羊膜中生物活性物质的研究进展.doc

羊膜中生物活性物质的研究进展 Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400012, China Ke Hu. Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400012, China. Received: 2004-05-09 Amniotic membrane transplantation can promote corneal epithelium growth, reduce inflammation, vascularization and scarring, which have been proved in many researches. But its biological principle has not been understood completely. Recently there are more basic researches on amniotic membrane. Many active substances in amniotic membrane have been detected. In this review, we classified active substance according to its character and function: basement, growth factor and enzyme. Then we introduced their biological characteristics, focusing on the most recent developments of relationship between them. KEYWORDS: growth factor; amniotic membrane; enzymeHu K, Zhao M. Laminins and eye diseases. Int J Ophthalmol , 2004;4(4):摘要羊膜移植促进角膜上皮化，抑制炎症和新生血管,减轻纤维化的作用在很多研究中得到证实,但有关这些作用的生物学基础尚不完全清楚。近年来有关羊膜的基础研究逐渐增多，现已有数十种生物活性物质从羊膜中检出。本文将羊膜内生物活性成分按性状和作用分为基质成分、生长因子和酶类并对其相互关系及近年来的研究进展作简要综述。关键词：生长因子；羊膜；酶胡柯,赵敏.羊膜中生物活性物质的研究进展.国际眼科杂志,2004;4(4):685-689引言：自1995年Kim等1利用人羊膜移植重建兔眼表获得成功以来羊膜移植在眼科得到快速发展。1997年Ma等2开始从分子生物学角度对羊膜移植的可行性进行了研究，从分子水平阐述了羊膜的生物学特性。羊膜促进角膜上皮化，抑制炎症和新生血管，减轻纤维化的作用在很多研究中得到证实。但有关这些作用的生物学基础尚不完全清楚，近年来有关羊膜的基础研究逐渐增多，现已有数十种生物活性物质从羊膜中检出。根据羊膜内生物活性成分研究现状按性状和作用将其分为3大类：基质成分、生长因子和酶类。1基质1.1胶原正常人眼表面由角膜、角膜缘及结膜上皮覆盖，各自有独特的分化表型，共同维持眼表的完整性。眼表上皮细胞的正常增生和分化有赖于上皮下正常基底膜的存在。基底膜主要由型胶原、型胶原和层粘连蛋白组成，可以促进上皮细胞移行和分化，增强基底上皮细胞粘附，防止上皮细胞凋亡。羊膜内同样含有IV型胶原、型胶原、整合素、板层体等3多种成分。Fukuda等4用间接免疫荧光检验出羊膜和结膜、角膜内型胶原是完全一样的，其差别仅在于角膜内含IV型胶原为5型，而羊膜和结膜为2型。羊膜和眼表上皮基底层成分相近，羊膜移植可看作是“底物移植”。通过羊膜移植，为病变组织提供健康的上皮下基质环境，使上皮组织能正常生长和粘附。1.2层粘连蛋白层粘连蛋白(laminin，LN)是由不同的蛋白质分子组成的一个蛋白质家族，是细胞外基质(ECM)中的非胶原糖蛋白。由Timpl等于1979年首次从鼠EHS肉瘤中发现并命名。它广泛分布于基底膜的透明层，紧贴细胞基底部，与IV型胶原结合形成基底膜的骨架，影响细胞的粘附、运动，调节细胞的生长和分化。羊膜基底膜厚而连续，LN作为羊膜基底膜特异和主要的蛋白组成成分，具有与型胶原、硫酸乙酰肝素等分子结合的部位，同时还可与上皮细胞结合，触发细胞内的信号转导，促进它们粘附在型胶原上并铺展开，从而促进细胞移行与增殖。