结核病诊断技术.doc

第2章 实验室检验技术结核病实验室检查，特别是细菌学检查是结核病确诊和治疗的主要依据。结核病细菌学检验主要包括4项基本技术，即涂片染色镜检、分枝杆菌分离培养、分枝杆菌药物敏感性试验、分枝杆菌菌种鉴定。检验人员应依据临床医师检验申请要求并结合实验室的设备和技术条件，负责对标本进行检验，及时、准确地填写检验报告。 近年来，国内、外研究者在分子生物学、分子微生物学及免疫学领域建立了若干快速、敏感、特异的检测新技术，为可疑结核病患者的早期诊断与合理治疗带来了新的希望。列入“规范”的结核杆菌临床基因扩增(PCR)检验技术、分枝杆菌快速培养及药物敏感性试验技术、免疫学检测技术，因有多种试剂盒(试剂)及分析仪器可供选择，目前尚难制定统一的技术操作规范，故暂定为辅助操作技术。具备开展这些技术项目条件的实验室(或检验科)，须经有关主管部门批准后，严格按照相应技术所附的说明书与操作规程实施。 鉴于结核病实验室检查，特别是细菌学检查在结核病控制工作中的重要性，为保障相应检查项目结果的可靠性，要求相应的检查项目必须由经过培训并考核合格的专职人员完成，且开展相应检查的实验室应具备安全操作设施，制定实验室内部质量控制措施，同时接受专业结核病实验室的质量控制督导和培训。 第一节 结核茵检验实验室安全操作规则结核病细菌学实验室必须具有与其服务级别相应的装备，其原则是能满足该级别实验室的需要，使实验室工作人员得到充分的防护，并避免造成环境污染。 1实验室应有合理布局及合适的单向(外排)通风体系。 2实验室应配备相应的防护设备，以保护工作人员的安全和实验工作的顺利进行。分离培养、药物敏感性测定、菌种鉴定试验等操作应设有生物安全操作柜或接种间和通风橱等。 3实验室工作人员应按正确方式进行技术操作，穿戴隔离衣、口罩和帽子等。 4实验室所有带毒废弃物应灭菌及无害化处理。 5建立清洁消毒制度，限制非工作人员进入室内，禁止在实验室饮食和吸烟等。 6进行下列操作时应严格按照技术操作规范，防止产生细菌气溶胶：涂片制作；培养液的倾倒和转移；高速混合含菌液体；滴加、接种培养物；吸管稀释和混合菌悬液；取样器和振荡器的使用；细菌细胞超声粉碎；感染动物实验等。 第二节 标本的采集、运送和保存初诊患者应送3份痰标本(夜间痰、清晨痰和即时痰)。如无夜间痰，在留取清晨痰后23h再留取1份痰标本，或在送检时，留取2份即时痰。疗程中或复诊随访患者按期每次送检2份痰(清晨痰和夜间痰)。 一、痰标本的采集1即时痰为病人就诊时咳出的痰液；清晨痰为就诊当天清晨深咳出的痰液；夜间痰为就诊前夜咳出的痰液。合格的痰标本应是脓样、干酪样或脓性黏液样痰液，痰量应为35ml。 2痰标本应由检验人员或经培训合格的专人验收，痰液不合格者，要求重新送检。难以获得合格标本时，也应进行细菌学检查，但应注明标本性状，以便分析结果时参考。 3留取痰标本的容器应为广口、直径4cm、高2cm、有盖密闭的塑料盒或蜡纸盒，容器上应注明患者姓名、编号(门诊序号或患者登记号)及送检日期。 二、痰标本的保存和运送留取痰标本后，应将容器密封，切勿倒置，严防痰液外溢。需外送检查的标本应认真核对痰盒上的标注是否正确清晰，是否与检验单一致，痰容器应采用专用的冰盒，或以纸张和塑料袋封装、扎牢，顺序放置于包装袋内，注明盒盖向上的标示，严防运送途中倒置。当天不能检查的痰标本须置4冰箱保存。 三、其他标本的采集、运送和保存1尿液及胸、腹水标本留全量夜尿或胸、腹水，静置45h后，弃上清液，取沉淀部分至少10ml送检。 2大便、脓液、病灶组织或干酪块、脑脊液标本 应至少留取或采集23ml (g)，采集后立即送检。 3标本运送和保存可参考本节痰标本的保存和运送。 第三节 涂片检查法一、玻片的准备取经95乙醇擦拭脱脂的干燥、清洁、无油污、无划痕的新玻片，于玻片背面的左端13处用玻璃笔编号。一张玻片只能涂抹一份痰标本，每张玻片只能使用 1次，不得清洗后再次用于抗酸染色检查。 二、直接涂片法1痰液及脓液用接种环或专用竹签挑取标本的脓样、干酪样部分00501ml，于玻片正面的右侧23中央处均匀涂抹成2cm25cm椭圆形痰膜，自然干燥。 2病灶组织或干酪块先用组织研磨器磨碎后再行涂片。 3尿液及胸、腹水标本 留全量夜尿或胸、腹水，静置45h后，弃上清液，取沉淀部分约10ml，经60008000rmin(60008000rpm)离心20min，取沉渣涂片。 4脑脊液无菌操作收集脑脊液，放置冰箱或室温24h，薄膜形成后涂片。