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李忭忭 论文(终稿) 学学士学位论文系系别生命科学系学科专业生物科学姓姓名李忭忭运运城学院xx年5月湿地细菌聚酮合酶和卤化酶功能基因筛查及分析系系别生命科学系学科专业生物科学姓姓名李忭忭指导教师于慧瑛运运城学院xx年5月湿地细菌聚酮合酶和卤化酶功能基因筛查与分析李忭忭（运城学院生命科学系，山西运城，044000）摘摘要要:湿地中涵养着多样的生物资源，其中微生物资源可产生丰富的具有人类医药应用价值或动植物病害防治功能的次级代谢产物。 本文利用本实验室从两块湿地分离筛选的94株细菌为样本，运用现代分子生物学方法进行定向筛选具有功能基因的菌株。 设计特异性引物，对菌株进行基于PCR的聚酮合酶基因和卤化酶基因的筛选。 结果表明，基因组中含有聚酮合酶基因的细菌有5株，占5.32%。 基因组中含有卤化酶基因的细菌7株，占7.45%。 其中Bacillus sp.CH-46基因中既含有聚酮合酶基因也含有卤化酶基因。 BLAST比对分析发现，Citrobacter sp.XT-7的聚酮合酶基因序列与已报道的聚酮合酶基因序列相似度较低，为91%，有可能为新的聚酮合酶基因。 Citrobacter sp.CH-51，Comamonas sp.CH-66与其已知卤化酶基因的相似度较低，分别为96%，85%，有可能产生新型的卤代化合物。 本文的研究说明湿地中含有丰富的微生物资源，且具有产生天然的聚酮类化合物或卤代化合物的生物活性。 细菌耐药性的出现，引起社会各界的关注，这是一个全球性的公共卫生安全问题5。 面对当前日益严重的病原微生物抗药性问题，需要开发新型抗生素来缓解。 微生物次级代谢产物以其良好的再生性、放大性和易操作性一直是新型抗生素的重要之一。 然而，随着筛选工作的广泛展开及重复筛选，导致发现新化合物的几率不断下降，因此如何定向筛选和高效发现新型抗生素就成为研究的热点问题。 微生物的次级代谢产物是重要的抗生素，可产生丰富的具有人类医药应用价值或动植物病害防治功能的次级代谢产物，如Bacillaene，Difficidin，Macrolactin等聚酮类物质6-11在农业、工业及医药研究等方面有着极其广泛的应用价值，而经过卤化酶催化产生的卤代物修饰的次级产物，其抗菌活性相比于原代谢产物也会提高很多12。 1.1微生物功能基因研究趋势聚酮类化合物和卤化物物是微生物天然产物中极具特色的两大类化合物，它们中的许多化合物都具有良好的生物学活性，在临床等方面具有非常重要的作用。 这两类化合物分别由多聚酮合酶(Polyketide synthase，PKS)以及卤化酶(Holagenase)两种催化途径合成。 有研究表明如果微生物基因组中含有PKS或卤化酶这类基因，那么该微生物就很有可能通过PKS或卤化酶途径合成活性次级代谢产物13-17。 1.1.1聚酮类化合物聚酮类化合物是一大类由简单脂肪酸在多聚酮合酶(Polyketide synthase，PKS)催化下经过类似于长链脂肪酸的合成途径合成的，是许多药物的先导化合物，例如红霉素、两性霉素、阿霉素、利福霉素、洛伐他丁、四环素和雷帕霉素等。 已知的PKS分为3类I型聚酮合酶催化聚烯、聚醚和大环内酯类化合物的合成。 主要结构域有酰基转移酶(Acyltransferase，AT)、酰基载体蛋白(Acyl-carrier protein，ACP)、脱氢酶(Dehydratase，DH)、烯酰还原酶(Enoyl reductase，ER)、酮基合成酶(Ketoacyl synthase，KS)18和酮基还原酶(Ketoreductase，KR)19。 2型聚酮合酶催化芳香族聚酮类化合物的生物合成20。 型聚酮合酶属于查尔酮合成酶类，是在不需要酰基载体蛋白(Acyl carrierprotein，ACP)的情况下直接催化单环或双环芳香类聚酮类化合物的生物合成21。 在这3种类型的聚酮合酶中，均含有酮基合成酶(Ketoacyl synthase,KS)结构域。 