酶组织化学.doc

（一）A1型题(标准型)1.免疫组化技术的关键步骤是 A.标本处理 B.抗体的处理与保存 C.免疫染色D.设立对照试验 E.结果判断2.免疫组化技术的首要试剂是 A.抗原 B.抗体 C.标记物D.固定剂 E.洗涤液3.酶免疫组化技术中，关于标本处理的说法正确的是 A.充分洗后于室温用0.3%H2O2和80%甲醇处理2030min。B.充分洗后于室温用0.3%H2O2和80%甲醇处理4050min。C.充分洗后于室温用0.5%H2O2和90%甲醇处理2030min。D.充分洗后于4用0.3%H2O2和80%甲醇处理2030min。E.充分洗后于4用0.3%H2O2和80%甲醇处理4050min。4.PAP法是Sterberger等于哪一年建立的 A.1950B.1960C.1970D.1980E.19905.PAP复合物中的酶是 A.辣根过氧化物酶B.碱性磷酸酶C.葡萄糖氧化酶D.胃蛋白酶E.胶原酶8.PAP法中的“桥”是 A.第一抗体B. 第二抗体C. 第三抗体D.亲和素E.第四抗体9.ABC技术由美籍华人Hsu于哪一年建立，已广泛应用于免疫学检测技术 A.1961B.1975C.1981D.1985E.199010.ABC法中的“桥”是指 A.第一抗体B. 第二抗体C. 第三抗体D.亲和素E.链霉素亲和素14.免疫组化法吸收试验是用过量已知抗原与抗体在多少度以下充分反应，离心后再行免疫组化染色 A.4B.20C.40D.37E.5023PAS反应是检测组织内的：A.核酸 B.脂C.蛋白质D.多糖E.抗原一、填空1、免疫组织化学中最常用的标记物是_荧光素_、_酶_ 、生物素和亲和素_、_铁蛋白和胶合金_。原位杂交组织化学中常用的标记物有_放射性同位素_和非同位素标记物_两大类。2、 常用的粘附剂有_蛋白甘油_、甲醛明胶_、多聚赖氨酸_等。3、抗原决定簇是指_抗原_分子表面的、具有活性的_特异性化学集团_。4、一般组织化学是利用化学或物理反应，在组织标本上加入一定的_化学试剂_，使其发生反应，形成_有色沉淀物_，能在显微镜下观察。常用于检测_糖类_脂类_、核酸_ 、_酶_等。5、酶组织化学是利用酶对其_底物_的催化作用 ，生成初反应产物_，再与某种_捕捉剂_反应，形成_有色终反应物沉淀物_沉淀，检测_酶_分布及活性的方法。常用的方法有_金属沉淀法_ 、_偶氮偶联法_、_四唑盐法_、_靛蓝法_和_DAB法_。6、最常用于显示细胞、组织内的多糖和蛋白多糖的方法是_PAS反应_。7.、免疫染色对特殊标本的进一步处理常用 _蛋白酶消化法_和_非特异吸附法_法。8、免疫组化中最常用的制片方法是_冰冻切片_和_石蜡切片_。9、免疫组化染色后，阳性细胞的染色分布有三种类型，分别是_胞质型_、_细胞核型_和_细胞膜表面型_。10、酶免疫组化技术中最常用的酶有 辣根过氧化物酶_、碱性磷酸酶_及_葡萄糖氧化酶_。11、免疫电镜标本的制备主要有_非包埋法免疫染色_、包埋前免疫染色_和_包埋后免疫染色_三种。 12、组织块包埋前需先经_固定 _，常用的包埋剂是_石蜡、火棉胶、炭蜡_13、光学显微镜下观察的固定标本除组织切片外，还有_涂片_、_铺片_和_磨片_。14、免疫细胞化学术中常用的标记物有_荧光素、酶_、_胶体金、亲和物质_和_铁蛋白一、名词解释;1.HE染色法： 苏木精 伊红染色法 ( hematoxylin-eosin staining ) ，简称HE染色法 ，石蜡切片技术里常用的染色法之一 。苏木精染液为碱性 ，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色 ；伊红为酸性染料 ，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色 。