鳜和鲢肌肉蛋白质氨基酸组成及其蛋白质组成的比较分析.doc

鳜和鲢肌肉蛋白质氨基酸组成及其蛋白质组成的比较分析唐建洲，张东裔，成 嘉，刘 芳，符贵红，张建社( 1. 长沙大学生物工程与环境科学系, 湖南 长沙 410003;2.湖南农业大学动物科技学院, 湖南 长沙 410128)摘要:采用高压液相色谱和二维电泳方法,对鳜和鲢肌肉组织蛋白质组成成分以及肌肉蛋白质双向电泳分布图谱进行了比较研究。研究结果证明, 鳜肌肉组织蛋白质干重为 34. 7% ,而鲢肌肉干重为33. 6% ;鳜肌肉组织中必需氨基酸含量和鲜味氨基酸(天冬氨酸和甘氨酸) 均高于鲢。同时, 将两种鱼肌肉蛋白进行 2D -gel 双向电泳分离, 发现鳜和鲢肌肉蛋白质组成和分布也存在明显的差异。本研究将肌肉蛋白质组成成分和蛋白的双向电泳技术结合起来, 进行蛋白质组分归类分析, 可为进一步研究两种鱼肌肉肉质研究打下基础,为水产业提供有价值的参考,为鱼类的养殖和肉质的改良、 利用提供一个指标。关键词:氨基酸;蛋白质组成; 二维电泳; 鳜;鲢第 31卷第 3 期 2007 年 5月 水产学报 JOURNAL OF FISHERIES OF CHINA Vol. 31, No. 3 May, 2007Comparative analysis of the amino acid composition and proteomic patternsof the muscle proteins from two teleosts, Siniperca chuatsi L. andHypophthalmichthys molitrix L.Received date: 09 -11 -2006接受日期：2006年9月11日1、引言水产品是人类赖以为生的重要食物来源之一。鱼类因含有较高的不饱和脂肪酸和丰富的必需氨基酸而尤为受到人们的青睐。青鱼(Mylopharyngodon piceus L.)、草鱼(Ctenopharyngodon idellus L.)、鳙鱼(Aristichthys nobilis L.)、鲢鱼(H. molitrix)四大家鱼是亚洲特别是中国主要的水产养殖种类。近年来，鳕鱼(Gadus morhua L.)、鲻鱼(Mugil cephalus L.)、银鲫(Carassius auratus gilebio L.)、鳜鱼(S. chuatsi)等一些国内外种类也作为密集养殖鱼类被大量养殖。其中鳜鱼因其肉质纹理奇特、味道鲜美且具有很高的营养价值而受到中国顾客的喜爱。我们认为鱼类肉质的差异可能是由于编码肌肉蛋白的基因控制产生了不同种类或者不同氨基酸组成的蛋白。大多数鱼类的蛋白质含量总质量的15%-20%，必需氨基酸占总氨基酸含量的20%-50%。Corser等人研究了12种鱼的脂肪酸组成、矿物成分以及必需氨基酸含量，结果发现，这些鱼的蛋白含量占18.7%-25.5%，必需氨基酸含量为8.73-10.93mg/g。Goodman-Lowe等人研究表明硬骨鱼类的粗蛋白和脂肪含量变化很大，必需氨基酸含量(35.82.6)%仅占非必需氨基酸含量(64.22.6)%的一半。蛋白组学分析是高通量表征蛋白表达模式的有效方法，能够分析鱼类种间以及不同组织间蛋白表达差异。蛋白质组学可用于鉴别物种、检测蛋白诱导表达、监测冰冻贮藏过程中鱼的肌肉蛋白的变化、评估不同加工条件下鱼类肌肉蛋白的变化，还可用于测定北极嘉鱼肌球蛋白同工酶含量。一些研究已经报道了虾类、鲑鱼、石斑鱼和鳕鱼的蛋白组学特性分析。