从近几年的研究来看，从细菌、真菌和植物中筛选新的PKS基因成为发现新的且具有生物活性的代谢产物的科学家所关注的重点。 由于PKS相应的结构域决定了其代谢产物的还原程度和空间立体结构等，所以每个结构域的功能都在最终产物的结构得到一一对应，这种对应关系使通过生物合成基因来设计杂合产物具有了实现的可能，并由此产生出了一个崭新的研究领域酶的组合生物学22。 组合生物合成为发现新的化合物开辟出了一条新的途径，试想一下，将来用“剪切粘贴”的方法便可生产出大量的有用化合物，这是多么神奇的事情，但要真正从中获益，还有很长的路要走。 首先要尽快发现更多有价值的PKS基因，其次还要扩大寻找PKS的。 1.1.2卤化物卤化物是指金属元素阳离子与卤素元素氟、氯、溴、碘、砹阴离子的化合物。 卤素化合物矿物种数约在120种左右，其中主要是氟化物和氯化物，而溴化物和碘化物则极为少见。 它们与人们的生活密切相关，可以说，在人们的衣食住行中，一刻也离不开这些矿物。 1896年，Drechse从海洋菌类中分离得到第一株含有卤素的天然代谢产物3，5-二碘酪氨酸(3,5-diiodotyrosin)23。 三十几年前大约有200种天然有机卤代物被发现。 当代人们大都认为这些卤代物为人工合成的化合物，自然界所生成的卤代物很少。 由于分离纯化技术改进以及人们对于新药研究热情不断增加，到目前为止已从各种生物(包括各类动植物、真菌、细菌)中分离出了3800多种卤素化合物24，其中绝大部分都产自海洋生物。 约95%的卤化物为氯化和溴化物，氟化和碘化物很少，少数化合物既含氯也含碘。 海洋微生物是卤代天然产物的主要生产者（约占49%），卤原子的添加通常可对化合物的生物活性产生较大影响，因此关于卤化化合物的生物合成机制引起了研究者的极大兴趣。 由于海洋微生物是卤代天然产物的主要生产者，引起很多学者的研究兴趣，因此目前对微生物卤代酶的研究主要集中于海洋微生物产卤代化合物的研究。 而国内外对于湿地细菌卤化酶基因的研究尚属空白，本文以万荣西滩和三门峡天鹅湖分离的细菌为样品进行卤化酶基因筛选，筛选出具有产卤化化合物能力的湿地细菌菌株。 许多卤代物，如万古霉素(vanycin)、7-氯四环素(7-chlorotetracycline)、氯霉素3(chlorampenicol)等都是关键的抗生素。 虽然卤原子的位置、数量以及类型对化合物生物活性的影响并没有一定的规律，但是某些卤代物与相应的非卤代物相比，卤化作用可以增强其生化活性。 例如，硝吡咯菌素(含有2个氯原子)的抗真菌活性是2-氯硝吡咯菌素的10倍；相比于其含氯衍生物，不含有氯原子的rebeamycin不具有抗菌活性。 尽管到现在为止对含有卤素原子参加的有机物的合成过程还需要加深研究，但是至少已发现四类可以催化生物卤化反应的卤化酶25。 卤化物在生态系统内广泛分布，许多天然卤代物被广泛的应用在药理学领域。 依据催化原理，催化使形成C-X键的卤化酶(halogennases)主要分成两种类型黄素依赖型卤化酶(flavin-dependent halogenases)与卤化过氧化物酶(haloperoxidases)，此外还有氟化酶(fluorinases)以及甲基卤代转移酶(methyl halidetransferases)等。 次级代谢产物非常重要的一个特点是结构多样性，可以由一类被称作后修饰酶的蛋白决定，其中就包含有卤代酶。 卤化作为给予次生代谢产物生物活性的一种非常重要的修饰行为，常通过依赖黄素腺嘌呤二核苷酸(FADH2)的卤化酶引入26-28。 近些年来，卤化酶在生物卤化合成反应过程中重要的生物学功能已经引起了广泛关注。 利用定向进化、组合生物合成等现代分子生物学技术合成具有价值的天然卤化物及其衍生物将具有广阔的发展应用前景29。 1.2湿地生态系统1.2.1湿地简介湿地是地球上具有多功能的独特自然生态系统，是自然界最富生物多样性的生态景观和人类社会赖以生存和发展的重要自然资源之一，有很高的生产力和潜在的功能。 