Fukuda研究发现羊膜和结膜、角膜内及型层粘连蛋白是完全相同。国内的研究发现，人新鲜羊膜和结膜的基底膜上均有共同的LN的阳性反应，其中的LN表达强于结膜5，为羊膜移植时羊膜的基底膜可替代病变受损的结膜基底膜提供了理论依据。羊膜移植重建结膜的作用中，LN可为结膜上皮细胞提供良好的支架，作为配体分子，与邻近的结膜上皮细胞表面不同类型的受体结合，作为结膜再生的诱导物。吴静等6的研究结果证实，LN对离体培养的角膜上皮细胞的凋亡有保护作用。长期不愈的角膜上皮缺损都伴有角膜基底膜的异常及缺失。基底膜中的LN除了促进细胞粘附的重要功能外，它的成分及空间结构决定着角膜上皮的分裂、增殖及分化。这种作用可能参与了羊膜移植重建角膜的机制。2生长因子目前已在羊膜中发现多种生长因子，如EGF，KGF，HGF，bFGF，TGF-(，TGF-1，-2，-3等及其相应的mRNA。这些因子在新鲜及保存羊膜中均被检出，说明羊膜基质及羊膜上皮细胞均能产生这些因子7。2.1表皮生长因子表皮生长因子( epidermal growth factor，EGF)是美国学者Cohen1962年于小鼠颌下腺中首先发现的一种多肽类细胞激素，由53个氨基酸组成， 分子量为6ku。EGFR广泛分布于人角膜、结膜，其上皮细胞中含有高度亲和及低度亲和2种受体，EGF与受体结合后被活化并传导细胞内信号，这依赖于PTK活性，EGF激活这种酶活性发挥生物学作用8，它可通过DNA，RNA及蛋白质合成而促进细胞增殖与角膜上皮化。Singh等1987年首先将EGF用于角膜碱烧伤的治疗，实验结果显示治疗组创面完全愈合，对照组角膜中央上皮未修复。EGF在羊膜组织中的存在可能是羊膜移植术后促进眼表上皮迅速修复的原因之一。Koizumi等7用ELISA法测得保存羊膜中EGF的含量与正常角膜组织相似为0.1ng/g，而新鲜羊膜中EGF为1.0ng/g，其浓度是正常角膜组织的10倍，提示新鲜羊膜移植比保存羊膜在促进眼表上皮修复方面的优越性，这与许多学者的研究结果一致。EGF 是哺乳动物眼中最强的细胞因子之一， 能刺激机体内多种类型组织细胞的分裂和增生，在相同条件下刺激角膜、结膜上皮细胞增殖的能力是KGF，HGF的10倍9。EGF除了可以促进表皮细胞增殖分化外对角膜成纤维细胞的生长也有促进作用，可以促进胶原的沉积，但这一作用有明显的浓度依赖性，故该结果与羊膜抑制纤维化的结果并不矛盾，说明细胞因子间有复杂的网络结构，其具体机制还有待进一步研究。2.2角质细胞生长因子角质细胞生长因子(keratinocyte grow th factor，KGF)是一条具有163个氨基酸残基的单链多肽，被证实有促进上皮来源细胞增生的作用。实验表明，外源性KGF通过与靶细胞膜上的特异受体结合而发挥其生物学效应。并且认为KGF 通过旁分泌的机制，明显地促进了兔的角膜上皮细胞分裂、增殖，但不促进成纤维细胞的增殖，KGF在1100g/g浓度有明显促进人角膜上皮细胞DNA合成，促进细胞增生的作用，呈剂量依赖性，即随着KGF 浓度增高，促细胞增生作用增强10。在人新鲜羊膜中KGF的浓度显著高于这一有效值，可以部分解释羊膜的促眼表上皮修复作用。由于细胞因子复杂的网络作用，目前对KGF因子在活体眼表上皮的作用还有待进一步研究。2.3肝细胞生长因子肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)是一种生物作用尚未完全明了的多向性因子，能刺激各种靶细胞的生长，包括肝细胞、上皮细胞、内皮细胞、角质化细胞和造血细胞。对视网膜色素上皮细胞除具有促进其增殖的能力外还可以重塑视网膜结构，但其作用的发挥存在剂量依赖性。HGF另一重要作用是增加细胞的能动性，有利于眼表上皮修复。它能改变细胞旁连接阻力，使被动离子流经上皮的阻力降低，通过影响上皮细胞移行速度和延伸反应加快创面闭合11。Koizumi测得新鲜羊膜HGF浓度为44.7ng/g较正常角膜组织中的9.4ng/g显著为高7。高浓度的HGF提示了在羊膜移植中促进修复的重要作用。2.4转化生长因子转化生长因子(transforming growth factor，TGF)分为2大类：TGF-和TGF-。TGF-与EGF有40%的同源性。TGF-的受体与EGF 受体相同，两者间有相互竞争效应，但TGF- 与受体的亲和力只有EGF的55 %。TGF-可刺激细胞合成DNA，诱导上皮细胞形成单层集落，促进组织修复。在羊膜组织中TGF-的含量较正常角膜组织低，仅为0.7ng/g。