原核表达步骤总结.doc

原核表达步骤 原核表达先要将基因克隆到原核表达载体上，然后通过转化到JM109或BL21等菌株中，诱导表达蛋白，然后进行蛋白纯化。本实验方案的前提是，目的基因已克隆到载体，并已转进入JM109菌株中。一 鉴定目的蛋白是否在大肠杆菌JM109或BL21中大量表达（一） 制样1 . 挑取经过双酶切鉴定的单克隆菌落于700ul LB培养基，加入0.7ul Amp（100mg/mL），37oC200r/min摇床培养，过夜活化。2. 以1：50比例（200ul），将活化的过夜培养物加入10mL LB液体培养基中，加入10uLAmp（100mg/ml），37oC200r/min摇床扩大培养2h-3h，期间取样监控菌液的OD值，控制菌液OD600在0.6-1.0之间，以使大肠杆菌处于最适合表达外源蛋白的生长状态。(一般3h时，菌液浓度及达到标准，但是不同的基因对菌的影响不同，所以第一次实验时需要确定这个最佳时间)3. 从10ml扩大培养物中取3ml菌液作为不加IPTG的空白对照（CK），其余7ml菌液加入7ul IPTG（储存浓度为0.5mol/l），使IPTG终浓度达到0.5mmol/l。以200r/min的转速，37oC摇床培养3h。4. 以5000r/min离心2min收集菌体，倾倒上清，每个离心管收集3ml培养物。5. 加入1ml dH2O，将管底沉淀用振荡器打散以充分洗涤，8000r/min离心2min，倾倒上清。6. 重复步骤5。将离心管中的水倒干净。（二）菌落SDS-PAGE 1. 在收集的菌体中加入200ul 1SDS PAGE loading buffer(可根据沉淀的量增加或减少loading buffer的量，一般200ul比较合适)。用漩涡器剧烈震荡，确保将管底沉淀震散。 2. 将样品于100恒温加热器上开盖加热10min（Marker也要加热）。样品凉后，12000r/min离心3min，取每管的上清点样。上样量一般30ul40ul，marker 20ul。（三） SDS-PAGE分析1. 根据目的片段的大小，制作不同浓度的分离胶蛋白分子量 (kDa)凝胶浓度 (%)4-402012-451510-701215-1001025-2008分离胶（两块）配方15%12%8%ddH2O3.4ml4.9ml6.9ml30% Acr-Bis (29:1)7.5ml6.0ml4.0ml1.5M Tris-HCl（ pH8.8）3.8ml3.8ml3.8ml10%SDS150ul150ul150ul10%过硫酸铵150ul150ul150ulTEMED20ul20ul20ul总体积15ml15ml15ml按表中所列顺序从上到下加试剂，加完TEMED后，轻轻摇匀液体，一块胶加7ml溶液。加完后， 用1mLddH2O封住分离胶液面，在室温（37）凝结30min，至分离胶与水之间出现一条清亮的分界线，倾倒水层，用滤纸条将残余的水吸干。2.制作浓缩胶 浓缩胶（两块）配方5%ddH2O3.4 mL30% Acr-Bis (29:1)0.85 mL1M Tris-HCl（ pH6.8）0.63 mL10%SDS50 uL10%过硫酸铵50 uLTEMED20 uL总体积5ml胶配好后混匀，灌胶2ml，插梳子时根据点样量和浓缩胶长短调整梳子插入的深度，于室温(37)凝胶30min。3.胶凝好后，拔梳子，将胶放入电泳槽中，加入1Tris-Gly电泳缓冲液没过点样孔，胶外侧缓冲液界面应完全没过电极4.Marker点5uL，用10uL小枪点样，以防样品冲出点样孔与旁边样品混杂。电压打到70V，保证电流在20mA-30mA之间，当样品跑入浓缩胶时可适当调高电压，但不宜多次调整电压，否则条带会跑歪。5.当溴酚蓝电泳至胶槽底部时,一般需要2.5h，停止电泳，剥胶，将浓缩胶部分切除后，加入考马斯亮蓝染色液，40r/min染色3h，可以过夜染色。6.用移液器回收考马斯亮蓝染色液，再用蒸馏水将浮色冲洗干净后，倒入考马斯亮蓝脱色液，40r/min脱色至胶背景透明，期间可每2h更换一次脱色夜。 根据菌落SDS-PAGE的结果，可以看到目的蛋白是否大量表达。二 鉴定目的蛋白形成的是包涵体还是可溶性蛋白1. 从冻存的菌液中取10ul，接种于5ml的LB培养基中，加入5ul Amp(100 mg/ml),过夜活化菌株。2. 按照1：50的比例，从活化的菌株中，取1ml菌液接种于50ml LB培养基中，加入50ul Amp(100 mg/ml)，扩大培养3 h。3. 扩大培养后的菌液,取出10ml，不加IPTG，作为空白对照。