湿地被称为“地球之肾”30，是地球生态系统中的重要组成部分，同时具有陆生生态系统和水生生态系统的特点，对重金属污染物及难降解有机物的降解有一定作用，可以调节局部气候，净化水质，蓄调洪水和保持物种多样性，具有重要价值和多种功能31-32。 1.2.2湿地微生物湿地生态系统中最重要的成员之一是微生物，微生物在生态系统的能量流动、物质循环和新陈代谢方面有很重要作用。 湿地特有的生态系统，决定其中蕴藏了大量多样的微生物资源。 环境不同，地域不同，类型不同，湿地生态系统中的微生物种类多样性就会有所不同，在湿地生态系统里微生物种类受不同因素影响33。 41.2.3湿地资源应用及前景湿地在污水处理，重金属污染降解方面有很重要作用。 为了能合理的开发利用湿地资源来处理污水，降解污染物，人们积极探索，其中生态处理技术操作简单，运行费用低，处理效果好而具有可行性。 使用人工湿地(Constructed wetland)去处理城市污水、污染物是发达国家近些年来才发展起的生态处理法。 人工湿地是为处理污水，从而人为地在一定底面坡度和长宽比的洼地上用填料(如砾石等)和土壤混合形成填料床，使污水在整个床体的填料缝隙里流动或是在床体表面上流动，并在填料床体表面种植一些抗水性强，性能好，生长周期长，成活率高，既美观又具有经济效应的水生植物(如蒲草，芦苇等)，形成独特的动植物、微生物生态体系。 人工湿地可以去除的污染物范围很广，包括氮、磷、硫等大量元素，微量元素，有机物，病原体等。 根据相关研究结果，进水浓度比较低的情况下，人工湿地对COD去除率可达80%以上，而对BOD5的去除率可达85%-95%，处理出水中BOD5的浓度在10mg/L左右，SS小于20mg/L。 废水中大部分有机物作为异养微生物的有机养分，最终被转化为微生物体及CO2，H2O。 微生物生存于湿地这样的环境中，生长条件特殊，再加上利用各种污染物作为自身的养分，经过长时间的进化就会形成一些特殊的新陈代谢途径，产生的次级代谢产物可以杀灭病原菌，所以湿地微生物在处理污染，消灭病原菌方面具有很大的应用价值。 国外已经有运用人工湿地降解污染、处理污水经验，我国也进行了研究实验探索这项技术。 对于湿地生态系统的合理有效应用，可以是很多环境问题迎刃而解。 1.3本文的研究意义及目的自20世纪50年代以来，抗生素开始广泛应用于畜禽养殖业，虽然在保证动物健康生长、提高经济效益、促进生长、节约饲料成本等方面做出巨大贡献，但随着抗生素的持久使用，引发了一系列问题，诸如动物抗病力和免疫力下降、病原菌产生耐药性、动物产品里有抗生素残留有害人类健康。 耐药菌日益增加，可能会将我们的世界推到前抗生素时代。 抗生素作为饲料添加剂已面临了严峻的困境。 近年来的研究表明，微生物制剂作为饲料添加剂，不仅能够防病治病，促进动物生长，而且具有无副作用、无残留、无污染和不产生耐药性等特点，是抗生素不可比拟的，为国内外科研工作者和饲料业者所广泛关注，极具开发前景。 微生物次级代谢产物种类和结构多种多样，采用传统的抗性筛选方法不仅工作5繁重，而且有的微生物次级代谢产物抑菌作用比较弱，不易筛选。 运用现代分子生物学技术可以快速而有效地定向筛选一批产抑菌次级代谢产物的微生物。 目前，国内外虽然对产次级代谢产物的微生物研究比较多，但对湿地生态系统中的细菌研究甚少，湿地环境中的微生物因其生存在独特的生境，从而形成了特殊的生理结构和代谢机制，并产生了许多具有特殊功能的代谢产物34-35。 本文将以从万荣西滩和三门峡天鹅湖中分离获得的细菌的功能基因为研究对象，进行PKS和卤化酶的PCR筛选、DNA序列测定和比对，定向筛选一批具有产新型次生代谢产物潜力的湿地细菌。 本文是首次尝试采用功能基因筛选指导的方法定向筛选产新型抗菌活性物质的湿地微生物资源。 本项目的实施，可为其他新型抗生素的定向发现提供研究思路，对开发我国自主知识产权的新型医用或农用抗生素等具有重要意义。 本文运用生物信息学方法与分子生物学方法对湿地微生物资源，特别是新种资源作了研究，通过设计特异性引物，定向筛选出有产生抗菌活性化合物能力的菌株，来提高新抗菌活性的化合物的筛选效率，降低筛选成本。 