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枯草芽孢杆菌在生物菌肥中的应用 作者07级生物工程4班陈聪指导教师马传营 山东农业大学学士学位论文答辩 1 研究背景2 试验方法3 结果分析4 展望 山东农业大学学士学位论文答辩 1 研究背景长期以来 化学肥料的大量使用带来土壤板结 土壤微生物区系发生变化 食品质量不安全等问题 生物菌肥是近年来发展起来的一种新型肥料 具有改善土壤 抗旱 培肥地力 抵抗病虫害 解决土壤化肥农药残留问题等作用 枯草芽孢杆菌作为植物病害生防菌之一 具有较强的防病作用 该菌制剂的批量生产工艺简单 成本较低 使用方便 储存期长 其制剂稳定性强 是一种较理想的生防微生物 山东农业大学学士学位论文答辩 2 试验方法 发酵种子培养 实验室发酵生产监测 拮抗实验 山东农业大学学士学位论文答辩 发酵种子培养 菌种活化将枯草芽孢杆菌种子瓶与200ml的lb培养基拿入无菌操作室 以1 1000的比例在每瓶培养基中加入200 l种子 放入摇床36 200r min培养过夜 山东农业大学学士学位论文答辩 种子扩大培养将上步得到的200ml培养瓶中的菌种按3 的接种量接种到500mllb培养基中 36 200r min摇床培养 预得上罐前的种子 山东农业大学学士学位论文答辩 发酵生产监测 发酵生产模拟 实验室发酵罐 配制好工业发酵培养基 按流程进行洗罐 空消 投料 室消 降温 接种后进行每天两次的发酵生产监测 山东农业大学学士学位论文答辩 发酵生产监测实验室进行0004 0005 0006发酵罐的生产监测 每天上午 下午个一次 取样制片a 直接压片b 复染镜检 山东农业大学学士学位论文答辩 拮抗实验利用平板对峙法进行枯草芽孢杆菌 bacillussubtilis 对玉米小斑病菌 bipolarismaydis 的拮抗实验 将培养好的2mm 2mm的玉米小斑病菌菌丝块接于燕麦培养基中央 25 培养3d 在离接种处25mm的左右两边分别划线接种枯草芽孢杆菌 对照组只接种玉米小斑病菌菌丝 25 培养5d 记录并观察菌丝生长状况 每组处理3次重复 山东农业大学学士学位论文答辩 3 结果分析 发酵生产监测 山东农业大学学士学位论文答辩 发酵生产模拟中 菌种经过短暂的延滞期后进入对数生长期 在最初阶段 菌体处于对数生长阶段 此时菌体尚未达到最高峰 待菌体进入稳定期之后 发酵进入产物合成阶段 在此期间 菌体数目几乎恒定 发酵过程中 菌体稳定期是产物的最佳收获期 当开始出现芽孢时 说明部分菌体已进入发酵末期 在大量芽孢出现 菌体量减少时 整个发酵进入发酵末期阶段 发酵生产几乎结束 有的发酵罐内前一天情况正常 第二天观察有大量杂质存在 菌体量与芽孢量都比较少 这种情况应该是发酵过程中受到污染 可能是取样过程中操作不恰当引起 在染杂菌的情况下 如果情况较轻 可以降低培养 减少补料 如果发酵单位到达一定水平时可以提前放罐 除了污染的发酵罐外 其他发酵罐总体趋势正常 整个过程几乎与工业生产的正常发酵周期相符 山东农业大学学士学位论文答辩 拮抗实验下表为每天测量的各组的菌丝直径 山东农业大学学士学位论文答辩 下列以第一组数据为例绘制了菌丝直径变化曲线 山东农业大学学士学位论文答辩 山东农业大学学士学位论文答辩 在拮抗实验的过程中 无论是对照组还是实验组 前两天菌丝的生长都较快 从第三天开始 接种了枯草芽孢杆菌的培养皿中病原菌的菌丝生长几乎停滞 而对照组的病原菌菌丝仍处于继续生长状态 接种了枯草芽孢杆菌的培养基上明显出现了抑菌带 在菌丝直径与时间关系图表中也可以明显地看出没有接种枯草芽孢杆菌的对照组菌丝生长状况比实验组要好一些 实验观察结果显示 在接种了枯草芽孢杆菌的培养基上 玉米小斑病菌的菌丝较对照组所占的培养皿面积少很多 菌体生长受到抑制 4 展望枯草芽孢杆菌作为一种有效的生防细菌具有很辽阔的研究空间 目前在全球范围内有数百株野生型枯草芽孢杆菌记录保存 该细菌可以产生40余种抗菌物质 其中很多具有优良性状的菌株已应用于生产实践 更多具有优良形状的菌株仍有待于开发研究应用 随着环境问题在全球范围内越来越受到重视以及农业可持续发展策略的应用 生物菌肥的开发 生产及应用力度在不断扩大 生物菌肥作为一种无毒无害的产品将越来越受到人们的青睐 生物菌肥的推广势将成为肥料发展的必然趋势 致谢 感谢山东中北生物科技有限公司为我提供这次实习的机会 让我可以将所学的专业知识真正应用于工业生产中去 在实习期间 马传营老师 汤艳超师兄 孙凯师兄等人的热心指导帮助 为我的学位论文的完成奠定了坚