剩余的40ml菌液中加入40ul IPTG（0.5mol/l）,诱导蛋白表达。两者在37，200rpm的条件下培养3h。4. 用50ml 离心管收集菌体，8000rpm，离心3min。注意配平。5. 倒掉上清，加入40ml左右的dH2O洗菌体一遍，12000 rpm，离心2min。注意要将菌体充分打散。6. 倒掉上清，用枪头将上清吸干净。根据菌体的浓度，加入适量的PBS buffer 悬浮菌体。7. 用大功率的超声波将菌体破碎，其间超声波每工作2min，停止1min。菌体要始终保持在冰水混合物上，以保证低温，蛋白不易变性。如此反复6-10遍，直至菌液清澈。8. 12000rpm， 离心3min，分离上清和沉淀。9. 在沉淀中加入250ul 1SDS Loading buffer ,取200ul 上清，加入50 ul 5SDS Loading buffer，在恒温加热器上100加热10min。 10.加热后的样品冷却到室温后，12000rpm，离心2min。11.取上清40ul 点样，按照一中的方法进行SDS-PAGE检测。点样顺序是：对照的上清，沉淀，样品的上清，沉淀。12.根据SDS-PAGE结果，判断目的蛋白是以包涵体还是以可溶性蛋白的形式产生。如果蛋白在沉淀中大量表达，则形成包涵体，需要改变诱导表达条件，比如将扩大培养与诱导培养的温度改为25，并延长相应培养时间。如果蛋白在上清中表达，则形成可溶性蛋白，可继续进行下一步实验。三 纯化目的蛋白（整个过程要尽量保持在4进行）1. 大量诱导目的蛋白（一般需要2-4 L的菌量），用超声波破碎细胞，收集上清。2. GST纯化柱的柱床保存在20%的乙醇中，使用之前，先用吸管将柱床轻轻加入到柱子中，打开柱子，流出乙醇，使柱床沉积下来。3. 加入10ml PBS buffer,洗柱床3遍，使得柱床重新平衡。4. 将准备好的样品加入到柱子中，每次加入5-10ml样品，使样品结合在柱子上（每次上样量不能太多，因为柱子的结合能力有限）。5. 用PBS buffer洗柱子3遍，每次用10ml，去除柱子中非特异性结合的杂蛋白。6. 加入5ml洗脱液（10m mol/l的还原型谷胱甘肽，用50mmol/l tris-bufferr或者PBS buffer溶解）将目的蛋白洗脱出来。用1.5ml离心管收集流出来的样品，每管接0.5ml样，一共收集6-8管(一般情况，第一管流出的是PBS，第二和第三管大部分是目的蛋白，所以OD值很大，第三至第六管的OD值慢慢降低。不要偷懒一次接太多，不然会影响后续收集蛋白。还原型谷胱甘肽很容易被氧化，如果一次没有用完，请用保鲜膜封口置于4度冰箱保存，超过2天的话请更换新的洗脱液。)7. 用PBS buffer洗柱子1遍。8. 用分光光度计测每一管的OD值，记录下读数，将读数大于200的样品留下(一般是第2至第4管)，冻于-20冰箱中。9. 重复步骤4-8，直至所有样品均纯化完毕。10.可以用SDS-PAGE检测纯化出来的样品浓度以及纯度。重生柱子的方法：（柱子使用三四次之后，需要重生，即让柱子上的GST结合基团重新暴露出来）1用还原型谷胱甘肽洗脱液洗柱子3遍，每次加入10ml。2. 用 PBS缓冲液洗柱子4遍，每次加入10ml。3. 用50 mmol Tris HCl（pH 8.0）洗柱子3遍，每次加入10ml。4用0.5M NaCl（pH 8.0）洗柱子3遍，每次加入10ml。5. 用100 mM醋酸钠（pH 4.5）洗柱子3遍，每次加入10ml。6. 用0.5M NaCL洗柱子3遍，每次加入10ml。柱子长时间不用，需要按照以下方式清洗及保存：1. 按照重生的1-6步骤先将柱子重生一遍。2. PBS洗柱子2遍，每次加入10ml。3. 将柱床用吸管吸出，分别用5%，10%，15%，20%的乙醇洗2遍。4. 用单蒸水轻轻冲洗柱子底部的膜，洗出杂蛋白。5. 柱床保存在含20%乙醇的PA瓶中。柱子和柱床置于4度冰箱保存。如果柱子用于纯化不同的蛋白， 只需要按照重生方法的1，2步骤操作即可，然后直接纯化另外一个蛋白。如果柱子流速很慢，可能是柱子底部的膜被杂蛋白堵住了。柱子重生之后，将柱床用吸管吸出，然后用单蒸水将柱子底部的膜轻轻冲洗，再将柱床加入到柱子中，重新上样。如果柱子需要重生，请用完柱子的同学自觉完成这份工作，以免影响下一位同学的使用。 四 根据不同的用途浓缩蛋白1. 若蛋白用于制作抗体如果洗脱液用的是tris-bufferr配制的，需要用1/4的PBS buffer进行透析，然后在冷冻干燥机中冻干浓缩，因为公司