首先利用本实验室已经分离鉴定的湿地可培养细菌（XT系列菌株和CH系列菌株）的纯培养物，提取其DNA。 再利用特异性引物扩增法筛选的PKS和卤化酶基因并测序，从而定向的获得具有PKS和卤化酶基因资源的功能菌株。 62实验材料和仪器2.1实验材料2.1.1样品采用本实验室已分离鉴定的湿地细菌菌株的纯培养物为样品，其中从万荣西滩分离得到的XT系列菌株共37株，分布于16个属；从三门峡天鹅湖筛选的CH系列菌株共57株，分布于9个属。 94株细菌分布在18个属。 分布情况如下表表1菌株分布属名西滩湿地菌株天鹅湖湿地菌株共计Serratia404Klebsiella202Oceanimonas101Kosakonia303Escherichia41923Raoultella303Citrobacter6410Exiguobacterium101Pseudomonas7310Zobellella202Bacillus156Aneurinibacillus101Aeromonas112Stenotrophomonas101Aciobacter112Lysinibacillus1127Shigella01515Comamonas077共计3757942.1.2主要药品和试剂（ （1）培养基药品表表2生化试剂列表试剂名称生产厂家产品规格琼脂粉北京奥博星生物技术有限责任公司分析纯（AR）酵母浸粉北京奥博星生物技术有限责任公司分析纯（AR）蛋白胨北京奥博星生物技术有限责任公司分析纯（AR）牛肉浸膏天津市大茂化学试剂厂分析纯（AR）NaCl天津市瑞金特化学品有限公司分析纯（AR）（ （2）DNA提取试剂TE缓冲液（pH=8.0）；溶菌酶浓度为20mg/mL，保存于-20；蛋白酶K浓度为40mg/mL，保存于-20；SDS浓度为20%；Tris饱和酚-氯仿-异丙醇配制比例为25:24:1(v:v:v)；异丙醇用前预冷；75%乙醇用前预冷。 （ （3）核酸电泳所需试剂表表3生化试剂列表药品名称生产厂家6Loading BufferGoldview核酸染料DL2000DNA Marker琼脂糖大连宝生物科技有限责任公司产品大连宝生物科技有限责任公司产品大连宝生物科技有限责任公司产品北京鼎国昌盛生物技术有限公司81TAE溶液；DNA样品。 （ （4）功能基因筛选所用试剂表表4生化试剂列表药品名称生产厂家NaCl天津大茂化学试剂厂N,N-二甲基甲酰胺天津大茂化学试剂厂琼脂粉北京奥博星生物技术有限责任公司蛋白胨北京奥博星生物技术有限责任公司酵母浸粉北京奥博星生物技术有限责任公司-Hind IIIdigest DNA Marker大连宝生物科技有限责任公司ExTaq Polymerase大连宝生物科技有限责任公司dNTP Mixtures大连宝生物科技有限责任公司10ExTaq Buffer大连宝生物科技有限责任公司pMD18-T Vector大连宝生物科技有限责任公司Solution I大连宝生物科技有限责任公司DH-5大肠杆菌（感受态细胞）大连宝生物科技有限责任公司Goldvie II型核酸染料大连宝生物科技有限责任公司DNA片段凝胶回收试剂盒（离心柱型）北京索莱宝生物科技有限公司Ampicillin sodiunsalt BiosharpIPTG BiosharpX-gal Biosharp甘油北京索莱宝生物科技有限公司EDTA北京索莱宝生物科技有限公司SDS北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司2.1.3培养基1)LB培养基(g/L)蛋白胨10g(1%)9酵母浸粉5g(0.5%)NaCl10g(1%)调pH至7.0，加ddH2O定容至1000mL。 2)牛肉膏蛋白胨培养基（g/L）:牛肉浸膏3.5g(0.35%)蛋白胨10g(1%)NaCl5g(0.5%)调pH至7.0，加ddH2O定容至1000mL。 