微生物的代谢实验.doc

微生物的代谢实验实验日期：2009年12月29日摘要：本实验主要利用微生物在分解糖作为碳源的能力差异性方面，即有些细菌能分解糖并产酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢、甲烷、二氧化碳等）；有些细菌只产酸不产气等，通过实验来进一步了解各种细菌的具体差异，通过仔细观察及确切的实验依据，对微生物的分类进行分析。本实验中可以利用指示剂来断定微生物利用碳源氮源的差异情况。在配制培养基时预先加入溴甲酚紫Ph5.2(黄色)6.8（紫色），当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色；气体的产生可由发酵管中倒置的杜氏小管中有无气泡来证明吲哚实验为鉴定微生物是否可以分解色氨酸，如产生阳性反应则证明含色氨酸酶，即可以分解色氨酸。本实验中大肠杆菌和形杆菌呈阳性反应，枯草杆菌和金黄色葡萄球菌呈阴性反应。同理，用硫化铅或硫化铁沉淀的生来判断细菌中H2S的产生。本实验中只有变形杆菌可产生H2S气体。引言：微生物在生长繁殖中，需要从外界环境吸收营养物质。小分子有机物可被直接吸收；大分子有机物如淀粉蛋白质等则须微生物分泌胞外酶等将其降解后吸收。不同微生物对生物大分子水解能力各有不同。有些细菌含有色氨酸酶，可将蛋白胨中的色氨酸水解，产生丙酮酸氨和吲哚，吲哚不被细菌利用，积累在培养基中，吲哚本身没有颜色，可通过与吲哚试剂中的对二甲基苯甲酸结合，形成红色的玫瑰吲哚，即为阳性。有些细菌能分解含硫氨基酸。可将半胱氨基酸分解为丙酮酸氨和H2S。 H2S本身无色，若遇到培养基中的铅盐或铁盐，可产生黑色硫化铅或硫化铁沉淀。CH2SHCHNH2COOH + H2OCH3COCOOH+NH3+H2SH2S+Pb(CH3COO)2 PbS(黑色)+2CH3COOHH2S+FeSO4H2SO4+FeS（黑色）细菌具有多种酶系统，能发酵分解糖醇糖苷等，产生酸类气体和其他无机物。但不同细菌具有的分解酶不同，且分解能力及代谢产物也各不相同。酸的产生可以用指示剂来显示，气体的产生可由糖发酵管中倒置的杜氏小管中有无气泡加以证明。由丙氨酸出发的6条发酵途径发酵类型最终发酵产物代表菌属乳酸发酵乳酸乳杆菌属乙醇发酵乙醇CO2酵母菌属丙酸发酵丙酸CO2丙酸杆菌属2，3-丁二醇发酵2，3-丁二醇CO2肠杆菌属混酸发酵甲酸乙酸丁酸乳酸H2CO2变形杆菌属丁酸发酵丁酸丙酮丁醇异丙醇CO2梭菌属实验材料：菌种：枯草杆菌，大肠杆菌，变形杆菌，金黄色葡萄球菌。培养基：糖发酵培养基（乳糖葡萄糖蔗糖甘醇），蛋白胨水培养基，柠檬酸铁铵半固体培养基。试剂：吲哚试剂。其他器材：试管，接种环，接种针，酒精灯等。实验方法：1. 糖发酵实验分别接种枯草杆菌，大肠杆菌，变形杆菌和金黄色葡萄球菌于装有糖发酵培养基的毛细管中，置37的恒温箱，培养24h。2. 吲哚实验1) 分别接种枯草杆菌，大肠杆菌，变形杆菌和金黄色葡萄球菌于已灭菌的蛋白胨水培养基中，置37的恒温箱，培养24h。2) 观察结果时，在培养液中加乙醚约1ml，充分震荡后待培养液上面呈现明显乙醚层时，沿试管壁缓慢加入吲哚试剂10滴。3. 产H2S实验取四支已灭菌的柠檬酸铁铵半固体培养基，分别刺穿枯草杆菌，大肠杆菌，变形杆菌和金黄色葡萄球菌，置37的恒温箱，培养24h。结果分析：1. 如图所示：糖发酵结果糖类发酵葡萄糖乳糖蔗糖甘醇大肠杆菌+ 枯草杆菌+ + +变形杆菌+ +金黄色葡萄球菌+ + + + +（第一个符号代表产酸，第二个代表产气）2. 吲哚阳性反应（下图左）：大肠杆菌变形杆菌3产H2S实验阳性反应（下图右）：变形杆菌注意事项：1. 产H2S实验观察时，应拿主意接种线外围有无向外扩展的情况，若有，证明该菌有运动能力。2. 加入吲哚试剂后，不可再摇动，否则红色不明显。3. 配制蛋白胨水培养基应选含色氨酸较多的蛋白胨，以免影响阳性效果。4. 产H2S实验中，在培养基中加入硫代硫酸钠作为还原剂，其作用是保持还原环境，使H2S不被氧化。此外，细菌如果处于氧气充足的环境中，则不会产生H2S。故实验中的培养基不能制成斜面，而采用穿刺接种方式，使在底部产生H2S。实验误差分析：1. 在柠檬酸铁铵半固体培养基接种时，接种针插入太浅，H2S不产生。2. 加入吲哚后不小心震荡，红色不明显。讨论：目前有关细菌对含碳化合物和含氮化合物的代谢实验已成为大学微生物课程的经典实验之一，微生物许多生理生化反应都由此看出。微生物代谢与其他生物代谢有着许多相似之处，但也有不同之处。微生物代谢的重要特征之一，就是代谢类型的多样性。即使同属化能异养菌中的不同微生物，它们在分解生物大分子物质含碳化合物含氮化合物的能力代谢途径和代谢产物也各不相同。我们通过具体详细的实验步骤，精确的操作方法，实际的拍摄图像进一步了解确认了微生物的不同代谢方式和能力，掌握了实验方法，记忆更为深刻，为接下来的学习做好准备。附：1. 蛋白胨水培养基的制备 成分：蛋白胨10g氯化钠5g蒸馏水1000ml 制法： （1）先用少量蒸馏水将蛋白胨和氯化钠相混合溶解,再加足蒸馏水量。 （2）调节pH至7.6、用滤纸过滤。 （3）分装中试管，每管约3-4m