同种异体兔软骨细胞体内培育组织工程化人工软骨的实验研究.doc

同种异体兔软骨细胞体内培育组织工程化人工软骨的实验研究生物医学工程学杂志 1999年第0期第16卷 有机生物材料组作者：王常勇赵强王会信王勤毛天球单位：王常勇赵强王会信（军事医学科学院 基础医学研究所，北京100850）；王勤（山东医疗器械研究所 高分子室，济南250013）；毛天球（第四军医大学 口腔医院颌面外科，西安710032）关键词：组织工程；软骨细胞；移植；聚合物摘要将同种异体兔关节软骨细胞种植到聚乳酸(D，L-PLA)泡沫材料上，体外培养1周后，进行体内移植。结果表明：软骨细胞材料复合体组在兔背部皮下有新生软骨形成，聚乳酸(D.L-PLA)泡沫材料可以作为软骨组织工程的细胞支架材料。Study on Tissue Engineered Neocartilage Using PolymerSubstrates and Chondrocytes组织工程学的兴起，为临床上修复因各种原因导致的软骨缺损带来了希望。近年来，国外的科研人员应用可生物降解聚合物作为支架，成功地在动物体内培育出组织工程化的人工软骨。本研究旨在了解组织工程研究的基本原理，探讨合成性生物降解聚合物D，L-PLA泡沫材料用作软骨细胞载体材料的可行性13。1材料和方法1.1主要实验材料和仪器D，L-PLA三维多孔泡沫材料：由山东医疗器械研究所研制并提供，分于量1.1105，经扫描电镜观察，其孔径250-350 m,孔隙率85%，呈直径8 mm、厚2 mm的圆片状。其它常规设备、液体(略)。1.2软骨细胞体外培养选取一窝生新西兰一月龄幼兔五组，每组5只，每组中随机取一只幼兔作软骨细胞分离、培养用，其余4只作为软骨细胞聚合物复合体体内移植的受体。取兔关节软骨，应用0.2%II型胶原酶消化，具体培养方法略2。所获细胞经甲苯胺蓝染色及苏木精。番红花“0”一亮绿染色证实为软骨细胞。获得的软骨细胞进行传代培养，适时收集软骨细胞，并使其浓度达2107个/ml(接种浓度)。1.3体外培育人工软骨组织在超净工作台内，将己浓缩的软骨细胞(浓度为2107个/ml)，接种到泡沫材料上。软骨细胞一聚合物复合体在体外培养一周，定期在倒置显微镜下观察，同时取部分标本固定后进行扫描电镜下观察。1.4体外培育的人工软骨进行体内移植选取新西兰兔45只，其中五组一窝生幼兔在软骨细胞取材后，每组各余下4只，共余20只，另20只为随机选取的新西兰家兔，体重2.02.5 kg,雌雄不限。实验分三组：人工软骨组(A组)，单纯D，L-PLA泡沐材料组(B组)，单纯软骨细胞组(C组)。其中A组仅相应地移植于一窝生其余4只家兔背部皮下；其它20只家兔随机选取其中10只作为B组移植用；余下10只为C组，移植部位同A组。分别于术后4、8、12周取材，固定。进行HE、苏木精一番红花“0”一亮绿染色，以及应用型胶原抗体进行免疫组化染色，显微镜观察。2结果2.1软骨细胞接种到支架材料上的倒置显微镜及扫描电镜观察软骨细胞接种后自然沉积在泡沫材料内，48小时可见软骨细胞生长、增殖，第七天时，软骨细胞数量增多，并分泌基质。2.2人工软骨进行体内移植的大体观察术后动物均存活，伤口愈合良好。术后4周A组移植物呈白色，用镊子按压有阻抗，至8和12周，移植物颜色与透明软骨相似，呈光滑有光泽的白色透明状，按压有阻抗并有弹性，B组和C组无软骨形成。2.3光镜观察A组术后4周，HE染色见软骨细胞呈圆形，核深染，软骨基质呈浅兰色，细胞周围的胶原网均匀分布。苏木精番红花“0”一亮绿染色见基质红染，未见绿色骨化灶。聚合物泡沫材料有部分吸收，材料内及周围组织仅有轻度炎细胞浸润。至8和12周软骨细胞增生明显，异染的基质更多地分布，形成的软骨形态为正常关节软骨形态相似。聚合物泡沫材料上明显，其吸收后的间隙由新生软骨所取代。未见淋巴细胞及炎细胞浸润。B组和C组在术后各时间点取材，均未见有明显的新生软骨形成，植入区除术后4周时有轻度炎细胞浸润外，其它各时间点未见炎性反应。2.4免疫组化观察A组在术后各时间点，均可见大量型胶原阳性染色的软骨细胞，胞浆染成棕黄色，胞核不着色，随时间延长，软骨，基质中型胶原阳性范围明显增加。B组在术后各时间点，均末见型胶原阳性染色的软骨细胞。C组在术后2周，植入区内可见零星型胶原阳性染色的软骨细胞，胞浆染成淡棕黄色，仅形成极少量型胶原染色阳性的软骨基质。在术后其它各时间点，均未见型胶原染色阳性的软骨细胞及软骨基质。3讨论目前国外应用于软骨组织工程研究的主要支架材料是聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)以及两者的共聚物。国内软骨组织工程研究的支架材料主要选择几丁质材料，但因其机械强度差，尚需深入研究，采用聚乳酸作为支架材料的研究较少，这类材料需要较高的加工技术。本研究所用材料为D，L-PLA泡沫材料，材料具有良好的生物相容性和生物降解性，孔隙率较高，孔径大小适合细胞长入，孔度均匀。本研究以该材料为支架，成功地培育出且有三维立体形态及组织学特征良好的新生软骨组织，发现软骨细胞在支架材料上附着，生长迅速，同时分泌软骨特有基质成分。这一实验结果表明，D，L-PLA泡沫材料是软骨细胞的良好载体材料。由于软骨组织不含血管，软骨细胞又可分泌血管抑制因子，使免疫反应无法涉及软骨组织，这为同种异体软骨细胞体内移植创造了得天独厚的条件。尽管如此，由于软骨组织工程研究需要在体内移植大量细胞，有研究报道表明，近期结果见好，但从长远看，免疫排斥反应仍是一个不容忽视的问题。为了降低软骨细胞移植过程中在体内引起的免疫排斥反应，本实验特别选用5组一窝生新西兰幼兔，每组各4只作为同种异体软骨细胞移植的受体，因一窝生封闭群家兔，基因组差异小，所引起的免疫排斥反应也很轻微，这从生物性人工软骨体内移植后，在移植区内未引起明显的炎性反应就可得到证明。本实验证实D，L-PLA泡沐材料是软骨细胞较为适宜的载体材料。同时观察了具有三维结构的组织工程化人工软骨的组织学特点，展示了软骨组织工程研究的光明前景。参考文献1Hellman KB.Bioartificial organs as outcomes of tissue engineering.Ann N Y Acad Sci,1997;83112陈富林，毛天球，冯雪等.兔关节软骨细胞的分离纯化及鉴定.现代口腔医学杂志，1998；12(4)2633Cao YL,Vacanti JP,Paige KT et al.Transplantation of chon