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反复缺血再灌注制备小鼠血管性痴呆模型的评价作者：靳玮，宋春风，吕佩源，尹昱，郭宗成，李玲，何春年，翟金萍 作者单位：050051 石家庄，河北省人民医院神经内一科(靳玮、吕佩源、郭宗成、李玲)，康复科(尹昱)，病理科(何春年、翟金萍)；河北医科大学电镜中心(宋春风) 【摘要】 目的 对应用反复缺血再灌注法制备的小鼠血管性痴呆（VD）模型进行评价,为VD的基础研究提供较为理想的动物模型。方法 50只小鼠随机分为模型组(n=30)和假手术对照组，模型组采用双侧颈总动脉丝线结扎方法、经连续3次反复缺血再灌注，制备VD模型；对照组仅分离双侧颈总动脉，但不阻断血流。测试2组小鼠的学习记忆成绩；光学显微镜下观察海马CA1区神经细胞形态学变化，并采用免疫组化技术观测该区胆碱乙酰转移酶（ChAT）表达的变化。结果 跳台试验中模型组小鼠术后第29d的反应时间(125.432.5)s较对照组(24.92.9)s明显延长(P0.01)，错误次数增多(P0.01)；术后第30 d的潜伏时间(8029)s较对照组(20037) s明显缩短(P0.01)，错误次数增多(P0.01)。水迷宫试验中模型组小鼠术后第29 d、30 d游完全程时间(14317)s,(16211)s较对照组(688)s,(525)s明显延长(P0.01)，错误次数增多(P0.01)。海马CA1区ChAT免疫组化观察中模型组阳性神经元面密度值为0.0860.009，较假手术组(0.1230.015)明显降低（P0.01）。结论 反复缺血再灌注法制备的小鼠模型是研究血管性痴呆较为理想的动物模型。 【关键词】 血管性痴呆;缺血再灌注;跳台试验;水迷宫试验;胆碱乙酰转移酶;小鼠 The evaluation on the mouse model of vascular dementia by repeated ischemiareperfusion method JIN Wei，SONG Chunfeng,LV Peiyuan,et al.Department of Neurology, Hebei Provincial Peoples Hospital, Shijiazhuang 050051,China 【Abstract】 Objective To evaluate the mouse model of vascular dementia (VD) established by repeated ischemiareperfusion method, in order to provide an available animal model for the basic research of VD. Methods 50 Kunming mice were randomly devided into two groups: the control group and VD group. In VD group, mice were subjected for continuously repeated three times ischemiareperfusion through the ligation of the bilateral common carotid arteries to establish VD model.The behavioral abnormalties were investigated by stepdown test and watermaze test. The changes of neurons in hippocampal CA1 were observed through light microscope and choline acetyltransferase (ChAT) in neurons of hippocampus were observed by immunohistochemistry technique. Results In stepdown test, the response period of mice in the VD group (125.432.5s) was prolonged evidently than control group (24.92.9s) (P0.01), and the error times increased (P0.01) on the 29th day after operation.the latent period in the VD group (8029s) was decreased significantly than control group (20037s) (P0.01),and the error times increased (P0.01) on the 30th day after operation.In watermaze test,the swimming time of mice in VD group was (14317)s and (16211)s on the 29th and 30th day after operation,which was evidently prolonged than that of control group (68s8s and 52s5s respectively)(P0.01);and the number of error increased (P0.01).The neurons were damaged and the expression of ChAT decreased(0.0860.009 vs 0.1230.015,P0.01).Conclusions The model established by repeated ischemiareperfusion injury is a reliable VD model, which imitated the clinical intelligent dysfunction of VD. 