2.1.4主要仪器表表5仪器设备一览表仪器型号及规格生产厂家电热恒温培养箱DNP-9052上海静宏实验设备公司冷冻高速离心机TGL-16M长沙湘仪离心机仪器有限公司恒温振荡培养箱ZHP-100镇江市科密仪器仪表有限公司电热恒温水浴锅HHS天津华北实验仪器公司立式压力蒸汽灭菌器LDZX-50KB上海申安医疗器械厂超净工作台HS-1300U苏州净化设备有限公司漩涡振荡器QL-901海门市其林贝尔仪器厂冰箱BCD-216SDX青岛海尔股份有限公司电子天平FA1004上海舜宇恒平科学仪器有限公司磁力加热搅拌器CJJ78-1金坛市大地自动化仪器厂pH计PHS-3E上海仪电科学仪器股份有限公司微波炉G80F231L格兰仕电器有限公司移液枪M164178西北仪器制造厂PCR仪BIO-RAD美国伯乐生命医学产品有限公司凝胶成像系统Tanon-1600上海天能科技有限公司电热恒鼓风干燥箱DHG-9070A上海精宏有限公司电泳仪DYY-6C北京六一仪器厂10三用紫外分析仪WFH-203B上海精科实业有限公司自动双重蒸馏器ZS-200上海新嘉电子有限公司直式万用电炉ZDL-4上海正慧工贸有限公司凝胶成像系统Tanon-1600上海天能科技有限公司电热恒温水浴锅DK-S24上海精宏实验设备有限公司113实验方法3.1湿地可培养细菌总DNA提取3.1.1总总DNA提取第一步活化菌种将已分离得到菌种XT菌株共37株、CH菌株共57株分别接种于LB液体培养基和牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37恒温振荡培养两天。 第二步收集菌体取菌液1mL于1.5mL离心管中，离心（8000r/min，4）10min，取出离心管，弃上清液，留菌体。 第三步清洗菌体向离心管中加入1mL无菌水，在振荡器上震荡，使菌体充分悬浮。 离心（8000r/min，4）10min。 取出离心管，弃上清液，留菌体。 再重复上述操作一次后加入700L TE缓冲液将菌体悬浮。 第四步裂解菌体向离心管中加入40L溶菌酶，37下静置2h。 再向其中加入11L的SDS和6L的蛋白酶K，50下静置3h。 第五步抽提加入700L的苯酚-氯仿-异戊醇溶液（25:24:1）至离心管中，轻振使其混合均匀。 常温下静置10min。 离心（12000r/min，4）10min。 此时离心管中出现分层，用移液枪吸出上层清液加入新离心管中，再加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇溶液（25:24:1）到离心管中，混合均匀。 常温下静置10min。 离心（12000r/min，4）10min。 再次用移液枪吸出上层清液加入新离心管中。 第六步沉淀向离心管中加入0.6倍体积经预冷的异丙醇，上下振荡，混合均匀，室温下静置10min。 离心（12000r/min，4）10min后，弃上清液，留沉淀。 12第七步洗涤离心管中加入1mL75%的预冷乙醇，置于震荡器上震荡。 离心（12000r/min，4）10min后，弃上清液。 第八步干燥并收集将超净台的风量开至最大，将离心管（内有DNA）开口并倾斜立于超净台中。 吹风约1-2h，离心管中没有液体后，向其中加入35-40L的无菌水，轻轻吹打离心管底部，使其中DNA充分溶解，最后将DNA溶液置于-20冰箱中保存备用。 3.1.2核酸电泳1)胶板配置表表6琼脂糖凝胶配制比例规格1TAE琼脂糖（1%）染色液大胶板25mL0.25g2.5L小胶板13mL0.13g1.3L2)向电泳槽中加入适量的电解缓冲液（1TAE）。 3)将制胶板放入电泳槽中梳子孔一边朝向负极，摆放整齐。 4)根据需要加样样品数剪取适当长度封口膜，依次各取1L的6Loading Buffer于封口膜上。 取5L的DNA与1L的6Loading Buffer充分混匀。 然后将6L混合液全部注入胶孔中。 5)取6L的DNA Marker，将其注入胶孔。 6)注完样品后，盖上电泳槽盖子，启动电源，调节电压为120V，电泳40min，开始电泳。 7)电泳完后，关闭电源，取出胶板，放入凝胶成相仪中，启动仪器。 观察、拍照、标记DNA、保存。 