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文档简介

动物生物化学授课内容内 容备 注第十二章 DNA合成复制 概念:遗传中心法则 1、遗传信息贮存在DNA上,通过以单链为模板合成两个完全相同的子代方式,将信息传递给子代,称为复制。 2、以DNA为模板指导合成RNA(转录)后,再以RNA为模板指导合成蛋白质(翻译),将DNA上的遗传信息以蛋白质的形式和相应的功能表达出来。称为遗传中心法则。 3、RNA病毒是以RNA为遗传信息的载体。这种特殊的RNA也可以进行自我复制,并在相应逆转录酶存在下,将信息逆转录合成DNA,然后沿中心法则的方式进行信息传递。 半保留复制(semiconservative replication) 复制前,双螺旋的氢键断裂形成单链,再以单链为模板,合成各自互补链,产生2个与亲链完全一样的子代DNA。 每个子代双链中均含有一条亲代模板链和一条新合成链(旧、新单链互补结合而成)。13.1 复制因子 DNA复制系统由多种蛋白酶、RNA引物和Mg2+等组成。 (1)DNA聚合酶 以脱氧核苷酸为底物,以DNA为信息模板,在Mg2+存和引物存在条件下,催化合成DNA链。 DNA合成方向从53,即dXNA的5位磷酸加到引物的3端OH,脱焦磷酸形成二酯键。 原核细胞以大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶为代表. 聚合酶 单链,101000;53聚合;35外切(校对功能。3端接 上错误核苷酸后将被切除);53水解(可以切除引物和修复性切除)。 聚合酶 多亚基蛋白酶,88000;具53聚合,35外切 作用; 但合成速度很慢,主要为切除修复的功能。 聚合酶 有10个亚基,900000;具53聚合,35外切作用; 合成速度最快,是DNA复制的主要合成酶。 真核细胞也有功能类似的聚合酶(有五种): 聚合酶、是主要合成酶(具53聚合和校正功能); 聚合酶、为主要的修复酶; 聚合酶主要存在于线粒体,含量极少,负责线粒体DNA的修复。 (2)DNA连接酶 催化双链中单链切口处5P与3OH间的共价连接;消耗ATP(真核)或NADH (原核)供能。 对单链分子不起作用。 (3)DNA构象转换因子 参与DNA分子的解链、解旋、稳定单链作用。 DNA解旋酶: 多数DNA都有负超螺旋,由拓扑异构酶产生或解除。 (E.coli的解链酶称为danB蛋白,或称rep蛋白) 拓扑异构酶 可切双链中的一条单链,放出应力后再连接,无能量消耗; 拓扑异构酶 具双链内切酶与连接酶双重功效;消耗ATP;先切开双链, 释放应力(或引入负超螺旋),再封闭切口。但没有解链功 能(不能打开氢键)。 注:拓扑异构酶在原核、真核生物都存在 DNA解链酶: 具识别复制原点的特殊位点;促链间氢键断裂、分离为单链,解螺旋;消耗ATP(具有依赖DNA的ATPase活性);降低DNA的Tm;(与SSB联合,打开DNA双链,并维持单链稳定)。 E.coli的解链酶称为danA蛋白 链结合蛋白(SSB): 紧密结合到单链DNA上,使DNA单链不能互补结合,并保护单链不被核酸酶降解,维持单链稳定性。 (4)引物及合成酶 引物链为一段特殊RNA,聚合酶在此链基础上合成延长DNA。专一合成此RNA的称为引物酶。 DNA聚合酶不能从头合成DNA,只能延长DNA; 原核生物的引物为4050核苷酸,动物病毒有80个,真核生物有510个。 引物(发)酶(E.coli中为danG蛋白),单链,以多酶复合物形式存在在。引物酶只在形成复合体时才有活性。 引物RNA能与模板DNA以氢键配对结合,形成局部杂交链。 合成引物时,多酶复合体与拓扑异构酶等配合,对DNA局部进行解旋,暴露出后续的DNA序列,有利于DNA聚合酶复制,称为“转录激活”。 (5)原料等其他条件 1、四种脱氧核糖核酸(dXTP); 2、反应体系中适宜的PH和离子强度; 3、Mg+条件等。 132 DNA复制过程 (1)复制点 无论真核、原核均有固定起点位;原核生物一般只有一个点,而真核生物则多点同时复制。 真核DNA比原核长很多,多点同时复制能提高速度。 复制均为双向,可产生两个复制叉。当复制点为单向复制时,则只有一个复制叉。 (2) 起始 复制前先由 Dna A:辨认复制起始位点; 再由 解旋酶(含拓扑异构酶)作用,释放超螺旋应力后, 然后引入多酶复合体(包括解链蛋白、单链结合蛋白SSB、引物酶danG、ATP辅助因子等)。 