硫酸盐还原菌杀菌实验 (瓶试法).doc

硫酸盐还原菌杀菌实验一、方法提要MPN法-测试瓶法，在35（或实际水养环境温度下）培养7天。二、硫酸盐还原菌生长显示特征硫酸盐还原菌测试瓶中的液体变黑、有黑色沉淀或铁钉变黑，均表示有硫酸盐还原菌生长。三、试验仪器和设备1、生化培养箱2、无菌注射器：1mL3、SRBHX测试瓶（七天）4、100mL试剂瓶。四、实验前的准备1.准备好所需无菌注射器和测菌瓶；2.待检测的现场水样（或驯化好的SRB富集液其获得见“五-1-菌种的制备”）。五、测定步骤1、菌种的制备一般采用现场取得含菌水样作为待用的菌悬液。当没有现场水样或水样不足时，可采用以下方法进行SRB的富集液培养：（1） 向SRB测试瓶（9mL规格，如北京华兴化学试剂厂产的SRB-HX型细菌测试瓶）中注入1ml含SRB菌种的水样，可根据需要量做多个平行瓶；（2） 将注菌的SRB测试瓶于恒温培养箱中合适温度（最好与现场待测水样温度一致，误差可为5）下培养47天；如果测试瓶发黑则表明培养成功；然后放入冰箱（4）内，作为菌种保存备用。（3） 在实验的前一天需在使用原培养温度下活化培养3-5小时，作为制备菌悬液之用。 当然，SRB富集液的培养也可采用更为复杂的自制培养基进行驯化培养，但由于相对测菌瓶而言比较费时复杂，一般情况下采用以上方法即可。2、菌悬液的制备 取现场水样为试验用菌悬液。如果现场水样菌数不足或因存放过久没有细菌可如下操作获得菌悬液：将冰箱内驯化的富集液在使用原培养温度下活化培养3-5小时，然后用滤纸过滤，按照菌种：现场水样=1：20200比例（根据需要的空白菌数选择相应的稀释），加入至现场水样中，搅匀后即可作为菌悬液使用。3、药剂的配制将被检测药剂配成10mg/mL（1%）水溶液。（可根据具体的检测要求具体配制药剂浓度）4、7、试样菌药接触培养取100mL菌悬液加入试剂瓶中，再加入规定浓度药剂后，密封放入生化培养箱中35（或实际水养环境温度下）培养接触4h（可根据具体实验规定接触培养时间），待测。 同时做空白对照样。 8、试样的稀释和接种（1） 用10倍稀释法稀释水样，即用无菌注射器取1mL待测样注入SRB-HX测试瓶中，充分摇匀，此时稀释度为10-1。（2） 另取一支无菌注射器取稀释度为10-1的水样1mL注入到第二个SRB-HX测试瓶中，充分摇匀，此时稀释度为10-2，以此类推，直至需要的稀释度为止。（3） 每个稀释度作2-5个平行测试瓶。每接种一个稀释度更换一支无菌注射器针管。（4） 加药试样的操作相同，最后的稀释度可以比空白试样少1-2次方。9、培养将稀释好的SRB-HX测试瓶充分摇匀，置于生化培养箱中在规定温度下培养7天。六、计数与报告（1） 凡测试瓶中的液体变黑、有黑色沉淀或铁钉变黑，均表示有硫酸盐还原菌存在，以“+”（阳性）表示，其余测试瓶以“-”（阴性）表示。（2） 算出10进位稀释测试瓶中阳性试剂瓶数，以阳性组合指数记录下来。（3） 在10进位稀释中多于三个稀释度时，阳性组合的指数只需要用其中依次的三个稀释度，对这三个稀释度的决定是先选出5瓶全部阳性反应的最大稀释度，然后选出其次相连的两个更高的稀释度，算出阳性组合指数。（见表格1例1、2、4）（4） 若按照上条规定的原则选出三个稀释度后，有更高的稀释仍然产生一个阳性试剂瓶，就应将这一阳性试剂瓶并入所选择的最高稀释的阳性结果中。（5） 根据阳性组合的指数，查阳性组合指数与菌数的对应关系