对角膜上皮细胞的作用，目前作为一种反映角膜上皮细胞健康状态的指标因子，在移植中所起作用的大小还需要进一步实验证明，TGF-是由112个氨基酸残基组成的以多肽为单位，通过二硫键相连的二聚体分子。TGF-至少有5个亚型，其中TGF-1、2、3存在于哺乳动物中。在人羊膜内仅检出TGF-1、2，其中以TGF-1为主，但其浓度均较正常角膜组织中为低。TGF-本身对角膜上皮细胞的移行没有影响，却能抑制EGF对角膜上皮细胞移行的刺激作用，提示TGF-可能在角膜上皮细胞的愈合过程中起修饰作用。这种机制可能是通过调节基因egr21，c2fos，c2myc表达的数量实现的。提示局部存在的TGF-可能有避免过度增殖的作用12。大量临床和实验室研究表明羊膜可通过有效地抑制TGF-信号系统的表达，抑制肌纤维细胞分化，从而抑制瘢痕形成。其在创面愈合过程中抑制纤维增生，疤痕形成的作用是所有生长因子中最强的，Tseng等学者证实:当羊膜基质与眼表的成纤维细胞共同培养时，TGF-1、2、和TGF-，和型受体、以及整合素和肌动蛋白的表达均明显降低，从而使由TGF-通路介导的肌成纤维细胞分化受到抑制，起到抗瘢痕形成的作用13。由此我们推测或许羊膜移植抑制纤维化的作用主要依赖于受体TGF表达的减低而与羊膜自身低浓度的TGF关系不大。2.5碱性成纤维细胞生长因子 碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）是哺乳动物和人体组织中存在的一种微量蛋白质，能诱导神经外胚层和中胚层来源的细胞增殖与分化，其分子量约为16ku。实验研究已证实，它能有效地刺激体外培养的动物及人的眼表及视网膜色素细胞的增殖14。与EGF不同bFGF主要是促进基质成纤维细胞的增殖、移行和分化，其对术后伤口愈合的影响持续时间较长，贯穿于后伤口愈合的全过程。Faktorovich等15报道在兔角膜行PTK术后，检测到角膜中bFGF明显升高。Adamis等通过实验发现在兔没有角膜上皮细胞受损的Bowman膜中无法检测到bFGF，而在角膜上皮细胞受损的兔Bowman膜中可以检测到bFGF16。提示：bFGF 可能在角膜上皮受损后，由上皮细胞释放。羊膜内bFGF主要存在于羊膜上皮细胞中，羊膜基质中所含bFGF极其微量，为5.6ng/g仅为正常角膜组织的一半。BFGF是否有剂量依赖性还不清楚，羊膜中bFGF在移植中是否起作用以及羊膜组织本身是否有促进受体细胞表达bFGF的作用还需进一步研究。3酶类3.1基质金属蛋白酶及金属蛋白酶组织抑制因子基质金属蛋白酶（MMP）是由多种细胞产生的一组由钙离子激活的含锌离子的内肽酶家族，具有高度同源性，几乎能降解细胞外基质的所有成分，为新细胞的生长提供空间。金属蛋白酶组织抑制因子（TIMP）是一种生物大分子物质，可促进成纤维细胞增生及胶原合成，致细胞外基质沉积并抑制其降解。现已发现4种，分别命名为TIMP-1，TIMP-2，TIMP-3，TIMP-417。TIMP为MMP的特异性抑制剂，两者相互作用、相互抗衡，两者间的相互作用在抗新生血管化和间质纤维化过程中发挥重要作用。Hao等18通过RT-PCR已分别从羊膜上皮细胞及基质中检出所有4种TIMP，其对眼表组织内的MMP的抑制作用可以部分解释羊膜移植后的抗纤维化和抗新生血管化的作用。Yam等19将角膜缘细胞于培养传统培养基和保存羊膜上，并分别测定其分泌的活性物质发现EGF的表达没有显著性，而羊膜上的TIMP的表达增高，TGF-1，TGF-2及EGF受体的表达减低。Di Girolamo等20将角膜缘细胞用TIMP-1的抗抗体孵育同样发现EGF受体的表达减少，提示基质金属蛋白酶可能通过EGF受体信号旁路来影响角膜缘上皮细胞增殖。TIMP-1可以通过对促进EGF受体的表达来增加并维持EGF的作用。但羊膜如何促进TIMP的表达增加，以及羊膜自身所含TIMP在移植中的作用目前还不清楚。在兔眼烧伤模型中行羊膜移植组MMP-2和MMP-9的表达较对照组显著增高21。鼠眼烧伤后新生血管模型中MMP-2为逐渐增加至4d达高峰，MMP-9在1d就达到高峰，然后逐渐下降，其水平与炎性细胞浸润水平平行。TIMP从伤后开始就有增加，但TIMP-2的表达比较平稳，TIMP-1的表达更容易被诱导22。TIMP和MMP都参加了外伤后眼表上皮和基质的修复。羊膜移植后抑制新生血管和纤维化是否与MMP提前达高峰有关，由于TIMP和MMP的紧密关系，提前出现的MMP是否可以更多的诱导TIMP的产生并对后期疤痕和新生血管的减少起作用尚需进一步研究。3.2其他生物活性酶羊膜的抗炎作用对移植的成功有着重要的影响。羊膜中含有各种蛋白酶的抑制因子，已查明的有1-抗胰蛋白酶、2-巨球蛋白、2-抗糜蛋白酶等，这些因子通过抑制相应的蛋白酶而发挥抗炎作用。