乳杆菌生理生化实验

形态学鉴定1唯一碳源利用(编码特征1-19)1过氧化氢酶试验(编码特征20)1氧化酶试验(编码特征21)2石蕊牛乳试验(编码特征22-27)20.1美兰牛乳试验(编码特征2829)2耐酸碱试验(编码特征30-35)2生长温度范围试验(编码特征36-41)2耐盐性测定(编码特征42-47)2硝酸盐还原反应(编码特征48)2七叶苷水解(编码特征49)3联苯胺反应试验(编码特征50)3柠檬酸盐利用试验(编码特征51)3葡聚糖产生试验(编码特征52)3吲哚产生试验(编码特征53)3硫化氢产生(编码特征54)3明胶液化试验(编码特征55)3V_P反应(编码特征56)3甲基红(编码特征57)3苯丙氨酸脱氨酶测定(编码特征58)4纤维素分解试验(编码特征59)4脲酶测定(编码特征60) 4精氨酸产氨试验(编码特征61)4精氨酸水解试验(编码特征62)4丙二酸利用试验(编码特征63)4药敏试验(编码特征6572)4全部接种菌株均为MRS液体培养基中培养24h的菌株。形态学鉴定将分离纯化的菌种分别涂到MRS固体培养基， 30培养24h，观察菌落特征，取典型菌落涂片，并进行革兰氏染色，芽孢染色，鞭毛染色，油镜下观察菌体形态，拍照。唯一碳源利用(编码特征1-19)试验中以甘露醇、D-海藻糖、D山梨醇、木糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖，葡萄糖、葡萄糖酸钠、棉籽糖、纤维二糖、D阿拉伯糖、D核糖、鼠李糖、淀粉、甘油，肌醇、马尿酸钠等18种含碳化合物作为唯一碳源，根据要求不同在PY基础培养液中浓度分别为1和05。结果用BTB-MR指示剂检测(凌代文，东秀珠，1999)。葡萄糖发酵同时检测产酸产气的情况(MJ佩尔扎，RD里德，ECS詹，1984)。过氧化氢酶试验(编码特征20)将供试菌株接种于MRS培养液中，37培养18h，用接种环挑取一环涂于干净的载玻片上，放置约20min后，在其上加一滴3的H202，若有气泡产生则为阳性反应，无气泡为阴性反应(凌代文，东秀珠，1999)。氧化酶试验(编码特征21)用l四甲基对苯二胺盐酸浸湿新华滤纸，置于培养皿中，然后用灭菌竹签挑取供试菌在滤纸上划线，10s内若划线部分变为紫色者为阳性反应，不变色者为阴性(东秀珠，蔡妙英，2001)。石蕊牛乳试验(编码特征22-27)将25的石蕊水溶液与脱脂乳按4：100(vv)的比例混合，使牛乳呈丁香花紫色；分装试管，110C灭菌20min。接种供试菌，37(2培养，持续观察14d，记录结果(东秀珠，蔡妙英，2001；赵斌，何绍江，2002)细菌对牛奶的作用有以下几种情况：(1)产酸一细菌发酵乳糖产酸，使石蕊变红。(2)产碱细菌分解酪蛋白产生碱性物质，使石蕊变蓝。(3)胨化细菌产生蛋白酶，使酪蛋白分解，故牛奶交得比较澄清。(4)酸凝固细菌发酵乳糖产酸，使石蕊变红，酸度很高时，可使牛奶凝固。(5)凝乳酶凝固有些细菌能产生凝乳酶，使牛奶中的酪蛋白凝固，此时石蕊常呈蓝色或不变色。(6)还原细菌生长旺盛，使培养基氧化还原电位降低，因而石蕊还原褪色。0.1美兰牛乳试验(编码特征2829)将脱脂乳分装试管，110灭菌20min。接种供试菌，37培养3天后加入l滴O1的美蓝溶液，蓝色褪去者为美蓝还原阳性，蓝色不褪去者为阴性(张丽萍，艾玉琴，杨焕民，1995；沈萍，范秀容，1999)。耐酸碱试验(编码特征30-35)本试验测定了供试菌株对酸碱的耐受性。先将MRS液体培养基灭菌后用无菌HCI和NaOH将培养基的pH调至pH30、pH 40，pH 45、pH80、pH 92、pH 96，以pH64的液体做阳性对照。接种、培养、观察和记录结果，与阳性对照同样浑浊的记为阳性，否则为阴性(凌代文，东秀珠，1999)。同时生长温度范围试验(编码特征36-41)选择10、15、18、45、50、60C(30min)等6种不同温度范围的反应，MRS液体培养基培养，结果用接种菌株于37C培养为阳性对照，每隔2 h测定其吸光值(OD600)。(凌代文，东秀珠，1999)。耐盐性测定(编码特征42-47)在3%、4%、65%、8%、12%、15%等6种不同NaCI浓度范围的反应在MRS液体培养基培养，结果以不含NaCI的MRs液体培养基作对照(凌代文，东秀珠，1999)。硝酸盐还原反应(编码特征48)将硝酸盐还原液体培养基分装试管，8mL管，37C培养48h，另保留一支不接种硝酸盐培养基作为对照检查方法如下：在比色皿中，加入一滴菌液，再加Griess试剂A、B液各一滴，如出现橙色或红色为硝酸盐还原阳性；如无橙色或红色出现，则再加一滴二苯胺试剂进一步检查，若呈现蓝色反应，则为阴性结果，不呈现蓝色，则为阳性结果(赵斌，何绍江，2002)。