也可将脑脊液经60008000rmin离心20min，弃上清液，取沉淀物涂片。 5粪便标本与生理盐水混匀后，充分振荡使之成为混悬液；定性滤纸过滤后，滤液经60008000rmin离心20min，取沉淀涂片检查。 6咽喉棉拭子 棉拭子放入无菌试管，加入适量生理盐水浸泡，并强烈振荡，取出棉拭子后，液体经60008000rmin离心20min后，取沉淀涂片检查。 三、集菌涂片法1漂浮集菌法 取深咳痰或1224h痰液经121高压灭菌15min，待冷却后，取510ml盛于容积为100ml的玻璃容器中(口径约2cm)，加灭菌蒸馏水20 30ml，总体积勿超过容器的13，加二甲苯03ml，放振荡器振荡10min，取出，加蒸馏水至满瓶口，将已编号的载物玻片盖于瓶口上，静置20min，取下载玻片，自然干燥，火焰固定，染色镜检。 2离心集茵法 取深咳痰或1224h痰液经121高压灭菌15min，待冷却后，取510ml盛于容积为500ml的离心管中，加水至50ml，经60008000r min离心20min后，取沉淀涂片检查。 四、染色、镜检方法(一)萋尔一尼尔逊抗酸染色法 萋尔一尼尔逊(ZiehlNeelsen)抗酸染色法，简称萋一尼氏染色法。 1染色液 染色剂08苯酚(石炭酸)复红溶液 脱色剂5盐酸乙醇液 复染剂03亚甲蓝溶液 2染色步骤 (1)涂片自然干燥后，火焰固定。 (2)滴加复红染色剂盖满痰膜，小心火焰加热，出现蒸汽后脱离火焰，保持染色 3min。染色期间应始终保持痰膜被染色液覆盖，必要时可续加染色液。加温时勿使染色液沸腾。 (3)流水自玻片背面上端轻洗，洗去染色液。 (4)自痰膜上端外缘滴加脱色剂，流过痰膜，须脱至痰膜无可视红色为止。脱色应单片进行。 (5)流水自玻片背面上端轻洗，洗去脱色液。 (6)滴加亚甲蓝复染剂，染色30s。 (7)流水自玻片背面上端轻洗，洗去复染液。 (8)待干后镜检。 3镜检与报告 (1)用双目光学显微镜(目镜10，油镜100)镜检，在淡蓝色背景下，抗酸杆菌呈红色，其他细菌和细胞呈蓝色。 (2)按照下列标准报告镜检结果 抗酸杆菌阴性(一)：连续观察300个不同视野，未发现抗酸杆菌。 报抗酸杆菌数：18条抗酸杆菌300视野。 抗酸杆菌阳性(1+)：39条抗酸杆菌100视野。 抗酸杆菌阳性(2+)：19条抗酸杆菌10视野。 抗酸杆菌阳性(3+)：19条抗酸杆菌每视野。 抗酸杆菌阳性(4+)：10条抗酸杆菌每视野。 (二)荧光染色法 1染色液 (1)染色剂：01金胺“O”(Auramine O)溶液 (2)脱色剂：3盐酸乙醇液 (3)复染剂：05高锰酸钾水溶液 2染色步骤 (1)涂片自然干燥，经火焰固定。 (2)加染色剂1015min，水洗。 (3)加脱色剂12min至无黄色，水洗。 (4)加复染剂12min，水洗，待干镜检。 3镜检与报告 (1)在暗色背景下，抗酸杆菌呈黄绿色或橙色荧光。必须用40物镜确认菌体形态，应具有萋一尼氏抗酸染色镜检经验后，方可应用荧光染色法，荧光法难以确认时，应进行萋一尼染色检查，以免错判或漏判。荧光染色后涂片应在24h内检查，如须隔夜，置4保存，次日完成镜检。 (2)物镜20检查结果按下列标准报告 荧光染色抗酸杆菌阴性(一)：0条50视野。 报荧光染色抗酸杆菌数：19条50视野。 荧光染色抗酸杆菌(1+)：1099条50视野。 荧光染色抗酸杆菌(2+)：19条每视野。 荧光染色抗酸杆菌(3+)：1099条每视野。 荧光染色抗酸杆菌(4+)：100条每视野。 物镜40检查细菌细胞形态。 五、涂片检查法质量控制应建立室内、室间痰片检验质量控制制度。 室内质控应包括痰标本收集、痰片染色和镜检结果复验。室内质控应每季度进行1次，痰涂片应保存供上一级参比实验室(或质控机构)质量控制检查。 室间质控可定期进行，阳性痰涂片符合率应98，阴性痰涂片符合率应 96，(1+)以上的阳性片不允许出现假阴性。 六、废弃标本和污染物的处理痰盒和废弃标本等污染物，均须经高压蒸汽灭菌后才能丢弃或清洗，严禁不经灭菌随意处理。 痰盒等污染物如采用焚烧处理，须置于焚烧炉内彻底焚化。焚烧不彻底或暴露焚烧是有害的。 痰检工作面的消毒：可将痰标本置于一搪瓷盘中，在操作橱内进行痰涂片操作。操作完毕后将盘与废弃物一并进行高压蒸汽灭菌，或与操作台面同时以3苯酚(石炭酸)或其他可靠消毒液擦拭后，再以紫外线灭菌灯(距离12m)照射 30min。 