【Key words】 Vascular dementia;Ischemiareperfusion;Stepdown test;Water maze;ChAt;Mice 血管性痴呆（vascular dementia, VD）是由各种脑血管疾病导致的获得性、持续性智能障碍综合征。在西方国家,VD成为继阿尔茨海默病之后第二种导致痴呆的病因,而在亚洲某些地区,VD则是老年期痴呆的主要构成部分1。VD的发病率波动于(13)/1 000人/年2，随着社会人口脑血管病发病率的不断上升，VD愈来愈成为医学研究的热点。本研究应用反复缺血再灌注法制备小鼠VD模型，运用免疫组化技术，观测海马乙酰胆碱合成的关键酶胆碱矣酰转移酶（choline acetyltransferase, ChAT）的表达变化，同时从行为学、病理学角度对模型进行评价。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物： 3月龄雄性昆明小鼠50只，购自河南华兴实验动物养殖中心，合格证号：医动字第19-052号，平均体质量(32.52.0) g。 1.1.2 试剂及仪器： ChAT免疫组化试剂盒（武汉博士德生工有限公司生产）；小鼠电刺激跳台仪 (中国医学科学院药研所制造)；小鼠水迷宫自动记录仪（中国医学科学院药研所制造）。 1.2 方法 1.2.1 模型制作： 50只小鼠随机分入假手术对照组(20只)和VD模型组（30只）。将小鼠用10%水合氯醛(0.035 ml/10 g)腹腔注射麻醉后，分离双侧颈总动脉，并以“40”丝线阻断血流20 min，可以观察到小鼠惊厥、呼吸深慢、心跳加快；同时在距鼠尾尖约1 cm处断尾，放血约0.3 ml。松开丝线扣恢复血流10 min后，再次阻断血流20 min，如此重复3次，第3次血流再灌注后观察30 min，如小鼠呼吸、心跳平稳，即可缝合皮肤，放回笼中正常饲养。其中对照组仅分离双侧颈总动脉，套丝扣；但不阻断血流，尾部不放血，观察时间、饲养条件与模型组相同。 1.2.2 小鼠学习和记忆成绩测试： (1)跳台试验。术后第29 d，记录小鼠首次由通电铜栅找到安全台所需时间即反应时间 (response period)、动物跳下圆台次数即错误次数 (number of error)，作为学习测试成绩。术后第30 d，直接将小鼠置于安全台上，同时铜栅通电，记录小鼠第一次从台上跳至铜栅的时间即潜伏时间 (latent period)、动物跳下圆台次数即错误次数(number of error)，作为记忆测试成绩。(2)水迷宫试验。记录小鼠游完全程时间(swimming time)和进入盲端的次数即错误次数(number of error)，3 min内不能游出者按3 min计。术后第29 d的测试成绩为学习成绩。术后第30 d，直接让小鼠游水迷宫进行测试，同样记录其游完全程时间、错误次数，作为记忆测试成绩。 1.2.3 海马神经细胞形态学观察： 术后第30 d，各组小鼠断头处死，剥出脑组织，保留视交叉至乳头体之间的脑组织，迅速置于4%多聚甲醛溶液中固定，而后常规脱水、透明、浸透、石蜡包埋，冠状切片，厚度5 m, 0.1%硫堇染色，光学显微镜下观察海马细胞形态变化。 1.2.4 免疫组化染色观测海马CA1区ChAT阳性神经元： 每组随机取出6只小鼠,取脑后按照试剂盒说明书操作。1040倍光学显微镜下观察所有标本，在1010方格参照体积内计数阳性染色细胞截面与方格横线的交点数，各切片海马CA1区随机计数3个视野，取其均值，然后依据截点/总线长法, 计算各切片海马CA1区阳性细胞面密度值。 1.3 统计学处理 运用SPSS 11.5软件进行处理，所有数据以均数标准差(s)表示，采用单因素方差分析，P0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 一般情况 对照组小鼠无死亡，VD模型组小鼠死亡8只（死亡率26.67%）。 2.2 行为学测试 跳台试验所测试的各组小鼠学习和记忆成绩见表1。VD模型组与对照组比较，术后第29 d的反应时间明显延长，错误次数增多(P均0.01)；术后第30 d的潜伏时间明显缩短，错误次数也增多(P0.01)；提示模型组的学习和记忆成绩均劣于对照组。水迷宫试验所测试的各组小鼠学习和记忆成绩见表2。模型组与对照组比较，术后第29 d、30 d小鼠游完全程时间明显延长，错误次数增多(P均0.01)。表1 跳台试验中小鼠的学习和记忆成绩 表2 水迷宫试验中小鼠的学习和记忆成绩注：与对照组比较,*P0.01 2.3 神经元硫堇染色观察 对照组海马硫堇染色显示海马轮廓清楚，锥体细胞23层，数目多，排列紧密，细胞核圆而大，核仁清晰，胞浆内尼氏体丰富(图1见封3)。