复方丹参滴丸对缺氧心肌细胞内.doc

中国病理生理杂志. 2001,17(7):690-691复方丹参滴丸对缺氧心肌细胞内钙离子平均荧光强度的影响李全凤，王孝铭，朱世军，艾静，高焕焕，徐长庆（哈尔滨医科大学 病理生理教研室，药理教研室，黑龙江哈尔滨 150086） 主题词中草药;荧光；钙;离子；心肌;细胞；低氧 摘要目的：探讨复方中药丹参滴丸对缺氧复氧心肌细胞的保护作用。方法：培养的乳鼠心肌细胞，用钙探针Flou-3/AM染色，利用激光扫描共聚焦显微镜观察心肌细胞缺氧复氧及在复方丹参滴丸保护作用下心肌细胞内钙离子荧光强度变化结果：缺氧加丹参保护组，细胞内钙离子荧光强度（1217.78312.07）明显低于单纯缺氧组（1509.43508.58）；缺氧复氧加丹参组，细胞内钙离子荧光强度为（1567.91577.61），亦较缺氧再给氧组（ 1617.6477.53）低。结论：复方丹参滴丸对缺氧心肌细胞有明显保护作用。中图分类号 R364.4 ； R285.5 文献标识码 A 本教研室多年来就复方丹参对缺血再灌注心肌的保护作用机制进行了大量研究1-3，以整体、器官、细胞、细胞器为模型，从形态、能量代谢等不同角度深入探讨。复方丹参制剂可使心肌缺血、缺氧得到明显改善。本实验采用乳鼠心肌细胞培养 36 h，使心肌细胞缺氧复氧，加入复方丹参滴丸保护，利用共聚焦显微镜观察复方丹参滴丸对心肌细胞缺氧复氧时的抗“钙超载”作用。材料和方法1.试剂11 1 640培养液 美国 Gibco公司产品。12 胎牛血清 中国医学科学院血液病研究所。13 胰蛋白酶 Difco进口分装。14 Fluo-3AM 日本东京株式会社同仁化学研究所。15 复方丹参滴丸 天津天士力制药集团。2.细胞分离和培养取新生的Wistar大鼠的乳鼠（本校动物实验中心提供），在无菌条件下取出心脏，剪碎，加入025胰蛋白酶消化液消化 30min，上清液吸出，用 Hanks液清洗、离心，共 3次。清洗后的细胞用 1640培养液制成混悬液，加入 15小牛血清，分装培养瓶内，每瓶细胞计数按 106计算。放入 370 C温箱内培养。3.分组培养36 h的细胞放在倒置显微镜下观察；视野清晰，细胞生长良好，大部分细胞有搏动。将这些细胞随机分成 5组。正常对照组（I）； 缺氧10 min组（II）；缺氧10 min加丹参组；缺氧10min复氧 10min组（IV）；映氧 10 min复氧 10 min加丹参组（V）.缺氧组：直接向培养瓶内给氮气10min；缺氧复氧组：先给氮气10min再给氧气 10min；保护组：给氮气之前将药物加入瓶内，气体流量为每分钟100个气泡（气泡直径为 lmm左右）。复方丹参滴丸终浓度为 40 mgL。4.细胞染色经过处理后的细胞，用 0.25胰蛋白酶从培养瓶内消化下来，清洗、离心后加入10mol L的Fluo3AM染色；在37恒温水浴锅内孵育lh。每隔10min振荡 1次，使染液均匀进入细胞内。染色结束后，再用PBS缓冲液清洗，离心，共3次，最后加入无血清，无酚红 1640培养液内，以备扫描。 Fluo-3 AM是一种新的i荧光指示剂，用Fluo3AM(戊二酰氧甲基脂)即脂化的 Fluo-3荧光染料负载细胞时，可穿透细胞膜，细胞内的脂酶将其水解，释放出Fluo-3,与细胞内钙离子结合，产生荧光。5.共聚焦显微镜观察 同Fluo-3/AM染色后的细胞，放在共聚焦显微镜（美国 MERIDIAN公司 INSINGHT PLUS）下，通过显微镜发出的488 nm波长的氩离子激光，激发细胞内与染料结合的游离钙离子，产生荧光。可看到细胞内钙离子分布情况。6.统计学处理 检测数据以 s表示，用检验进行分析。