糖皮质激素性骨质疏松模型大鼠实验生化研究.docx

针药结合对糖皮质激素造模骨质疏松大鼠BMC、BMD及骨代谢影响的实验研究景涛1、2 贾叶1 成守仁2 卢小健2 （1.南京中医药大学第一临床医学院 210046； 2.南京体育学院医院210014）摘要：目的 探讨针药结合对糖皮质激素造模骨质疏松大鼠BMD、BMC及骨代谢影响的作用原理与机制。方法 选用3月龄雌性SD大鼠40只，体重17010g,随机分为空白对照组、模型组、药物组、针药组，每组10只。各组大鼠连续造模和治疗12周后，扫描测得大鼠腰椎BMC和BMD，并用放免法检测血清E2、FSH、LH、CORT、ACTH、CRH的指标水平。结果 模型组大鼠BMC、BMD明显低于空白对照组和治疗组 (P0.05)，与药物组比较有显著性差异(P0.05)；模型组和药物组血清E2、FSH、LH、CORT、ACTH、CRH均低于空白对照组和针药结合组， (P0.05)。结论 采用针药结合疗法优于单一的药物组的疗效；对糖皮质性骨质疏松症有良好的预防性治疗作用。关键词：针药结合；糖皮质激素；骨质疏松；生化检测Experimental Study on BMD、BMC and bone metabolism of Glucocorticoid-induced Osteoporosis in rats model Influenced by Acupuncture-Drug combination treatment(Tao Jing1、2 Yelan Liu1 ,1. Nanjing University of Chinese Medical, First Clinical Medical College 210046; 2. Nanjing sport institute Hospital , 210014,Nanjing , China)显示对应的拉丁字符的拼音字典 - 查看字典详细内容Abstract: Purpose To investigate the role principles and mechanism of the combination of acupuncture with drug on prevention of glucocorticoid-induced osteoporosis. Methods Selected 3-month-old female SD rats 40, weight 170 10g,randomly divided into normal group, model group, the drug group, needle drug group, each group of experimental rats were 10.After 12 weeks of treatment and modelling, all rats were scanned by DEXA for BMC and BMD on lumbar spine, and using RIA to detect target level of E2、FSH、LH、CORT、ACTH、CRH in the serum of rats. Results Model rats lumbar spine bone mineral density, bone content decreased significantly, significantly lower than the normal group and treatment group, there were significant differences (P 0.05). but there were significant differences between acupuncture-drug combination group and drug group (P 0.05). In the Model group and drug group, the target level of E2、FSH、LH、CORT、ACTH、CRH in the serum of rats were significantly lower than normal group and the group with acupuncture-drug(P (相当于强的松) 7.5mg/d。尽管现代医学已经发展到一个很高的水平，但对于因激素治疗所带来的副作用仍然没有很好的防治手段。GCS治疗可以引起多种不良反应，其中糖皮质激素诱导的骨质疏松症(glucocortiocoids-induced osteoporosis，GIO)可以导致椎体、肋骨、髋部等多个部位骨折，严重影响了患者生活质量并增加社会负担，是GCS的严重并发症之一，目前尚无有效的治疗手段1、2。笔者在以往的临床研究中发现针灸对原发性骨质疏松症有明显的治疗效果，为探讨糖皮质激素诱导骨质疏松的机制以及有效的干预措施，笔者进行了针药结合对糖皮质激素性骨质疏松模型的研究。1.