3.2PKS基因筛选3.2.1PKS基因PCR扩增（ （1）PCR引物:(引物为大连宝生物科技有限责任公司产品)正向引物KSF5-GCGATGGATCCAGCAGCG-313反向引物KSR5-GTGCCGGTNCCGTGNGYYTC-3（ （2）PCR反应体系表表7PCR体系试剂用量模板DNA1.0?L正向引物KSF1.0?L反向引物KSR1.0?L ExTaqPolymerase0.2?L dNTPMixtures1.6?L10ExTaq buffer2.0?L无菌水13.2?L共计20?L（ （3）PCR扩增程序1)预变性94时间5min2)变性94时间40s3)退火59时间1min4)延伸72时间40s5)Go to235个循环6)稳定72时间10min7)For ever43.2.2电泳核酸电泳检测，方法同3.1.3步骤。 3.3卤化酶基因筛选3.3.1卤化酶基因PCR扩增（ （1）PCR引物(引物为大连宝生物科技有限责任公司产品)正向引物HALA5-TSGGCGGCGGCACYGCSGGMTGGATG-3反向引物HALB5-GCCGGAGCAGTCGAYGAASAGGTC-314（ （2）PCR反应体系表表8PCR体系试剂用量模板DNA1.0?L正向引物HALA1.0?L反向引物HALB1.0?L ExTaqPolymerase0.2?L dNTPMixtures1.6?L10ExTaq Buffer2.0?L无菌水13.2?L共计20.0?L（ （3）PCR扩增条件扩增程序1)预变性94时间5min2)变性94时间1min3)退火58时间3min4)延伸72时间1min5)Go to235个循环6)稳定72时间10min7)For ever43.3.2电泳核酸电泳检测，方法同3.1.3步骤。 3.4目的基因转化3.4.1PCR产物的回收纯化（胶回收）将3.2.1和3.3.1的功能基因PCR扩增产物进行核酸电泳，所用染液为大连宝生物科技有限责任公司产品Goldview II型核酸染液，使用新配置的1TAE buffer和新配置的胶板。 电泳后的胶板用北京三博远志生物技术有限公司生产的DNA片段凝胶回收试剂盒（离心柱15型）进行纯化，使用试剂盒前，需加入100mL无水乙醇稀释SPW Wash Buffer。 纯化步骤如下 （1）在波长为365nm紫外灯下，用灼烧过的干净刀片切下所需回收的PCR条带，尽量去掉不含PCR产物的胶块，得到凝胶产物体积越小越好，紫外光照时间越短越好。 （2）把切下的有PCR产物的条带放进1.5mL离心管中，称量（提前先称一个空的1.5mL离心管，放入凝胶块之后再称量一次，再将两次重量相减后得到凝胶重量）。 （3）按照每1g凝胶加入1mL Binding Buffer的量，加入对应体积的BindingBuffer。 （4）55-65水浴放置10min（或直至胶完全溶解）。 每隔2-3min涡旋振荡一次或颠倒离心管2次帮助加速溶解。 （5）把HiBind DNA柱子套进2mL收集管。 将DNA/凝胶混合液加入收集管的HiBind DNA柱子中，9000r/min离心1min，弃去滤液。 （6）将柱子重新装入收集管中，加入300mL BindingBuffer，按上述条件离心，弃滤液。 （7）把柱子装回收集管，加入700?L SPW WashBuffer，9000r/min离心1min后，弃废液。 （8）将HiBind DNA柱子放回空收集管中，11700r/min空柱离心2min，尽量除去漂洗液，以免SPWWashBuffer中残留乙醇抑制下游反应。 （9）取出HiBind DNA柱，放入一个干净的离心管中，往柱子基质内加入30-50?L65预热的Elution Buffer，室温放置2min，11700r/min离心2min，洗脱出DNA。 再次进行核酸电泳验证后，可立即使用或保存于-20备用。 3.4.2连接将回收条带PCR的纯化产品进行酶连，采用10L酶连体系，见表9。 表表9PCR体系试剂用量PCR纯化产物4.5L pMD18-T Vector0.5L SolutionI5L共计10L16将反应体系放入PCR仪中16下连接过夜。 