模型组海马CA1区锥体细胞层次减少，排列松散，锥体细胞数目减少，胞浆内尼氏体减少甚至消失，细胞核体积变小，深染，结构不清，呈核固缩表现(图2见封3)。 2.4 海马CA1区ChAT免疫组化阳性神经元观察 对照组CA1区层次清楚，有大量的ChAT免疫阳性神经元，排列紧密，呈棕黄色，胞体较大，圆形或椭圆形，有的可见突起(图3见封3)。而模型组阳性神经元数目明显减少，排列松散，染色较淡(图4见封3)。经计量发现，对照组ChAT免疫反应阳性神经元面密度值为0.1230.015，模型组为0.0860.009，2组差异有统计学意义（P0.01）。 3 讨 论 建立可靠的动物模型是研究VD发生发展机制及防治措施，疗效评价的关键。理想的VD动物模型应符合以下要求:病理机制与人类相似,易于进行认知功能的评价,动物来源方便,造模方法具有可行性等。目前，有多种建立VD动物模型的方法，经典者如“4管法”,该方法的优点是成功率高,病理损伤与VD相似,缺点是手术复杂,动物创伤大,死亡率高；微栓子栓塞致多发脑梗死性痴呆大鼠模型也是较常用的方法，与临床多发脑梗死性痴呆在很大程度上近似，但二者在病理机制上仍有差异。此外，还有“2管法”、立体定向光化学法、自发性高血压脑卒中倾向大鼠VD模型等，存在着操作复杂、手术创伤大、动物死亡率高等缺点3，因而仅适用于急性脑缺血研究，不利于长期、大规模观察，或因实验动物有严重运动功能障碍，而无法对其进行行为学检测。 本实验中，模型组小鼠海马组织缺血坏死明显，存在显著的学习、记忆损害，而无明显的运动障碍，其原因可能是反复缺血再灌注对脑组织产生了累积损伤效应，造成对缺血更为敏感的海马结构的明显损害，而其他脑区损害相对不明显。现在越来越多的证据表明胆碱能系统的损害参与了VD的形成，海马胆碱能神经元的损伤可能是认知功能受损害的形态学基础4，5。ChAT是胆碱能神经元的特殊标志，其分布与Ach的分布几乎平行，故常可作为研究胆碱能神经的标志。本结果显示海马CA1区ChAT免疫反应阳性神经元面密度值明显降低，进一步证实了该造模方法导致小鼠学习记忆障碍的可靠性。 作为参与学习和记忆功能的重要结构6，海马是对缺血、缺氧损伤最为敏感的区域，前脑反复缺血再灌注造成海马结构损伤可能是学习和记忆受损的原因。脑组织反复缺血对该部位神经元有累加损伤作用，这种反复的（20 min3次）非致死的缺血比一次60 min的缺血，对海马神经元损伤更为严重7。有研究采用反复缺血法制备蒙古沙鼠VD模型，在造模后4周可以观察到模型组沙鼠有着显著的认知功能障碍，且海马CA1区神经元数目明显减少8。本课题组在其他部分研究中应用透射电镜观察小鼠反复缺血再灌注术后第30 d海马超微病理结构发现海马神经元水肿，核固缩，细胞器明显减少，形态异常，且突触数量减少9。以上资料为本实验制备VD模型提供了重要的理论依据。 本实验制备的VD模型，其海马病理切片显示锥体细胞发生凋亡,推测其原因是反复缺血再灌注损伤造成海马神经元膜磷脂代谢障碍，产生大量的自由基、兴奋性氨基酸，并导致细胞内钙超载，引起某些原癌基因的表达，诱导细胞凋亡的发生。海马神经元凋亡造成N甲基D天门冬氨酸(NMDA)受体2B表达减少10;此外，由于脑缺血使得血氧供应下降，进而抑制三羧酸循环，Ach合成原料及辅酶供应不足，导致海马Ach合成减少，含量降低，进而影响实验动物的学习和记忆功能，最终导致痴呆。综上所述,该模型能较好地模拟人类VD的发生，加之手术操作简单，重复性好，创伤小，动物死亡率低等优点，不失为研究VD比较理想的动物模型。晋升网（）设有论文学院、考试学院、在线投稿等，本网站致力于成为医务工作者晋升职称心灵导师；是目前国内收录医学期刊、医学杂志最多最权威的医学学术平台；提供免费医学期刊在线阅读；网罗和甄选海量优秀医学论文检索，独立研发医学在线资源分享库和医学在线模拟考试库；整合刊类、标题、关键词检索及全文检索，并独家研发刊社管理和刊社加盟系统、在线投稿、在线查稿、在线阅读、远程审稿、在线下载等系统；聚刊社力量，建服务平台，让晋升网通过“专业”走入每一个医务人员的身边是我们不懈的追求目标【参考文献】1 Knopman DS, Parisi JE, Boeve BF, et al. Vascular dememtia in a populationbased autopsy studyJ. Arch Neurol, 2003,60(4):569575.2 Knopman DS, Rocca WA, Cha RH, et al. Incidence of vascular dementia in Rochester, Minn, 1985-1989J. Arch Neurol,2002,59(10):1 6051 610.3 SchmidtKastner R, Paschen W, Ophoff BG, et al. A modified fourvessel occlusion model for inducing incomplete forebrain ischemia in ratsJ.Stroke,1989,20(7):938946.4 Tomimoto H, Ohtani R, Shibata, M, et al. Loss of cholinergic pathways in vascular dementia