附录1：萋-尼氏染色试剂的配制 18苯酚复红染色剂 碱性复红乙醇贮存液(碱性复红8g，溶于95乙醇 100m1中)10ml，加5苯酚水溶液至100ml，混匀。 25盐酸乙醇脱色剂 浓盐酸5ml加95乙醇至100ml，混匀。 303亚甲蓝复染剂 亚甲蓝03g加95乙醇50ml待溶解后，加蒸馏水至100ml，混匀，即为贮存母液，使用时10倍稀释。 附录2：荧光染色试剂的配制 11金胺“O”染色液 金胺“O01g溶于95乙醇10ml内，加5苯酚至 100ml，混匀。 23盐酸乙醇脱色液浓盐酸3ml加95乙醇至100ml，混匀。 305高锰酸钾复染液05g高锰酸钾加蒸馏水至100ml，混匀。 第四节 分枝杆菌分离培养检查法分枝杆菌属(Mycobacterium)迄今报道有100多个种。伯杰系统细菌学手册将分枝杆菌菌种划分为两大类：缓慢生长分枝杆菌与快速生长分枝杆菌。在营养丰富的培养基上，接种很稀的新鲜培养物，在适宜培养温度下。7d以上肉眼可见单个菌落，称为缓慢生长分枝杆菌，其代表菌种是结核分枝杆菌(Mtuberculo sis)。在上述条件下，7d以内肉眼可见单个菌落，称为快速生长分枝杆菌。分枝杆菌属，除结核分枝杆菌复合群(结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌)及麻风分枝杆菌外，余者统称为非结核分枝杆菌(Nontuberculosis Myco bacteria，NTM)。 结核分枝杆菌是专性需氧菌，最适生长温度为37，最适pH为6572。 对营养要求较高，专嗜甘油作为碳源，天门冬酰胺是最好氮源。 分枝杆菌分离培养检查法，是结核病确诊最可靠的方法。是获得纯培养物进行菌种鉴定、药物敏感性试验以及其他生物学研究的基础。 一、培养基分离培养基采用酸性改良罗氏培养基。 (一)成分 谷氨酸钠(纯度99以上)72g 磷酸二氢钾(KH2PO4) 140g 硫酸镁(MgSO47H2O)024g 柠檬酸镁 06g 丙三醇 12ml 马铃薯淀粉 30g 蒸馏水 600ml 新鲜全卵液 1000ml 2孔雀绿水溶液 20ml 注1：无机盐试剂应采用化学纯(CP)以上等级的试剂。 注2：WHO在“结核病控制实验室工作手册(1998)”中建议分离培养使用无淀粉的改良罗氏培养基。 (二)制备方法 1基础液制备量取蒸馏水600ml，加入各无机盐成分、谷氨酸钠和丙三醇，溶解后加马铃薯淀粉，混匀，沸水浴1h使呈糊状(不时摇动，防凝块)，冷却。 2新鲜鸡卵液制备洗净新鲜鸡卵表面，浸泡在70乙醇或其他稀释消毒液中2030min。取出，拭干，开口，收集鸡卵液，搅匀。通过消毒的纱布过滤成鸡卵液。 3培养基制备将600ml基础液和1000ml新鲜鸡卵液混匀。加入2孔雀绿水溶液20ml，混匀，静置1h后，分装至标准螺旋盖培养管或灭菌中试管中，每管 7ml。双层放置于搁架中，经培养基蒸汽凝固灭菌器85凝固灭菌50min。培养基斜面应占试管的23。制成的培养基应斜面鲜艳，表面光滑，有一定韧性和酸碱缓冲能力。 4培养基保存 制成的培养基经37无菌试验24h，检查培养基污染情况后置4避光保存，1个月内使用。 二、去污染处理(一)痰标本 视标本性状，加12倍体积4氢氧化钠(NaOH)消化液于痰瓶中，拧紧螺旋盖，涡旋振荡器上振荡1min，使痰液充分匀化，室温放置。自加入氢氧化钠消化液起，整个处理时间应在1520min。样本份数较多时，应分批处理。 (二)其他标本 1脓液采用4硫酸(H2SO4)处理。标本与4 硫酸(H2SO4)以1：3混匀后，静置25min(其间振荡数次)，按无菌手续接种01ml经处理的标本至LJ培养基，每份标本接种2支培养基。酸处理去污染时间不超过25min。 2病理组织或干酪块 标本切碎后置于无菌组织研磨器，加入适量(051 容积)生理盐水后充分研磨成混悬液；混悬液经3000rmin离心30min后，沉淀物进行碱处理与24倍量2氢氧化钠(NaOH)混合，处理15min后接种。 3尿液 留全量夜尿，静置45h，取沉淀部分约10ml，3000rmin离心 30min，取沉淀进行碱处理与等倍量4硫酸(H2SO4)混合，处理15min后接种。 4胸、腹水、支气管灌洗液标本参照痰标本处理方法。 5脑脊液无菌操作收集的脑脊液，置冰箱或室温24h，待薄膜形成后将薄膜接种到LJ培养基；或将脑脊液在无菌操作环境中3000rmin离心30min，取沉淀直接接种到L-J培养基。