3.4.3转化 （1）将10L连接好的载体片段加入到30L大肠杆菌感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置30min。 （2）42水浴加热90s。 （3）冰上放置15min。 （4）加入700L LB培养基，37140r/min振荡培养2h。 （5）室温下4000r/min离心5min，用枪弃去300L上清液，剩余沉淀用枪吹打混匀。 （6）LB平板的准备待LB固体培养基冷却至55-60时加入0.1%100mg/mL的Amp溶液，轻轻混匀后倒平板，待平板凝固后滴加40L40mg/mL的X-gal和5L200mg/mL的IPTG进行涂布）。 （7）取适量菌液涂布在倒好的LB平板中。 （8）用封口膜封口，在37下正向放置1h将液体吸收充分，再倒置培养过夜。 （9）取出平板，在4放置1h，使蓝色充分显现。 观察现象，未转化成功的菌落呈现蓝色，转化成功的菌落呈现白色。 3.4.4阳性克隆的菌落PCR检测（ （1）PCR扩增从涂有IPTG及X-gal的含Amp的LB平板上用灭菌牙签挑取白色菌落到10L无菌水中，充分混匀后，从中吸取部分菌液进行PCR扩增。 菌落PCR程序与基因筛选时的PCR程序相同。 扩增体系见表10。 表表10PCR体系试剂用量10ExTaq Buffer2.0L dNTP0.6L ExTaqPolymerase0.1L正向引物0.5L反向引物0.5L17模板2.0L无菌水14.3L共计20.0L（ （2）核酸电泳方法同3.1.3步骤。 3.4.5测序将PCR检测为阳性克隆的大肠杆菌加入LB培养基中，37振荡培养过夜（12h内），取1mL菌液于1.5mL离心管中，加入200L的15%甘油溶液，送由北京三博远志公司测序。 3.4.6序列比对分析将测序回来的功能基因序列在NCBI载体去除工具上比对，根据比对结果去掉载体序列。 在GenBank数据库中注册，获取基因登录号。 利用在线软件EzBiocloud比对选取功能基因相似度最高的菌。 184结果与分析4.1细菌DNA提取结果部分菌株的DNA电泳图，如图1。 图图1DNA提取结果4.2PKS和卤化酶基因扩增结果4.2.1PKS和卤化酶基因的PCR筛选结果 (1)PCR筛选的部分结果如图2所示。 图图2PKS（a）和卤化酶（b）基因的PCR筛选结果；DL2000DNAMarker（c） (2)基因组中含PKS或卤化酶基因的菌株筛选本文重点研究了分离获得的湿地细菌，希望能够从这些菌株中找到具有研究价值的产抗菌株。 提取这些细菌的基因组为模板，用特异性引物扩增到约700bp的PKS基因片段19和约650bp的卤化酶基因片段。 筛选出PKS或卤化酶基因阳性的菌株共11株（表11）。 基因组中含有PKS基因的5株，占5.32%。 这5株细菌分布在3个属Raoultella，Citrobacter，Bacillus。 分别占33.33%，10%，50%。 基因组中含有卤化酶基因的细菌共7株，占7.45%，分布在4个属Kosakonia，Citrobacter，Bacillus，Comamonas。 分别占100%，10%，16.67%，28.57%。 其中1株细菌基因中既含有PKS基因又含有卤化酶基因。 图图3蓝白斑筛选（a）；菌落（b）；卤化酶菌落PCR检测结果（c）4.2.2获得基因序列获得的基因序列见附录。 表表11基因组中含PKS或卤化酶基因的菌株菌株PKS卤化酶Kosakonia sp.XT-4-+Raoultella sp.XT-6+-Citrobacter sp.XT-7+-Kosakonia sp.XT-11-Kosakonia sp.XT-13-+Bacillus sp.CH-27+-Bacillus sp.CH-46+Citrobacter sp.CH-51-+Comamonas sp.CH-66-+Comamonas sp.CH-67-+20Bacillus sp.CH-70+-注“+”为PCR克隆阳性，“-”为PCR克隆阴性。 