材料1.1实验动物SD清洁型雌性大鼠40只，由上海莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号SCXK（沪）2003-0003。 1.2药物 阿伦膦酸钠片（石家庄制药集团欧意药业有限公司。产品批号：009060301）：有效期：2012.03.26。地塞米松磷酸钠注射液(江苏涟水制药有限公司。产品批号：E090725)：有效期：2012.05.30。1.3试剂盒(1).美国ADL goat antirat Adrenocorticotropic Hormone Elisa测定试剂盒（Catalog No：ADL CD-A011 Lot No：RT110371有效期：JUN 2012）。(2).皮质醇放射免疫分析药盒50T1 批号：20101101。(3).雌二醇放射免疫分析药盒50T1 批号：20101101。(4).卵巢促激素放射免疫分析药盒50T1 批号：20101029。(5).促黄体生成激素放射免疫分析药盒50T1 批号：20101029。1.4 主要实验设备及仪器(1)三级动物实验室（医学实验动物环境为鼠类实验室，清洁级，合格证书23-0 1 6，南京中医药大学提供）。 (2).美国产lead-tech型超低温冰箱(3).美国GE公司产LUNARDPX-MD+型双能X线骨密度仪(4).德国产Labsystems Finnpipette 50、100l型移液器(5).HH-4型数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）(6).芬兰产Thermo Multiskan Spectrum spectrophotometer型酶标仪(7).sn-695B型 智能放免测量仪（上海原子核研究所日环仪器一厂） 2方法 2.1动物分组 将40只SD清洁型雌性大鼠观察1周后，随机分为四组：空白对照组、模型组、药物组、针药结合组，每组各10只。2.2动物造模 将40只雌性大鼠随机分为四组：空白对照组、模型组、药物组、针药结合组，每组各10只。各组动物均在1824通风良好，湿度在60-70%的环境下饲养，自由饮水、摄食。（1）空白对照组： 同时每日用注射器灌胃生理盐水（灌胃剂量为：1ml）。（2）模型组： 每周2次肌肉注射地塞米松，每次注射量为：0.2mg/100g，连续用药12周。同时，每日用注射器灌胃生理盐水（灌胃剂量为：1ml）。（3）药物组： 每周2次肌肉注射地塞米松，每次注射量为：0.2mg/100g，连续用药12周，同时采用灌胃法给予阿伦膦酸钠片剂的水溶悬浊液每日灌胃次，每次10mg/kg，连续用药治疗12周。（4）针药结合组： 除采用药物组的造模和药物治疗方法外，同时每天接受电针治疗1次。其具体方法为：选用下三里穴位，取穴方案按照华兴邦氏的方法实施，用细美容针刺入穴位后，接电针仪进行电针刺激，连续脉冲波、频率3-4Hz、强度4-5mA，以动物局部轻度抖动为度，每次10分钟，每日1次，连续治疗12周。每2周为1个电针疗程，暂停电针治疗1次。各组大鼠造模和治疗12周后，摘除眼球取血，分离血清，置于-20冰箱保存集中待测。2.3检测指标2.3.1骨密度检测： 大鼠处死前1天，用DEXA骨密度仪及所附小动物梯级标准模型和分析软件在其腰椎体进行扫描，得出大鼠腰椎的骨密度（BMD）和骨含量（BMC）。( 注：大鼠BMD、BMC扫描部位L3 )2.3.2生化指标测定促肾上腺皮质激素（ACTH）、促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）测定 首先，测定前将试剂盒放置室温40分钟，所有试剂在使用前都轻轻摇匀； 准备浓缩洗涤液与新鲜的医用双蒸水（1：20倍稀释），混匀后室温放置待用。取出酶标板，依照次序对应分别加入100l的标准品于空白微孔中（不同浓度的标准品移液时，采用不同的吸头）；分别标记样本编号，加入100l 血清于空白微孔中（不同的样本采用不同的吸头）；在标准品孔中和样品孔中加入50l的酶标记溶液，用移液器反复吸打，进行混匀（不同的微孔取液采用不同的吸头）；轻微摇动酶标板，使得液体充分混匀，用保险膜密封酶标板，然后置于37的水浴锅中准确水浴60分钟。然后将酶标板取出，将其中的液体甩去，每个孔中全部加满洗涤应用液后，立即甩去液体；每个孔中再次全部加满洗涤应用液后，室温静置2分钟，其间每隔20-30秒轻微振摇酶标板。2分钟后将孔中的洗涤应用液甩去，在吸水纸上将酶标板拍干。再重复第个步骤6次；在吸水纸上将酶标板底部上残留的水渍擦干；在每个孔中加入底物A 50l（不同的微孔取液采用不同的吸头）；在每个孔中加入底物B 50l（不同的微孔取液采用不同的吸头），用移液器反复吸打，进行混匀；轻微振摇酶标板，然后在37水浴锅中避光反应15分钟（酶标板置于铝制饭盒中进行反应）；每个微孔中加入50l的终止液，（不同的微孔取液采用不同的吸头），用移液器反复吸打，进行混匀；在Thermo Multiskan Spectrum spectrophotometer酶标仪上，450nm处测定OD。