陈家祺等通过比较新鲜羊膜和保存羊膜对多形核白细胞凋亡的影响，发现2种羊膜均可促进多形核白细胞的凋亡，进而影响其功能的变化，从而减轻炎症和阻止眼表面基质的溶解23。新鲜羊膜比保存羊膜更能促进其凋亡是因为新鲜羊膜中促进PMN凋亡的因子浓度或种类比保存羊膜多，且这些成分主要表达于羊膜上皮细胞中，提示其可以发挥比保存羊膜更加强大的效果。羊膜的抗原性很低，但在同种异体移植中同样存在免疫排斥反应。Ueta等24用细胞内荧光标记的C57BL/6鼠的淋巴结细胞和DBA/2的脾细胞一起分别培养于有羊膜的基质和对照组基质中，再用荧光激活细胞术（FACS）测定DBA/2的T淋巴细胞的反应率，发现反应羊膜组CD4的数量明显减少，ELISA测得IL-2，IL-6，IL-10和IFN的表达明显受抑。这一结果表明羊膜对T淋巴细胞反应有明显的抑制作用，虽具体机制还不清楚，但这对同种异体羊膜移植的成功有重要的作用3.3神经营养因子研究表明羊膜上皮还可以合成神经生长因子如脑源性神经生长因子（BDNF）、神经生长因子（NGF）等，可释放乙酰胆碱、儿茶酚胺等神经递质25。这些神经营养因子和递质或许可以刺激和促进受伤角膜中的残存三叉神经末梢得以再生，进而影响角膜细胞的代谢活性，如减少合成胶原酶和基质金属蛋白酶等。Uchida等26的研究提示羊膜可能产生某种未知的有很强神经保护作用的因子，这方面的改变尚待进一步的研究来确实。Touhami等27的研究发现阻断神经因子（NGF）信号系统会抑制人上皮细胞在羊膜上的增殖，支持以前NGF在上皮细胞增殖中重要作用的观点，研究表明神经营养性角膜溃疡与角膜缘干细胞缺乏有关，但羊膜移植治疗此类疾病是否有促进神经修复及干细胞的生存还有待进一步研究。4结语        羊膜中生物活性物质种类繁多，一些可能还未被查明，已知活性成分的作用也不完全清楚，而有关这些成分间相互作用的研究还未开展。新鲜羊膜和保存羊膜在移植中的作用效果目前不同学者的观点也不太一致，同时也有学者提出或许羊膜在移植中仅起到基底膜的作用，活性物质并无太大作用。总之，人们对羊膜的基础研究才刚刚开始，羊膜移植仅仅是昙花一现，还是有更广阔的前景需要进一步对生物活性物质功能的研究来回答。参考文献1 Kim JC, Tseng SCG. Transplantation of preserved human amniotic membrane for surface reconstruction in severely damaged rabbit corneas. Cornea , 1995;14:4372 Ma X. Association for Research in Vision and Ophthalmology 1997 annual meeting. Invest Ophthalmol Vis Sci ,1997;38(4):5123 Kim JC. Transplantation of preserved human amniotic membrane for surface reconstruction in severely damaged rabbit corneas. Cornea , 1995;14:4734 Fukuda K, Chikama T. Differential distribution of subchains of the basement membrane components type IV collagen and laminin among the amniotic membrane, cornea, and conjunctiva. Cornea , 1999;18(1):73-795柯碧莲,张皙,邱孝芝,许讯,胡红惠.层粘连蛋白IV型胶原在人羊膜结膜基底膜分布的免疫组织化学研究.眼科新进展,2002;6:377-3796吴静,徐锦堂.层粘连蛋白对体外角膜上皮细胞凋亡的保护.