4.2.3PKS和卤化酶基因序列的初步分析（ （1）PKS序列比对将获得的PKS基因片段通过NCBI中的BLAST进行在线比对，见表12。 结果显示Raoultella sp.XT-6，Bacillus sp.CH-27，Bacillus sp.CH-46，Bacillus sp.CH-70的PKS序列与已知的PKS基因序列的同源相似度较高，为97%-99%。 Citrobacter sp.XT-7的PKS基因序列的同源相似度较低，为91%，极可能是较新的PKS基因。 表表125株细菌与菌株的PKS基因序列相似度比对菌株片段大小（bp）相似度（%）已知PKS序列Raoultella sp.XT-671499%Raoultella ornithinolyticaB6（CP004142）Citrobacter sp.XT-762291%Enterobacter asburiaeL1（CP007546）Bacillus sp.CH-2770199%Bacillus sp.LX-113（KM054990）Bacillus sp.CH-4669599%Bacillus sp.LAY（KM000039）Bacillus sp.CH-7069897%Bacillus sp.LX-130（KM054995）（ （2）卤化酶基因序列比对将获得的卤化酶基因片段通过NCBI中的BLAST进行在线比对。 结果显示Comamonas sp.CH-67同源性最高为100%，Comamonas sp.CH-66同源性最低，为85%。 其余5条卤化酶序列与已知的卤化酶基因序列的同源相似度为96%-99%。 这说明从这些菌种里筛选到的卤化酶序列有2株极有可能是较新的卤化酶基因，也进一步从分子水平说明了从这些菌群里发现能产生新药的活性菌的可能性。 表表137株细菌与菌株的卤化酶基因序列相似度比对菌株片段大小（bp）相似度（%）已知卤化酶序列Kosakonia sp.XT-473097%Serratia proteamaculans568（CP000826）Kosakonia sp.XT-1172797%Serratia proteamaculans568（CP000826）Kosakonia sp.XT-1372997%Serratia proteamaculans568（CP000826）21Bacillus sp.CH-4665199%Bacillus sp.BH072（CP009938）Citrobacter sp.CH-5175096%Enterobacter cloacaesubsp.cloacae NCTC9394（FP929040）Comamonas sp.CH-6667285%Delftia sp.Cs1-4（CP002735）Comamonas sp.CH-67660100%Burkholderia pseudomallei（CP009586）4.2.4总结以提取分离得到的湿地细菌的基因组作为模板，用次级代谢产物合成基因的特异性引物扩增法来筛选基因组中含PKS或卤化酶基因的细菌。 筛选出基因组中含有PKS基因的5株，占5.32%。 基因组中含有卤化酶基因的7株，占7.45%。 其中1株基因中既含有PKS基因也含有卤化酶基因。 BLAST比对分析发现，Citrobacter sp.XT-7的PKS基因序列相似度为91%，有可能是新型的PKS基因。 Citrobacter sp.CH-51，Comamonas sp.CH-66的卤化酶基因序列相似度较低，为96%和85%，极有可能产生新型的卤化物合成酶。 筛选结果表明含有次级代谢产物合成的基因的菌株在此次分离得到的细菌菌株中集中分布在Kosakonia，Raoultella，Citrobacter，Bacillus，Comamonas这5个属中，为新型抗生素的发掘研究提供了新的方法和丰富的菌种资源。 225讨论与结论筛选新种资源与新化合物的方法创新。 随着抗生素的不断使用，病原菌对动物和人类出现的非常严重的耐药情况。 筛选工作一直是科