本研究的意义主要有：(1) 比较了鳜鱼和鲢鱼肌蛋白含量及氨基酸组成的差异；(2) 首次采用比较蛋白组学分析了鱼类养殖研究中重要生物参数，如肌蛋白的差异表达。2 材料与方法2.1 鱼肌蛋白样品制备体重约500g的鲜活鳜鱼和鲢鱼购自长沙鱼市场（湖南长沙），养殖在实验室水箱中。鳜鱼种类根据外部解剖学特征鉴定。取每种鱼背部肌肉50g快速冻存于液氮中待使用时取出或者至于冰上并立即用于实验。2.2 肌蛋白氨基酸组成分析肌蛋白提取及氨基酸分析采用Chong等描述的方法，稍作改动。肌肉样品切成极细小的碎末，冷冻干燥，110恒温干燥箱中干燥24小时。称取5mg完全干燥的肌肉蛋白，置于200L含6mol/L 盐酸和1g苯酚的水化液中水化，真空干燥，液氮中冷冻处理3次。样品在105氮气环境中水化20-24小时，然后在10L样品干燥液（乙醇：水：柠檬酸铵，体积比2:2:1）中真空干燥直至盐酸和苯酚完全挥发。每个样品溶解在20L新制的溶液（B液：水：柠檬酸铵：苯异硫氰酸酯=7:1:1：1）中，室温条件下反应20-30分钟直至样品完全干燥。所得样品溶解在100L磷酸缓冲液（700mg Na2HPO4溶于100mL水，pH7.4），利用Alliance HPLC系统（C18HPLC柱，4.6250mm，Vydac）测定氨基酸组成。2.3 氨基酸标样和数据分析取10L氨基酸标准品（sigma）过Alliance系统，做254nm标准曲线，重复3次。样品测定采用相同的程序和参数，通过和标准品曲线比较确定样品中氨基酸的组成（出峰时间）和含量（峰面积）。2.4 双向电泳蛋白样品制备为提取鱼肌肉粗蛋白，取10g鱼背部肌肉在液氮中研磨30min，转移至离心管中，加入200L裂解液（0.5 mmol/L NaCl, 10mmol/L Tris-HCl(pH7.5), 1% TritonX-100, 0.1% SDS, 1mmol/L EDTA, 1mg/mL PMSF）处理30min。4, 100g离心30min，取上清，4，12000g离心30min，收集上清冻存于-80用于测定氨基酸含量和双向电泳。蛋白含量测定采用Bio-Rad操作手册中给出的Bradford法。双向电泳双向电泳参照Huang等的方法，稍作改动。第一向电泳采用18cm，线性pH 3-10的固定化干胶条（Amersham Biosciences）。干胶条在含8mol/L尿素，0.5% CHAPS，0.25% Pharmalyt 3-10，10mmol/L DTT，Orange G染料的水化液中过夜水化。取10g的蛋白样品，用水化缓冲液（8mol/L尿素，0.5% CHAPS，2.0% Pharmalyt 3-10，10mmol/L Tris-HCl(pH8.3)，0.1%(w/v) SDS）溶解稀释至0.8g/L，每根胶条上样30g。等电聚焦采用Multiphor 水平电泳系统（Amersham Biosciences），设定温度20，电泳参数为30V，10-16h；500V，1h；100V，1h；800V，30min。第一向电泳完成后，胶条冻存于-80，第二向电泳采用常规SDS-PAGE，在进行电泳之前，从-80取出的胶条需要经过两次平衡，第一次用平衡液（6mol/L 尿素，50mmol/L Tris-HCl(pH8.8)，30%(v/v)甘油，2%(w/v) SDS，1%(w/v) DTT）还原30min，第二次用10mL平衡液（4.5%(w/v)碘乙酸铵）烷基化处理10min。