非无菌操作采集的脑脊液标本，离心后的沉淀进行碱处理 与等倍量4氢氧化钠(NaOH)混合，处理1015min后接种于酸性L-J培养基。 6粪便标本与生理盐水混合后，充分振荡使之成为混悬液；定性滤纸过滤后，滤液经3000rmin离心10min；沉淀进行酸处理与24倍量的4硫酸 (H2SO4)混合，处理1520min)后接种L-J培养基。 7咽喉棉拭子 将棉拭子放入一无菌试管，加入适量生理盐水浸泡，加入等体积4氢氧化钠(NaOH)后强烈振荡，静置15min后接种。 三、接种和培养用吸管取去污染后的标本01ml，均匀接种在整个培养基斜面，每份标本接种 2支酸性罗氏培养基。接种后斜面向上于37环境中平放24h后，检查培养基污染情况，拧紧瓶盖，直立放置，37继续培养。 四、结果报告1接种后第3、7天各观察1次菌落生长情况。发现菌落生长者，经抗酸染色证实后，可报告快速生长分枝杆菌阳性。此后每周观察1次，记录菌落生长及污染 情况。阳性生长物经抗酸染色证实后，可报告分枝杆菌生长。满8周后未见菌落生长者方可报告培养阴性结果。 2观察时发现非分枝杆菌生长时，应报告污染。培养污染率应在25范围内。污染率过高，提示培养基灭菌不佳，标本前处理、接种等环节有误，应当分析原因，采取相应措施。 3培养结果报告方式 (1)分枝杆菌培养阴性：斜面无菌落生长，以“培养阴性”报告，不可以“一”表示。 (2)分枝杆菌培养阳性(1+)：菌落生长占斜面面积的14。 (3)分枝杆菌培养阳性(2+)：菌落生长占斜面面积的12。 (4)分枝杆菌培养阳性(3+)：菌落生长占斜面面积的34。 (5)分枝杆菌培养阳性(4+)：菌落生长布满整个斜面。 (6)报实际菌落数：菌落生长不足斜面面积14。 第五节 分枝杆菌快速培养检查分枝杆菌快速培养检查是使用分枝杆菌快速培养仪，通过测定细菌生长代谢检测分枝杆菌生长情况的方法。由于应用营养丰富的液体培养基，并且检测仪能连续监测，故提高了从标本中分离分枝杆菌的敏感性进而缩短报告结果的时间。 为保证检查方法的可靠性，目前分枝杆菌快速培养检查系统除提供相应仪器、试剂以外，均根据不同系统制定了相应的临床标本前处理、接种、检测和报告结果的规程，故在进行相应的检查时，结果的可重复性和可比性均能得到认可。 在进行分枝杆菌快速培养检查时，标本接种前的去污染处理，必须严格按照系统说明书中规定的方法进行。孵育检测过程中系统报告阳性时，相应标本的培养液必须首先进行抗酸染色镜检，发现抗酸菌后方可发出阳性报告。 第六节 分枝杆菌药物敏感性测定法 一、培养基(一)基础培养基 无淀粉改良罗氏培养基： 谷氨酸钠(纯度99以上) 72g 磷酸二氢钾(KH2PO4) 24g 硫酸镁(MgSO47H2O) 024g 柠檬酸镁 06g 丙三醇 12ml 蒸馏水 600ml 新鲜全卵液 1000ml 2孔雀绿水溶液 20ml 注：无机盐试剂应达到化学纯(CP)以上等级。 (二)抗结核药物溶液的配制和稀释 1药敏试验用抗结核药物应从厂家取得纯品，并确认纯度和效价，在有效期内使用。 2异烟肼(INH)、利福平(RFP)、氨硫脲(TBl)、乙硫异烟胺(TH)、环丝氨酸(SC)的生物效价按其重量单位计算，计算用药量时只需考虑其纯度。链霉素硫酸盐(SMSO4)、乙胺丁醇盐酸盐(EMBC1)、卡那霉素硫酸盐(KM SO4)、卷曲霉素硫酸盐(CPMSO4)、紫霉素硫酸盐(VMSO4)、对氨水杨酸钠盐 (PAS-Na)等在考虑其纯度的同时，应按生产厂家标定的毫克效价计算其盐型药用量。 3加入培养基中实际药量的计算可参考下列公式： 上述公式中各变量的单位： 实际药量：mg 效价：培养基内药物终浓度：gml 纯度：需制备培养基体积：ml 4绝对浓度法每种药物按表2-1制成高浓度药液，再按相应比例稀释成低浓度药液。5比例法按表2-2所述浓度制备药物储存液，分装至无菌试管，每管5 10ml，封口，一20保存，3个月内使用。 6除RFP、TBl、TH用二甲基甲酰胺溶解，再用灭菌蒸馏水稀释外，其他药物可用灭菌蒸馏水溶解、稀释。 (三)含药培养基制备 1每100ml基础培养基加入1ml配制、稀释好的抗结核药液，混匀，无菌分装每管7ml，85凝固50min。 2制成的培养基37无菌试验24h，检查培养基污染情况后置4避光保存， 1个月内使用。 二、药敏试验方法(一)绝对浓度法间接法 1菌悬液制备 (1)临床分离分枝杆菌的新鲜培养物(初生长2周)无须二次传代即可做药敏试验，初生长2周以后和贮存培养物须在改良罗氏培养基上二次传代，取23周的亚培养物进行试验。 (2)取上述培养物(须刮取斜面各个部分的培养物)置于玻璃磨菌器底部，插入磨菌棒捻动使呈乳酪样，以05聚山梨醇-80(吐温-80)生理盐水磨菌稀释，与标准麦氏比浊管(MacFarland No1)比浊，即配成1mgml的菌悬液。 2接种将1mgml的菌悬液10倍稀释至001mgml(10-2mgml)，以灭菌 吸管准确吸取菌液01m1分别接种于含药培养基和对照培养基斜面上，每管接种菌量为1O-3mg。置37培养，4周后观察结果。 3结果报告 按下列方式报告对照及含药培养基上菌落生长情况。 (1)分枝杆菌培养阴性：斜面无菌落生长。 (2)分枝杆菌培养阳性(1+)：菌落生长占斜面面积的14。 (3)分枝杆菌培养阳性(2+)：菌落生长占斜面面积的12。 (4)分枝杆菌培养阳性(3+)：菌落生长占斜面面积的34。 (5)分枝杆菌培养阳性(4+)：菌落生长布满整个斜面。 (6)报告菌落数：培养基斜面上菌落数少于20个时。 4质量控制 每批试验应以结核分枝杆菌参考菌株(H37Rv敏感株)10-3mg检测含药培养基质量。接种10-3mg要求对照培养基菌落数在200个以上且无融合，若菌落数低于50个时，要求重新做药敏试验。 (二)比例法 1茵悬液制备 同绝对浓度法。 2稀释、接种和培养 (1)菌液稀释：静置片刻，使菌液中的颗粒或菌块沉淀后，用刻度吸管或22号标准接种环将1mgml的菌液上清逐步稀释至001mgml和01mgml。 22号接种环100倍稀释法：用22号标准接种环沾取2满环1mgml的菌液，移至2ml灭菌生理盐水中，即稀释成001mgml菌液；用同样方法再进行100 倍稀释，即成10-4mgml菌液(注：22号标准接种环：金属丝直径O7mm，接种环内径3mm，1满环移液001m1)。 微量吸管10倍稀释法：用无菌微量刻度吸管吸取05ml上述1mgml菌悬液至45ml的灭菌生理盐水可加入05聚山梨醇-80(吐温一80)中，即可得到 0.mgml菌液。按上述方法连续进行10倍稀释，可得到001ragml和01mg ml的菌液。 (2)接种：用22号标准接种环分别沾取1环(即001m1)001mgml和 01mgml的菌液，用划线法均匀接种至对照及含药培养基表面，应注意使菌液尽可能均匀分散于培养基斜面。最终接种菌量为10-4mg和10-6mg。 (3)培养：接种后的培养基置于37培养，4周后报告结果。 3结果报告及解释 (1)按以下方式记录菌落生长情况。 少于50个菌落： 实际菌落数 50100个菌落： 1+ 100200个菌落： 2+ 大部分融合(200500个菌落)： 3+ 融合(大于500个菌落)： 4+ (2)计算耐药百分比： 若耐药百分比大于1，则认为受试菌对该抗结核药耐药。4质量控制 (1)若高稀释度菌液(10-4mgml)在对照培养基上生长的菌落数少于20个菌落，则应从对照管传代培养，重复试验。 (2)每批试验以结核分支杆菌参考菌株(H37Rv敏感株)10-3mg检测含药培养基的质量。 附录3：麦氏1号比浊管的制备 01m1 1氯化钡(BaCl3)加入99ml1硫酸(H2SO4)，封口，比浊前摇匀。 第七节 分枝杆茵菌种鉴定一、分枝杆菌微生物学概述目前报道的分枝杆菌种类已有100余种。在微生物分类中，分枝杆菌属于放线菌目、分枝杆菌科、分枝杆菌属。 在结核病流行病学研究和临床诊断检验中，通常将分枝杆菌分为结核分枝杆菌复合群(TB complex)和非结核分枝杆菌(nontuberculosis mycobacteria， NTM)。结核分枝杆菌复合群包括四种分枝杆菌：结核分枝杆菌(Mtuberculo sis)，牛分枝杆菌(Mbovis)，非洲分枝杆菌(Mafricahum)和田鼠分枝杆菌(M- microti)。临床上最常见的是结核分枝杆菌和牛分枝杆菌。 根据“伯杰细菌鉴定手册”(Bergey manual of determinative bacteriology，9the- dition)，将分枝杆菌菌种分为两大类：一是在营养丰富的培养基内，在适宜的温度条件下，接种很少的细菌分离物，孵育7d以内肉眼可见单个菌落者为快速生长分枝杆菌；超过7d的则为缓慢生长分枝杆菌。缓慢生长分枝杆菌根据其色素产生的情况，又进一步分为光产色、暗产色和不产色三组。 二、分枝杆菌菌种鉴定的实验流程经抗酸染色镜检确定为抗酸菌的培养阳性菌株，必须首先接种改良罗氏(LJ)培养基进行增菌传代。 