HE染色法是组织学、胚胎学、病理学教学与科研中最基本、使用最广泛的技术方法。2固定： 为了更好的保持细胞和组织原有的形态结构，防止组织自溶，有必要对细胞和组织进行固定，其作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，终止或抵制外源性和内源性酶活性，更重要的是最大限度的保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。3.银染法： 又称镀银或银浸法，是显示神经细胞、神经纤维和网状纤维的一种方法，在分子生物学中用于DNA核苷酸序列分析，将切片浸于银盐（如硝酸银）染料中，使银盐沉淀在这些结构的表面而显出黑褐色，其余结构不着色，这样观察切片就很清晰。4冷冻切片： 是新鲜组织或固定组织在低温下快速冷冻后制备组织切片的方法。一般是将组织块置于干冰或液氮中使其快速冻结，然后在恒冷箱切片机内制冷冻切片。制片快速，常用于外科手术切除标本的快速病理诊断。5.组织化学（histochemistry）和细胞化学（cytochemistry）技术：是通过化学或物理反应原理显示组织切片细胞内某种化学成分，进行定位、定量及其与功能相关的研究。如糖类、脂类、酶、核酸等与试剂发生化学物理反应，形成有色终末产物，在光镜下观察，有的可在电镜下观察。6.免疫细胞化学技术：是应用免疫学原理，通过特异性标记抗体与抗原（某种蛋白质、多肽等）的结合来显示细胞内某种抗原，并进行定位和定量的研究方法。免疫组化技术，是在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，借助可见的标记物，对相应抗原或抗体进行定位、定性和定量检测的一种免疫检查方法。7.原位杂交：是在免疫细胞学化学的基础上发展起来的一种核酸分子杂交技术，用来检测细胞内某种蛋白质的基因（DNA片段或mRNA片段）表达和定位与定量研究，目前已经成为细胞生物学、分子生物学研究的重要手段。其基本原理是应用已知的并被标记的核酸片段（同位素或荧光素、酶等标记的探针）与细胞内待测核酸（RNA或DNA片段）进行杂交，在光镜和电镜下观察目的mRNA或DNA的存在与定位。8.胶体金：是氯金酸的水溶液，具有亲电子密度，并能与多种生物大分子结合，已成为继荧光素、放射性核素和酶之后在免疫标记技术中较常用的一种非放射性示踪物。9.简述石蜡切片的制备过程：1取材及固定2冲洗3脱水和硬化4透明5浸渗6包埋7塑型和切片8展片和粘片9染色和封固最后，将干燥好的切片上的浮色擦净，并在玻片的左端粘上标签，注明组织切片的名称、染色方法、固定方法、年月日。10.背景着色：为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用血清（与二抗来源一致）封闭，减弱背景着色。血清封闭的时间是可以调整的，一般10-30min。11. 一抗和二抗：第一抗体就是能和非抗体性抗原特异性结合的蛋白。种类包括单克隆抗体和多克隆抗体。第二抗体是能和抗体结合，即抗体的抗体，其主要作用是检测抗体的存在，放大一抗的信号。第一抗体就是平常所说的抗体，即能和抗原特异性结合。第二抗体是能和抗体结合的，即抗体的抗体。主要用于检测抗体的存在。一抗是针对抗原的抗体，二抗是针对一抗的抗体。12.探针：是一小段单链DNA或者RNA片段（大约是20到500bp）， 用于检测与其互补的核酸序列。双链DNA加热变性成为单链，随后用放射性同位素（通常用磷-32）、萤光染料或者酶（如辣根过氧化物酶）标记成为探针。