解链酶打开局部双链,使SSB蛋白与单链DNA结合,维持稳定; 以后引物酶开始以单链DNA为模板,利用4种核糖核苷酸(XTP),合成引物RNA。 注:在复制叉上引入2个多酶复合体,作用方向相反。 Dna A:辨认复制起始位点,并参与解链功能。 Dna B:解螺旋酶 Dna C:辅助解螺旋酶使其在起始点上结合并打开双链。 Dna G:引物酶 (3)复制延伸 引物合成后,DNA聚合酶全酶(多亚基)随后引入结合在DNA模板上,将游离的dXTP的5端磷酸基与RNA的3端OH相连,形成酯键,放出ppi。 同时,拓扑异构酶、解链酶、BBS蛋白、聚合酶等开始同时作用,边 解螺旋、解链,边合成,新链不断向 3方向延长(聚合方向为 53)。 35 模板链:聚合酶沿模板35前进,合成一条53的新 链,速度较快,称为先导链; 53 模板链:聚合酶采用片段合成,片段称为“冈崎片段”。 DNA聚合酶为多亚基酶,与引物酶复合体靠近,可将游离的模板单链(53)局部折成环,使部分片段与先导链同向,便于引物酶合成引物、聚合酶延长DNA链(53)。 当达到一定长度后环被放开。再产生一个新环,重复前面的过程。 合成的片段,再由聚合酶切除引物RNA,并继续从53方向修复合成;最后由连接酶将缺口补上,完成复制。 这一过程所合成的链,因步骤多、速度慢而称为滞后链。 在整个合成中,DNA聚合酶始终承担合成、校对、修复功能。以模板为标准,严格选择底物dXTP;出现错选、错接时立即切除修复,极为精确。 (4)复制终止 对环形DNA链,终止点即在起点处;对长链,终止处可以是某一组密码控制,或与前一复制叉相汇处。 133 反转录合成DNA 针对RNA型病毒。含有特殊的RNA反转录酶。 RNA反转录酶:以dXTP为底物,以特殊的RNA为模板、合成方向53,合成的双链产物(称反链)为RNADNA混合链; 再由核糖核酸酶降解链中RNA成片段,作为引物; 在DNA聚合酶参与下以反链DNA为模板,以RNA为引物,合成方向53,合成含有原RNA信息的新DNA双链。 上述过程只有借助宿主细胞内的酶系统和环境条件才能完成;形成的病毒DNA可整合到宿主DNA中。一定条件下,这样的宿主DNA可以大量复制并转录出病毒RNA,重新组装新的病毒,散布到胞外或诱发宿主细胞癌变等。 134 DNA损伤修复 DNA损伤大多是由于环境因素引起,另一原因是遗传错误。但生物可以依靠细胞内存在的一系列校对、修复机制得以解决。 光修复 紫外线常导致核酸链上相邻T形成共价二聚体T=T,而引起复制 终止。在某些物种则具有能被光 激活的特定的光修复酶,分解T=T成单体,修复紫外线破 坏的核酸链。 (人体的此酶活性偏弱,过量紫外易引起细胞死亡或诱发癌。) 暗修复主要有三种: 1、 切除修复 特异核酸内切酶识别并切断双链中单链上的问题核苷酸二酯键; 由外切酶将问题核苷酸片段切除; 由DNA聚合酶对空缺处进行修补,并留下切口; 由连接酶连接完成修复。 着色性干皮病(xeroderma pigmentosis,XP) 一种切除修复有缺陷的遗传性疾病。包括XPA、XPB、XPC等相关基因的表达产物,具有辨认和切除损伤DNA作用。XP病人则是由于XP基因缺陷而不能合成相应产物,则不能修复紫外线照射引起的DNA损伤,因此易发生皮肤癌。 2、重组修复: 亦称复制后修复。即受损DNA片段在复制时通过交换重组得到修复。但受损的部分并没有被消除,而是通过不断复制的大量DNA而被“稀释消除”。 多酶链式反应(PCR) 一种快速人工合成特定DNA片段的技术。 条件: 微量DNA片段、dNTP为底物(四种)、耐热性DNA聚合酶 (TaqDNA 聚合酶,可耐95)、人工合成的引物、合适的离子强度和PH、缓冲液、 Mg2+等。 PCR过程: 一 高温变性(高温可以使DNA成为单链,聚合酶耐高温 不失活); 二 低温退火(降温使引物与DNA单链结合,DNA单链极低 浓度则不能结合复性); 三 中温延伸(7580促进聚合酶以引物为起始 点,以 DNA单链为模板,开始合成DNA互补链)。 注:端粒与端粒酶 端粒酶是一种核糖核蛋白酶,由RNA和蛋白质组成,具有逆转录酶的功能,以自身的RNA为模板不断合成端粒DNA,从而维持端粒的长度。 端粒是真核生物染色体末端的特殊结构,由部分双链和一段3单链组成,上有特殊的保护蛋白,使外切、内切酶均不能识别和破

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