进行分枝杆菌菌种鉴定，首先经对硝基苯甲酸(PNB)生长试验、28生长试验、耐热触酶试验、观察记录细菌的生长速度、菌落形态和菌落颜色等来确定该菌株为结核分枝杆菌复合群或非结核分枝杆菌。 经菌群鉴定试验确定属于结核分枝杆菌复合群的菌株，再进行噻吩-2-羧酸肼 (TCH)培养基生长试验、硝酸还原试验和烟酸试验进行菌种鉴定。 属于NTM的菌株，首先根据生长速度确定属于快速生长还是缓慢生长的分枝杆菌。快速生长的分枝杆菌可通过生长特征和生化实验进行菌种鉴定；缓慢生长的分枝杆菌经色素产生试验确定菌株的产色特征后，再通过生长特征和生化试验确定菌株的种类。 分枝杆菌菌种(菌群)鉴定试验流程参见图21。 三、分枝杆菌菌群鉴定试验分枝杆菌菌群鉴定的目的既是鉴定菌株属于结核分枝杆菌复合群还是非结核分枝杆菌，也是进行进一步菌种鉴定的基础。 分枝杆菌菌群主要通过菌株在含对硝基苯甲酸(PNB)的鉴别培养基上的生长情况、28生长情况、生长速度、耐热触酶试验及观察菌株的菌落形态、颜色等生物特征来进行区分。通过上述试验，可将需要鉴定的菌株划归结核分枝杆菌复合群或非结核分枝杆菌菌群。 (一)对硝基苯甲酸(PNB)生长试验 结核分枝杆菌复合群在含有PNB的培养基中生长受到抑制；大多数NTM菌种对一定浓度的PNB有耐受性。 培养基：PNB培养基(含PNB 500gml的L-J培养基)1支，L-J培养基1 支。 试验方法：每支培养基接种10-3mg细菌；37孵育，每周观察1次结果，同时记录PNB培养基和L-J培养基上菌落生长情况直至孵育4周。快速生长的非结核分枝杆菌1周左右可见菌落；缓慢生长的分枝杆菌4周报告结果。结核分枝杆菌复合群在PNB培养基上不生长。 阳性对照菌株：堪萨斯分枝杆菌(Mkansasii) 阴性对照菌株：H37Rv。 (二)28生长试验 结核分枝杆菌复合群在28的孵育环境中不能生长；而TNM菌群的大部分分枝杆菌可以生长。 培养基：2支L-J培养基。 试验方法：每支L-J培养基接种10-3mg细菌；1支置于28、1支置于37孵育，每周观察1次结果，同时记录罗氏培养基上菌落生长情况直至孵育4周。快速生长的非结核分枝杆菌1周左右可见菌落；缓慢生长的分枝杆菌4周报告结果。结核分枝杆菌复合群在28不生长。 阳性对照菌株：堪萨斯分枝杆菌(Mkansasii)。 阴性对照菌株：H37Rv。 (三)耐热触酶试验 多数NTM经68处理一定时间后，其过氧化氢酶仍保持活性，可分解过氧化氢。 试剂：ApH=70、00667molL(115M)PBS(无菌) B30H2O2(过氧化氢) C10聚山梨醇-80(Tween-80)水溶液(121灭菌10min，4保存，2周内使用) 试验方法：取在L-J培养基上生长旺盛的细菌约5mg，在装有15ml试剂A 的试管中研磨成菌悬液；放于68水浴20min，取出后立即冷却；缓缓加入等量混合的B、C(使用前配制)反应液05 ml。 结果判定：有持续小气泡产生的为阳性；1020min仍无气泡产生的为阴性；空白试剂对照无气泡产生。 阳性对照菌株：堪萨斯分枝杆菌(Mkansasii)。 阴性对照菌株：H37Rv。 空白对照：pH=70、00667molL(115M)PBS(无菌)。 四、结核分枝杆菌复合群菌种鉴定试验结核分枝杆菌和牛分枝杆菌占结核分枝杆菌菌群的绝大多数。这两种分枝杆菌，须同时采用下列实验进行鉴别。 (一)噻吩-2-羧酸肼(TCH)培养基生长 一定浓度的TCH对牛分枝杆菌和小部分结核分枝杆菌有抑制生长的作用；而对大部分结核分枝杆菌无抑制作用。 培养基：TCH培养基(含5gml TCH的罗氏培养基)1支，罗氏(L-J)培养基1支。 试验方法：每支培养基接种10-3mg细菌；37孵育4周时观察结果，同时记录TCH培养基和罗氏培养基上菌落生长情况。大部分结核分枝杆菌TCH培养基和罗氏培养基上菌落的生长情况相同；牛分枝杆菌在罗氏培养基生长良好，在 TCH培养基上生长受到抑制。 阳性对照菌株：H37Rv。 阴性对照菌株：牛分枝杆菌(Mbovis)。 (二)硝酸还原试验 结核分枝杆菌和部分NTM能够产生硝酸盐还原酶，可使硝酸盐还原为亚硝酸盐；在酸性条件下，亚硝酸盐与氨基苯磺胺、N-甲萘基乙烯二胺盐酸盐形成红色偶氮化合物。牛分枝杆菌和部分NTM因不能产生硝酸盐还原酶，故该实验阴性。 因此本实验可用于结核分枝杆菌与牛分枝杆菌的鉴别。 