13.免疫组织化学技术：利用标记物标记的抗体与组织或细胞的抗原反应，结合形态学检查，对抗原做定性、定量、定位检测的技术。三、简答题（一）免疫组织化学的全过程包括哪些步骤？ 1.抗原的提取与纯化；2.免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体及纯化；3.将显色剂与抗体结合形成标记抗体；4.标本的制备；5.免疫细胞化学反应以及呈色反应；6.显微镜下观察结果。（二）2.免疫组化标本固定时，好的固定剂应满足哪些要求？ 要求：1能快速固定抗原2防止抗原物质扩散3固定后的抗原能被抗体识别，不影响抗原 抗体反应（三）3.简述荧光免疫组化技术直接法的原理？ 原理：将荧光素标记的已知抗体（或抗原）与切片（印片）中相应抗原（或抗体）直接发生反应，以检测组织与细胞标本中的靶抗原（或抗体）。（四）4.何谓免疫电镜技术？指免疫电镜技术是将抗原抗体反应的特异性与电子显微镜的高分辨力相结合的在亚细胞和超微结构水平上对抗原进行定位分析的一种高度精确、灵敏的技术。此技术成功的关键是对细胞超微结构的完好保存保持被检细胞或其亚细胞结构的抗原表位，其抗原性不受损伤选择的免疫试剂能顺利穿透组织细胞结构与抗原结合。四论述题（一）1.试述酶免疫组化技术的原理及其应用？原理：酶免疫组化技术是利用酶标记已知抗体（或抗原），然后与组织标本中相应抗原（或抗体）在一定条件下相互结合形成带酶分子的复合物，酶遇到底物时，能催化底物水解，或氧化或还原，产生有色的不溶性产物，出现显色反应，在显微镜下进行细胞与组织表面或内部某种抗原成分的定位观察分析。免疫组化在人体研究中的主要用途：免疫组化在肿瘤病理学的研究和诊断中的主要应用：（1）组织起源不明肿瘤的研究；（2）研究病原体与肿瘤的关系；（3）协助确定肿瘤的良恶性；（4）测定肿瘤细胞的增殖活性；（5）分化差的癌和肉瘤的鉴别；（6）确定转移性恶性肿瘤的原发灶；（7）恶性淋巴瘤的诊断和分型；（8）为制定肿瘤的治疗方案提供依据。免疫组化技术在病原微生物的鉴定中的应用；免疫性皮肤疾病在诊断中的应用（2） ：2. 试述任意3种酶组织化学技术的反应原理?1 金 属 沉 淀 反 应 法 酶 的 分 解 产 物 可 与 大 多 数 金 属 结 合 金 、 银 、 铜 、 铁 、其 化 合 物 均 具 有 颜 色 因 此在 酶 反 应 时 使 其 与 金 属 结 合 利 用 其 呈 色反 应 显 示 出 酶 反 应 的 部 位间 接 地 证 明 某 种 酶 的 存 在 。 该 法 主 要 用 于 显 示 磷 酸酶 如 显 示 碱 性 磷 酸 酶 的 钙 钴 法 和 显 示 酸 性 磷 酸 酶 的 硝 酸 铅 法 。2 偶 联 偶 氮 法 此 法 又 称 偶 氮 色 素 法 其 基 本 原 理 是 使 用 某 种 人 工 合 成 底物，在 酶 作 用 下 产 生 分 解 产 物 与 重 氮 盐 结 合，引 起 偶 联 偶 氮 反 应 形 成 不 溶 性 偶氮 色 素 以 此 对 酶 进 行 定 位 。 3 色 素 形 成 法 在 酶 作 用 下 使 底 物 的 无 色 化 学 物 质 在 作 用 的 局 部 形 成 色素 沉 着，从 而 达 到 显 示 酶 定 位 的 目 的。常用的有四唑盐法靛蓝形成法 （三）3. 试述免疫荧光双标记技术（间接法）的原理和当两种一抗及两种二抗分别混合使用时应注意的问题？原理：先用已知未标记的特异抗体（一抗）与抗原反应，再用标记的抗体（二抗）与其反应，形成抗原-抗体-抗体复合物，水洗-干燥-封镜-镜检（四）4. 试述免