七叶苷水解(编码特征49)在PY基础培养基中加入七叶苷，其浓度为59L，分装灭菌，培养2d后取少许培养液于比色皿中，同时以未接种的七叶苷培养液为对照，分别滴加柠檬酸铁试剂，如为黑色，则为阳性反应，不显色，为阴性(凌代文，东秀珠，1999)。联苯胺反应试验(编码特征50)将供试菌株接种于含联苯胺指示剂的半固体琼脂中，37培养，观察菌株还原联苯胺情况(李季伦等，1985)。柠檬酸盐利用试验(编码特征51)将供试菌株接种于柠檬酸盐培养基(加入溴麝香草酚蓝)中，37培养2d，观察记录结果。斜面培养基呈蓝色的为阳性，不变色为阴性(陈天寿，1995)。葡聚糖产生试验(编码特征52)将供试菌株接种于含10蔗糖的MRS固体培养基平板上，2532培养2-4d。如平板培养物形成粘稠状菌苔，表明葡聚糖产生，为阳性反应；反之，为阴性反应(凌代文，东秀珠，1999)。吲哚产生试验(编码特征53)将供试菌株接种于产吲哚的培养液中，3732培养24h，向试管中加入吲哚指示剂，观察结果。若培养液上层出现玫瑰红色，说明产生了吲哚，为阳性，若没有玫瑰红色出现，则向其中加入乙醚约lmL，震荡混匀，静置片刻，待乙醚浮于培养液上面时。沿管壁慢慢加入吲哚指示剂10滴，此时若乙醚层出现玫瑰红色，同样说明有吲哚产生，为阳性，反之为阴性(东秀珠，蔡妙英，2001；赵斌，何绍江，2002)。硫化氢产生(编码特征54)将供试菌株接种于含半胱氨酸的培养液中，用无菌镊子夹取乙酸铅纸条悬挂于接种管中，纸条下端接近培养基表面而不接触液面，上端用棉塞塞紧，同时在未接种的试管培养基上也悬挂纸条，作为对照。置于适温培养，观察比较，纸条变黑者为阳性，反之，为阴性(凌代文，东秀珠，1999)。明胶液化试验(编码特征55)将供试菌株接种于含12明胶的基础培养基中，以不接菌明胶培养基作对照，适温培养，4d后取出置于低于20的环境，等空白对照凝固后观察。若培养基呈流动状或表面向下凹陷为阳性，不凝固者，放回温箱继续培养至7d再观察，直至30d，仍然不液化则为阴性反应(凌代文，东秀珠，1999)。V_P反应(编码特征56)将供试菌株接种于MRS培养液中，37培养48h，取lmL于无菌试管中，在其中加入06mL试剂A和试剂B(不加盖)，摇床振荡30min，显示红色为阳性，反之为阴性(凌代文，东秀珠，1999)试剂A：a一萘酚50 g，95乙醇lOOmL试剂B：KOH 809，肌醇(Creatine)069，蒸馏水200mL。甲基红(编码特征57)接种供试菌株于蛋白胨液体培养基中，每次重复2次，适温培养2、6d。观察结果。在培养液中加入一滴甲基红试剂，红色为甲基红试验阳性反应。黄色为阴性反应(因甲基红变色范围44红至66黄)(东秀珠，蔡妙英，2001)。试剂：甲基红0.1g95乙醇300mL蒸馏水200mL苯丙氨酸脱氨酶测定(编码特征58)将供试菌株接入苯丙氨酸培养基内。28培养24h后，在培养基上滴加4-5滴lOFecl3溶液，出现蓝绿色者为阳性，否则为阴性反应(张纪中，1990)。纤维素分解试验(编码特征59)将基础培养基分装试管，在培养基中浸泡一条优质滤纸。将供试菌接种于该基础培养基中，37培养l-4周，观察结果将滤纸条分解成一团纤维或将滤纸条折断或交薄者为阳性。滤纸条无变化者为阴性(东秀珠，蔡妙英，2001)。脲酶测定(编码特征60) 将尿素灭菌后添加到PY基础培养液内，将供试菌接种于该培养基内，同时接种未加尿素浓缩液的PY基础培养基中作对照。适温培养25d，观察结果。检测pH值，将酚红指示剂滴入培养液中，PY尿素培养液显红色，为阳性反应。如果其中培养液与对照一样，不变红色，为阴性【凌代文，东秀珠，1999精氨酸产氨试验(编码特征61)将供试菌株接种于含精氨酸的PY基础培养液中，同时接种不含精氨酸的PY培养液做对照，37C培养3d，取少量培养液于比色皿中，加奈氏试剂数滴，若出现橙黄色或黄褐色沉淀，且明显强于对照，为阳性反应：反之为阴性反应 (凌代文，东秀珠，1999)。精氨酸水解试验(编码特征62)接种12滴培养过夜的菌液在特殊培养基内，并在其上层加盖无菌的石蜡矿物油。放置在37下，培养72h。观察结果，接种和培养的试管培养基转变成黄色，指示葡萄糖产酸，为阴性反应。培养基内pH指示剂显示紫色，表明精氨酸经细菌酶水解，释放有碱性产物，是阳性反应(凌代文，东秀珠，1999)。丙二酸利用试验(编码特征63)将供试幼龄菌种接种于丙二酸培养液(加入溴百里酚蓝)中，另接种未加丙二酸的作空白对照。适温培养12d，培养液由绿变蓝者为阳性：培养基不变色者为阴性(赵斌，何绍江。2002)。酪素水解试验(酪蛋白水解)(编码特征64) 牛奶平板的制备：取5克脱脂奶粉加入50mL蒸馏水，另称15克琼脂溶于50mL蒸馏水中，将两液分开灭菌。待冷却至4550C时，将两液混匀倒平板，即成牛奶乎板。将平板倒置过夜，使表面水分干燥，然后将菌种点接在平板上，每