试剂：A硝酸盐溶液NaNO3(0085g)溶100ml PBSpH70、00667molL (115M) 内， 121灭菌20min，每管分装2ml。 B35的浓盐酸等倍稀释。 C02氨基苯磺胺水溶液(4保存，4周内使用)。 D01N一甲萘基乙烯二胺盐酸盐水溶液(4可保存4周)。 E锌粉：01 g。 试验方法：刮取4周菌龄、L-J培养基上生长旺盛的菌落约5mg，置于装有2 m1试剂A的试管中充分研磨并混匀，37水浴2h后取出。加入试剂B1滴、试剂 C、D各2滴；混匀。 结果判定：1min内呈红色为阳性；试剂混匀后1min内颜色无变化，加入01g 锌粉混匀观察5min，颜色仍无变化者为强阳性，出现红色或淡红色者为真阴性；空白对照从无色变为红色。 阳性对照菌株：H37Rv。 阴性对照菌株：牛分枝杆菌(Mbovis)。 空白对照：pH一70，灭菌的00667molL(115M)PBS。 (三)烟酸试验 由于结核分枝杆菌缺乏烟酸酶，故不能分解代谢过程中产生的烟酸。在培养基中，结核分枝杆菌生长时的烟酸聚集量较牛分枝杆菌及其他分枝杆菌高。烟酸吡啶核环的氮与联苯胺及溴化氰作用后，呈现桃红色或红色沉淀反应。但应注意，对INH 高度耐药的结核分枝杆菌可能此实验亦为阴性，应结合硝酸还原实验结果判定。 试剂：A3 联苯胺乙醇溶液。 B10溴化氰溶液(剧毒!在通风橱内配制)。 (注：上述试剂必须存放于褐色试剂瓶中，瓶口密封，4可保存2周。溴化氰溶液如发生沉淀，应在室温下溶解后使用。) 实验方法：取在罗氏培养基孵育4周且生长旺盛的一支培养管，将菌落用无菌吸管刮到培养基斜面一边，在暴露出的培养基斜面上加入2ml沸水，振荡数次后，将培养基平放在37孵箱中孵育30min(应注意使蒸馏水铺满斜面)。取浸提液 08ml平分到2支试管中，各加入01ml试剂A，混匀后向其中一支试管中加入 01ml试剂B，观察颜色变化。 结果判定：加人两种试剂的试管内菌液呈现红色或桃红色沉淀为阳性*；白色沉淀为阴性；空白试剂对照不变色。结果观察完毕后，加入4NaOH溶液，加塞混匀后放置24小时后方可消除溴化氰的毒性。 阳性对照菌株：H37 Rv*。 阴性对照菌株：牛分枝杆菌(Mboris)。 空白对照：生理盐水。 *由于烟酸含量在2g以上才出现阳性结果，故培养基上生长的菌落数一般必须在50个以上，否则可能出现假阴性结果。 结核分枝杆菌与NTM的鉴别见表2-3。 由于临床分离的菌株生物特性不稳定，故对结核分枝杆菌菌群的菌株进行菌种鉴定时应至少同时使用上述三种鉴定实验中的两种，以便对结果进行综合判定。 五、NTM菌群生长特征鉴定试验经菌群鉴定试验被划归为NTM菌群的分枝杆菌，如需要进一步进行菌种鉴定，应首先进行生长特征鉴定试验。相关试验主要目的是观察分枝杆菌的生长速度、色素产生情况、菌落形态特征、在各种鉴别培养基上生长情况等。 (一)生长速度 传代培养4周菌龄的NTM菌株，制备菌悬液并进行稀释；接种2支L-J培养基(10-3 mg支)后，分别置于28、37孵育；在第3、7天观察结果，以后每周观察 1次。1周内生长菌落的为快速生长NTM；反之则为缓慢生长NTM。 缓慢生长NTM对照菌株：堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)。 快速生长NTM对照菌株：草分枝杆菌(Mphlei)。 (二)色素产生 传代培养4周菌龄的NTM菌株，制备菌悬液并进行稀释；接种4支L-J培养基(10-3 mg支)后，2支培养基以锡纸或黑纸包裹密封，另2支不包。将两支培养基(1支包纸和1支不包纸)置于37培养，另2支置于28培养。不包纸的培养 基长出菌落时，打开2支包纸的培养管观察：有色素产生为暗产色菌；无色素产生者，放松胶塞进行通气，同时以100W钨灯近距离(灯与试管的距离50 cm)照射 3h，放置于原温度孵育3d，每日观察1次，产生色素者为光产色菌；不论光照与否，菌落均无色素产生者为不产色菌。 光产色对照菌株：堪萨斯分枝杆菌(Mkansasii)。 暗产色对照菌株：戈登分枝杆菌(Mgordonae)。 不产色对照菌株：胞内分枝杆菌(Mintracellulare)。 产色情况随培养温度变化的菌株：苏加分枝杆菌(Mszulgai)。 (三)苦昧酸培养基生长试验 培养基成分：谷氨酸钠(04g)、枸橼酸钠(02g)、KH2P04(O05g)、苦味酸 (O2g)、MgSO47H20(005g)和丙三醇(3m1)，溶解于97ml蒸馏水；以10 氢氧化钠(NaOH)调pH至7072，加琼脂3 g，12120min灭菌，分装试管制成斜面使用。 