结 果 乳鼠心肌细胞在缺氧 10 min时，细胞内钙离子平均荧光强度增强，为 1509.43士508.58，正常对照组为 1005.75土364.25，两组比较 P0.05，表明丹参对缺氧心肌细胞具有保护作用。而缺氧 10 min复氧10 min组，与缺氧 10 min组比较,钙离子荧光强度增强为161 7.60士477.53，两组比较P0.05；缺氧复氧加入复方丹参滴丸，钙离子荧光强度无明显减弱，两组比较P0.05（见表1）。表1复方丹参滴丸对缺氧及缺氧复氧心肌细胞钙离子平均荧光强度影响Tab 1 Changes in fluoresence intensity of intracellular free calcium in each groupGroupCell numberFluoresence intensity121005.75364.25231509.43508.58*91217.78312.07#91617.60477.53111567.92577.61:Control; :Anoxia 10 min; :Anoxia 10 min + salviae; :Anoxia 10min /reoxgenation 10 min; :Anoxia 10min /reoxgenation 10min +salviae .*P0.05 vs Control; P0.05 vs group ; #P0.05 vs group.讨 论近年来，研制心肌缺血药物品种繁多，通过我们实验室多年研究发现，复方丹参制剂对缺血心肌保护作用效果较好，尤其是最新型复方丹参制剂复方丹参滴丸，对缺血心肌保护作用效果显著。复方丹参滴丸是采用药学新技术手段研制而成的一种高效、速效的新型纯中药制剂，主要成分为丹参三七，冰片。其中丹参的水溶部分主要成分丹参素，具有抗氧自由基、钙桔抗和稳定细胞膜作用。现在临床上常用来治疗心绞痛，预防心肌梗塞。心肌缺血后，导致细胞内钙超载，是心肌细胞死亡的基本原因。其机制是由于细胞缺氧后，产生自由基，损伤细胞膜，使膜的稳定性下降；另一方面，细胞缺氧时，胞内氢离子增多，通过氢钠交换，使细胞内钠离子增多，又通过钠钙交换机制，细胞外钙大量进入细胞，同时细胞内钙库一肌浆网，高尔基复合体向胞浆内释放钙，使细胞内钙离子大量聚积导致细胞钙超载，造成损伤或死亡。 本实验利用先进的共聚焦显微镜技术，采用钙的荧光探针，直接探测心肌细胞内的钙离子在缺氧复氧状态下，复方丹参滴丸对其强度的影响。结果表明：。心肌细胞在缺氧前加入复方丹参滴丸，细胞内钙离子荧光强度明显下降，证明了复方丹参滴丸有桔抗心肌细胞“钙超载”，保护心肌细胞的作用。 参考文献：1. 马丽英，王孝铭，张国义丹参制剂对缺血心肌腺苷酸代谢影响哈尔滨医科大学学报，1986， 3（20）：1022. 岳平，王孝铭，梁殿权丹参酮 A磺酸钠对心肌钙反常的保护作用中国病理生理杂志， 1987，3（3）：1541583. 贾玉芝，王孝铭，李相忠心肌缺血再灌注损伤时相性变化的电子示踪研究 J中国病理生理杂志， 1991， 7（5）：5085114. 冯培芳，秦南屏，覃宇果等. 复方丹参滴丸对冠心病患者循环内皮细胞基因表达的影响J.中国中西医结合杂志， 1999，19（5）：286 2885. Kao JP，Harootunian AT，Tsien RYPhotochemically generated cytosolic calcium pulses and their detection by Fluo3J. J Bio Chem，1989 264(14)：817981846. Cui J， Yan