标准曲线的制备： 以B/T计算NSB、S0结合百分率，以B/B0计算标准及待测样品结合百分率，在半对数坐标纸上绘制标准曲线，并查出样品值。或由自动计数器预先编制程序，直接给出有关参数，标准曲线及样本浓度。NSB（NSB管的cpm数T管的cpm数）100Bo（Bo管的cpm数NSB管的cpm数）T管的cpm数100BBo（标准或样品管的cpm数NSB管的cpm数）（Bo管的cpm数NSB管的cpm数）100以Logit=ln（B/B0）/（1-（B/B0）为横坐标，ln浓度为纵坐标，作标准曲线。皮质醇（CORT）雌二醇（E2）、卵巢促激素（FSH）、促黄体生成激素（LH）放射免疫测定 操作步骤（直接取大鼠血清100ul进行测定），操作步骤（直接取血清50l进行测定）充分混匀，室温放置15min后， 43500rpm离心15min，吸弃上清液，在计数器上测定各管沉淀的放射性计数cpm。2.4统计学处理 所有实验进行数据均使用SPSS11.5版统计软件处理，检测结果以均数（ S）表示，多组间差异的显著性采用单因素方差分析（F检验），用student-newman-kruls法进行组间的两两比较。3结果 31骨密度（BMD）检测 表1 各组实验动物腰椎体的BMD对比（ S；n=10）Tab.1 Comparison of BMD on lumber（L3）of vertebra of experimental rats in groups（ S; n=10）g/cm2 组别 第3腰椎体（g/cm2） 针药组 0.3690.0165* 药物组 0.3170.0130* 模型组 0.2370.0154 空白组 0.395 0.0121# 说明：12周治疗后，第3腰椎体BMD与模型组比较：*P0.O5， *P 0.O1，#P 0.O1。32骨含量（BMC）检测表2 各组实验动物腰椎体的BMC对比（ S）；n=10）Tab.2 Comparison of BMC on lumber（L3）of vertebra of experimental rats in groups（ S; n=10）g 组别 第3腰椎体（g） 针药组 1.16530.01124*药物组 0.81250.01023*模型组 0.62040.00965 空白组 1.24350.00874 说明：12周治疗后，第3腰椎体BMC与模型组比较： *P0.O5， *P 0.O1，#P0. O5；*P 0. O1，#P0. O5；*P 0. O1，#P0. O5；*P 0. O1，#P0. O5；*P 0. O1，#P0. O5；*P 0. O1，#P0. O5；*P 0. O1，#P0.05)， 优于药物组；与针药结合组比较，模型组的BMD、BMC水平最低（P0.05）。上述针药结合组与模型组和药物组之间的BMD、BMC显著的差异可以说明，针灸可能通过对神经内分泌网络的调节，而促进局部环境中许多细胞因子等一系列极为复杂地改变，并通过对机体全身性、多环节的调节作用，而增加性腺上雌激素的受体敏感性或雌激素的受体数量；从而最终影响骨组织的微环境而提高成骨细胞的活性，调节内环境微量元素的平衡，促进矿物质在骨中的沉积，促进骨形成，抑制骨吸收，纠正骨代谢的负平衡状态，防止了骨质的进一步丢失，进而发挥抗OP的作用。 在本研究中，针刺后E2、FSH、LH的水平提高，可能就是通过调节下丘脑垂体性腺轴功能的作用来提高卵巢中未完全闭锁的卵泡以及垂体雌激素受体的基因表达及雌激素活性，进而促进了睾酮向雌二醇的转化，从而使血清中E2水平得到提高的。同时针刺后CORT、ACTH、CRH的水平提高，亦可能是通过下丘脑垂体肾上腺皮质腺轴的功能来发挥作用的。正因如此笔者认为上述6种激素在各组所存在的差异也可能与针药结合治疗组运用针刺进行预防性治疗，进而在调节下丘脑垂体肾上腺皮质腺轴的同时又参与调节下丘脑垂体性腺轴的功能有关。本实验的结果在一定程度上支持了这一说法。参考文献：1 National Osteoporosis Foundation Physicians guide to prevention and treatment of osteoporosis copyright NOF,Washington DC.2008. 2 Midori N,Nobuyuki U,Sachiko M ,et al. Osteoprote-gerin regulate bone formation through a coupling mechanism bone resorption J.Endocrinology ,2003 ,144(12):5441.3SchinnerS.Wnt-signallingand the metabolic syndromeJ.Horm Metab Res,2009,41(2):159.4 徐晓东. 糖皮质激素性骨质疏松症研究述评J.中华中医药学刊，2007,l25(7):1427-1428.5 Midori N,Nobuyuki U, Sachiko M , et al. Osteoprote-gerin regulate bone forma