根霉菌的筛选.doc

根霉菌的筛选我国是一个农业大国，农作物的秸秆是一个十分巨大的潜在可用资源，近年来，利用微生物所产生的纤维素酶将秸秆转化为营养价值较高的蛋白质饲料备受人们的青睐。而至今未能大量把纤维素类物质作为饲料生产原料，其主要原因之一是生产上缺乏高纤维索酶活的菌。选取优良的产纤维素酶菌种是提高纤维素酶活力的关键。不同微生物合成的纤维索酶在组成上有显著的差异，对纤维素的酶解能力也不大相同。由于放线菌的纤维素酶产量极低，研究很少。细菌的产量也不高，主要是葡聚糖内切酶，且大多数对结晶纤维素没有活性，所产生酶是胞内酶或吸附在菌壁上，很少能分泌到细胞外，增加提取纯化难度，在工业上很少应用。因此，筛选具有高活性纤维素酶的秸秆降解微生物菌株以及相关研究是当前研究的热点和难点。本实验就从腐烂稻草及其附近土壤中如何筛选出可降解菌种进行探讨。1.筛选的简要流程：菌种平板筛CMC-Na刚果红复筛滤纸失重率固态酶曲培养2.1纤维素分解茵的分离样品自制牛肉膏蛋白胨培养液：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，NaCl 5g，H201000 mL，pH值为7.07.2，在121灭菌20min，将稻草粉加入水和牛肉膏蛋白胨培养液在28培养箱中培养。土壤浸出液。2.2纤维素分解茵的分离、纯化培养基羧甲基纤维素培养基：CMCNa 15g，NH4N03 1g，酵母膏1g，MgS047H20 0.5g，KH2P04 lg，H20 1000 mL。纤维素刚果红培养基：K2HPO4 05g，CMCNa 188g，MgSO47H20 0.25g，明胶2g，刚果红0.2g，琼脂14g，土壤浸出液100mL，H20 900mL，pH值为67。PDA培养液：马铃薯200g，蔗糖20g，水1000mL。赫奇逊培养液：KH2P04 1g，CaCl2 0.1g，MgS047H20 0.3g，NaCl 0.1g，FeCl3 0.01g，NaN03 2.5g，H20 1000mL，pH值为7.27.3。纤维素琼脂培养基：(NH4)2SO4。2g，MgS047H20 1g，NaCl 1g，CaC03 2 g，琼脂20g，水500mL，121灭菌20 min倒平板后，盖上与平板大小一致的无菌滤纸。固态发酵培养基：稻草粉(取稻草，切成24cm 小段，机器打碎，过60目筛)7g，麸皮3g，(NH4)2SO4,2g，H20 20g，分装入锥形瓶，121灭菌20 min。2.3 纤维素分解茵的分离与纯化将样品置于无菌三角瓶中，加入10倍体积无菌水打散均匀后，取5 mL悬液加入盛有50 mL富集培养基(纤维素琼脂培养基)的三角瓶，在28和150 rmin下，振荡培养35 d后移取5 mL培养液至另一盛有新鲜富集培养基的三角瓶中继续培养。取富集后的培养液做系列稀释梯度lO-1、10-2、10-3、lO-4、10-5，分别先后涂布于筛选纤维素琼脂平板和刚果红培养基平板，置于30培养箱中培养。分别挑选出透明圈大的真菌，接种斜面保存以备用。2.4滤纸失重率将赫奇逊培养液分装在500 mL锥形瓶中，将1张滤纸预先烘干，称重，记录每张滤纸重量，将每张滤纸剪成1 cm见方的小块，分别放入1瓶500 mL赫奇逊培养液中，121灭菌20 min。将所筛选菌株接种于上述培养基中，在30和120rmin的条件下，振荡培养710d，观察滤纸条崩解情况。培养终止后测定滤纸失重。用滤纸失重前的重量减去滤纸失重后的重量，再除以失重前的重鼍即为滤纸的失重率。2.5羧甲基纤维素酶活测定取样品适当倍数稀释液1 mL，加入lCMCNa溶液4 mL(溶于pH值为46的01 molL HAcNaAc缓冲液)于试管中，40反应5 min，迅速加入1 mL NaOH和2 mL DNS试剂，沸水浴5 rain，冷却后加水定溶至10 mL，摇匀后在UV一2001分光光度计520 nm下测OD值，同时以1 mL水代替酶液，其他条件相同作为空白对照。对照标准曲线测算酶活力。在上述条件下，酶活力按国际单位规定：定义1 min催化纤维索水解生成1umol葡萄糖的酶量为1个酶活力单位(IU)。3.筛选结果本试验分离得到了大量具有较好纤维素分解能力的细菌、放线菌和真菌类菌株，其中ZJ一8为1株具有较高纤维素分解能力的真菌菌株。任何一个微生物菌种的筛选都涉及到培养基组成及生长条件的选择，对于培养基而言，选择适当则会大大减少工作量。在纤维素分锯菌的初筛过程中，本试验采用了几种分离纤维素分解菌的培养基，分别采用不同类的纤维素做惟一碳源，主要考虑的是不同菌种对几种纤维素的适应性，如果只选用一种培养基，可能会造成一些优良菌种的丢失。试验证明，刚果红培养基是较好的分离筛选培养基，产酶菌株能在平板上形成水解圈，因为纤维素是由葡萄糖残基以B1，4糖苷键连接而成的线状大分子物质，纤维素水解酶能水解此糖苷键，使其变为纤维二糖和葡萄糖，水解后的糖类同刚果红染料形成红色的沉淀，颜色浓郁，厚重，所以此水解圈在菌落生长过程中清晰可见，不易发生错误识别。这为筛选高效纤维素分解菌株提供了快速而方便的方法，减少了工作量和筛选的盲目性。4.滤纸失重率分析滤纸是木材加工造纸的最终产品之一，植物木质部含有大量纤维素、半纤维素和木质素，在造纸过程中除去了半纤维素和木质素，滤纸是由纤维素构成的，而且是一种天然的纤维素。纤维索是由葡萄糖分子以B1，4糖苷键连接而成，因此本试验用滤纸作为纤维素提供碳源，虽然需要较长的时间才能有结果，但能准确反映分离菌对纤维素的降解能力。滤纸片在加入纤维素酶溶液