平衡后的胶条置于SDS聚丙烯酰胺凝胶上并用电泳缓冲液（25mmol/L Tris-base，192mmol/L 甘氨酸和0.1%(w/v) SDS）配制的0.5%(w/v)琼脂糖封闭。第二向电泳电压设置为：30V，15min，然后用100V电压直至考马斯亮蓝染料电泳至凝胶底部。凝胶染色采用Zhang和MacRae给出的考染法或银染法。凝胶图像分析鳜鱼和鲢鱼肌肉蛋白电泳凝胶用考马斯亮蓝或硝酸银染色，用清华紫外扫描仪在transmission模式下拍摄凝胶图像，每块凝胶上蛋白点自动计数。两种鱼肌肉蛋白组通过比较蛋白分布和表达量进行分析。每个样品重复4次，数据分析采用平均值。3 结果与讨论两种鱼每克肌肉蛋白质含量测定采用干灰法，这一数值通常也可以用来评价鱼肉质量。如图1所示，鳜鱼蛋白质含量占鲜重的18.5%，而鲢鱼为16.0%，符合典型脊椎动物15%-25%蛋白质含量范围。鳜鱼蛋白含量比鲢鱼高12.4%，说明在这个标准下，鳜鱼的肉质比鲢鱼好。为了比较两种鱼的肉质，我们采用HPLC系统测定了肌肉蛋白的氨基酸组成（图2）。两种鱼可溶性肌肉蛋白氨基酸组成见表1。由于样品处理过程中酪氨酸降解，天冬氨酸和谷氨酸发生水解，本实验只检测到17种氨基酸。鳜鱼肌肉必需氨基酸含量为34.7mg/g，而鲢鱼肌肉必需氨基酸含量为32.6mg/g，比前者低6.1%。鳜鱼肌肉中鲜味氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸）和鲜味增强氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸）含量分别为30.4和23.8mg/g，鲢鱼中相应的氨基酸含量显著低于鳜鱼，分别为21.3和15.3mg/g。另外，如表1所示，鳜鱼肌肉中谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸和赖氨酸含量（13.8，9.6，8.8和6.2 mg/g）比鲢鱼的（8.3，6.9，7.5和1.77mg/g）高很多。食品蛋白质量由所含的氨基酸类型与含量这两个参数决定。因为必需氨基酸要从饮食中获取，而不同的氨基酸在人的生理代谢中起到不同作用。因此，鱼肉的消费价值与其营养价值有直接关系。本研究发现鳜鱼肌肉是营养价值极高的食品。首先，其必需氨基酸含量占氨基酸总量的34.7%，必需氨基酸（EAA）和非必需氨基酸（NEAA）含量之比为1.03。超过食品农业组织推荐的理想食品蛋白指标（EAA40%且EAA/NEAA0.6）。第二，鳜鱼肌肉含有极高的增鲜剂谷氨酸和天冬氨酸（占总氨基酸含量的28.8%），肉味鲜美。第三，含有较高水平的赖氨酸（6.13mg/g，占氨基酸总量的7.5%）和精氨酸（7.1mg/g，占氨基酸总量的9.7%）。赖氨酸是正常发育所必需的氨基酸，是合成肉毒碱的前体，肉毒碱参与脂肪酸代谢和胆固醇水平的调控。精氨酸一种半必需氨基酸，参与蛋白合成以及解毒和能量转换等生理功能。第四，鳜鱼含有相对较高的支链氨基酸（BCAA），如亮氨酸（6.2mg/g）、异亮氨酸（3.8 mg/g）、缬氨酸（3.96 mg/g）。BCAA对于保持肌肉组织，保持肌糖原含量以及保护肌肉蛋白在运动时不被降解等起到重要作用，同时高含量的支链氨基酸还能使肉质纹理柔软。双向电泳可以根据蛋白的等电点和分子大小来分析特定蛋白的分布，检测蛋白表达差异。本研究利用双向电泳技术研究了两种鱼肌肉中某些蛋白的表达是否存在差异。两种鱼肌肉中尿素可溶蛋白通过线性p