生化反应注意事项：氨基酸脱羧酶试验和氰化钾试验都需要接对照管，氨基酸脱羧酶试验接种后还应覆盖液体石蜡。三糖铁（TSI）琼脂试验应底层穿刺，斜面涂抹接种。底层产酸表示葡萄糖发酵，斜面产酸表示乳糖或蔗糖发酵，中段变黑表示产生HS。接种量应适中。以免影响结果。二、血清学试验血清学反应是指：相应的抗原与抗体在体外一定条件下作用，可出现肉眼可见的沉淀、凝集现象。在食品微生物检验中，常用血清学反应来鉴定分离到的细菌，以最终确认检测结果。血清学反应的一般特点：1)抗原体的结合具有特异性，当有共同抗原体存在时，会出现交叉反应。2)抗原体的结合是分子表面的结合，这种结合虽相当稳定，但是可逆的。3)抗原体的结合是按一定比例进行的，只有比例适当时，才能出现可见反应。4)血清学反应大体分为两个阶段进行，但其间无严格界限。第一阶段为抗原体特异性结合阶段，反应速度很快，只需几秒至几分钟反应即可完毕，但不出现肉眼可见现象。第二阶段为抗原体反应的可见阶段，表现为凝集、沉淀、补体结合反应等。反应速度慢，需几分、几十分以至更长时间。而且，在第二阶段反应中，电解质、pH、温度等环境因素的变化，都直接影响血清学反应的结果。一般将经典的血清学反应分三种类别：凝集反应、沉淀反应和补体结合反应。凝集反应颗粒性抗原（细菌、红细胞等）与相应抗体结合，在电解质参与下所形成的肉眼可见的凝集现象，称为凝集反应（Agglutination reaction）。其中的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。在该反应中，因为单位体积抗体量大，做定量实验时，应稀释抗体。直接凝集反应颗粒性抗原与相应抗体直接结合所出现的反应，称为直接凝集反应(Direct agglution reaction)。a.玻片凝集法。是一种常规的定性试验方法。原理是用已知抗体来检测未知抗原。常用于鉴定菌种、血型。如将含有痢疾杆菌抗体的血清与待检菌液各一滴，在玻片上混匀，数分种后若出现肉眼可见的凝集块，即阳性反应，证明该菌是痢疾杆菌。此法快速、简便，但不能进行定量测定。b.试管凝集法。是一种定量试验方法。多用已知抗原来检测血清中有无相应抗体及其含量。常用于协助诊断某些传染病及进行流行病学调查。如肥达氏反应就是诊断伤寒、付伤寒的试管凝集