眼科研究,2000;2:112-1137 Koizumi NJ, Inatomi TJ. Growth factor mRNA and protein in preserved human amniotic membrane. Curr Eye Res , 2000;20(3):173-1778 Fantl WJ. Signalling by receptor tyrosine kinases. Annu Rev Biochem ,1993;62:4539 Honma Y, Nishida K, Sotozono C. Effect of transforming growth factor-beta1 and -beta 2 on in vitro rabbit corneal epithelial cell proliferation promoted by epidermal growth factor, keratinocyte growth factor, or hepatocyte growth factor. Exp Eye Res , 1997;65:391-39610钟兴武,龚向明.角质细胞生长因子促人角膜上皮细胞生长的研究.眼科研究,1998;16(4):245-24711 Miura Y. Hepatocyte growth factor stimulates proliferation and migration during wound healing of retinal pigment epithelial cells in vitro. Jpn J Ophthalmol , 2003;47(3):268-27512 use FE. Transforming growth factors beta 1 and 2 inhibit proliferation of limbus and corneal epithelium. Ophthalmologe , 1994;91(5):617-62313 Li DQ, Ma X. Suppression of transforming growth factor-beta isoforms, TGF-beta receptor type II, and myofibroblast differentiation in cultured human corneal and limbal fibroblasts by amniotic membrane matrix. J Cell Physiol , 1999;179:325-33514周浩,褚仁远,周行涛,戴锦晖.体内实验观察bFGF对视网膜色素上皮细胞再生的促进作用.眼科新进展,2003;23(2):97-9915 Faktorovich EG. Growth factor expression in corneal wound healing after excimer laser keratectomy. Cornea ,1999;18(5):58016 Adamis AP. In situ injury-induced release of basic-fibroblast growth factor from corneal epithelial cells. Am Jpathol , 1991;139(5):96117 Baker AH, Zaltsman AB, George SL. Divergent effects of tissue inhibitor of metalloproteinase-1, -2, or -3 overexpression on rat vascular smooth muscle cell invasion, proliferation, and death in vitro. TIMP-3 promotes apoptosis. J Clin Invest , 1998;101(6):18 Hao Y, Ma DH. Identification of antiangiogenic and antiinflammatory proteins in human amniotic membrane. Cornea , 2000;19(3):348-35219 Hin-Fai Y. Growth factor changes in ex vivo expansion of human limbal epithelial cells on human amniotic membrane. Cornea , 2002;21:101-10520 Girolamo N, Wakefield D, Coroneo MT. Differential expression of matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors at the advancing pterygium head. Invest Ophthalmol Vis Sci , 2000;41(13):