试验方法：接种01 mg细菌至培养基斜面，37孵育2周。有菌落生长者为快速生长菌。龟分枝杆菌不生长；脓肿分枝杆菌生长，二者可依此实验初步鉴别。 (四)5氯化钠(NaCI)培养基生长试验 培养基成分：罗氏培养基中按5(WV)加入氯化钠(NaCI)。 试验方法：接种10-3mg细菌，37培养；每周观察1次至4周。L-J培养基作为对照管。对照管及试验管均生长则为阳性；反之为阴性。快速生长菌不产色菌中龟分枝杆菌为阴性。 (五)谷氨酸钠葡萄糖琼脂培养基生长试验 培养基成分：谷氨酸钠O4g、磷酸二氢钾(KH2PO4)O05g、硫酸镁(MgSO4 7H2O)005g，溶于90ml蒸馏水，以10氢氧化钠(NaOH)调pH至7O72，然后加蒸馏水至100ml，再加琼脂3g，121灭菌20min，按1比例加入葡萄糖(注意无菌操作)，分装试管制成斜面。 试验方法：接种O1mg细菌(以罗氏培养基为对照)，37培养3周，观察结果；罗氏和琼脂培养基均生长者为阳性。 阳性对照菌株：胞内分枝杆菌(Mintracellulare)。 阴性对照菌株：鸟分枝杆菌(Mavium)。 (六)麦康凯琼脂培养基生长试验* 培养基成分：用不含结晶紫的麦康凯培养基制成平板。 试验方法：接种O1mg细菌，37培养511d(为保持平板湿度，可将平板放在铺有湿纱布的带盖容器中)。生长的菌落经抗酸染色确认。 阳性对照菌株：偶然分枝杆菌(Mfortuitum)。 阴性对照菌株：耻垢分枝杆菌(Msmegmatis)。 *此试验主要用于快速生长菌的鉴别。 六、NTM菌种鉴定常用生化特征试验(一)聚山梨醇-80(吐温-80)水解试验 某些分枝杆菌具有一种酯酶，可分解聚山梨醇-80(吐温-80)成为油酸等物质，使菌悬液的琥珀色变为紫红色。 试剂：O0667molL(115M)PBS(pH 70)100ml，加入05ml聚山梨醇-80和 01中性红溶液2ml，121灭菌20min后，每管分装3ml。可4保存，限2周内使用。 实验方法：用吸管挑取在罗氏培养基上生长旺盛的细菌约5 mg，置于装有 3ml试剂的试管中，37孵育10d。第3、5、10天观察结果。 结果判定：菌悬液由琥珀色变为紫红色者为阳性；不变者为阴性；空白试剂对照不变色。 阳性对照菌株：堪萨斯分枝杆菌(Mkansasii)。 阴性对照菌株：瘰疠分枝杆菌(Mscrofulaceum)。 空白对照：空白试剂。 (二)尿素酶试验 某些分枝杆菌产生尿素酶，可分解尿素使菌悬液呈红色。 试剂：A00667molL(115M)PBS(pH 67)，121灭菌20min，4保存。 B取试剂A配制012尿素，以022mm滤膜除菌，每支试管分装3ml。 C01酚磺酞(酚红)：取酚磺酞O1g加O05molL(120N)氢氧化钠(NaOH) 57ml溶解后，加水至100ml，113灭菌10min。 实验方法：用吸管挑取在罗氏培养基上生长旺盛的细菌约5mg，移置于装有3 ml试剂B的试管中，每管加入1滴试剂C；37孵育3d，观察结果。 结果判定：菌悬液呈红色者为阳性；不变色者为阴性；空白试剂对照不变色。 阳性对照菌株：结核分枝杆菌(Mtuberculosis)。 阴性对照菌株：蟾蜍分枝杆菌(Mxenopi)。 空白对照：空白试剂。 (三)芳香硫酸酯酶试验 某些分枝杆菌产生硫酸芳香酯酶，能分解二硫酸酚酞三钾盐，游离出酚酞，在碱性环境下出现紫红色。 试剂：A含二硫酸酚酞三钾盐的培养基：二硫酸酚酞三钾盐(分子量 61034)610 mg，加入100ml苏通液体培养基，混匀后12l灭菌15min，每支试 管分装2m1。 B106碳酸钠(NaCO3)水溶液。 实验方法：取装有试剂A的试管2支，分别加入生长旺盛的细菌菌悬液(20 40mgm1)05 m1；37孵育的第3、10天，分别取一支试管加入O5 m1试剂B后，观察颜色变化。 结果判定：菌悬液呈紫红色者为阳性；不变者为阴性；空白对照不变色。 阳性对照菌株：偶然分枝杆菌(Mf0rtuitum)。 阴性对照菌株：H37 Rv。 空白对照：空白试剂。 (四)铁离子吸收试验 某些分枝杆菌具有还原铁盐的能力。铁离子被吸收后，菌落呈铁锈色。 试剂：4枸橼酸铁胺水溶液，121灭菌15min，每支试管分装1ml，4保存， 3周内使用。 实验方法：接种前弃去改良罗氏培养基管内