液相色谱.ppt.ppt

高效液相色谱highperformanceliqiudchromatographyhplc hplc是以液体作为流动相的一种色谱法 高效液相色谱法 hplc 是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术 随着不断改进与发展 目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段 它是在经典液相色谱基础上 引入了气相色谱的理论 在技术上采用了高压泵 高效固定相和高灵敏度检测器 1 1概述 一 液相色谱的特点 分离效率高应用范围宽分析速度快样品用量少灵敏度高分离和测定一次完成 自动化程度高适用于高沸点 热不稳定有机物及具有生物活性的物质的分离测定可用于制备缺点 设备及实验费用高对某些体系分离效率不高 高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较 三 hplc与gc的比较分析对象及范围 gc分析只限于气体和低沸点的稳定化合物 而这些物质只点有机物总数的20 hplc可以分析高沸点 高分子量的稳定或不稳定化合物 这类物质占有机物总数的80 流动相的选择 gc采用的流动相中为有限的几种 惰性 气体 只起运载作用 对组分作用小 hplc采用的流动相为液体或各种液体的混合 可供选择的机会多 它除了起运载作用外 还可与组分作用 并与固定相对组分的作用产生竞争 即流动相对分离的贡献很大 可通过溶剂来控制和改进分离 操作温度 gc需高温 hplc通常在室温下进行 结论 从色谱分析的发展来看 hplc比gc更为有用 更具发展前途 3 应用由于hplc分离分析的高灵敏度 定量的准确性 适于非挥发性和热不稳定组分的分析 因此 在工业 科学研究 尤其是在生物学和医学等方面应用极为广泛 如氨基酸 蛋白质 核酸 烃 碳水化合物 药品 多糖 高聚物 农药 抗生素 胆固醇 金属有机物等分析 大多是通过hplc来完成的 hplc仪器包括 高压输液装置 进样系统 分离系统 检测系统 此外还配有梯度淋洗 自动进样和数据处理装置 第二节高效液相色谱仪 hplc仪器详解 高压输液系统1 储液器 1 2l的玻璃瓶 配有溶剂过滤器 ni合金 其孔很小 约2 m 可防止颗粒物进入泵内 2 脱气 超声波脱气或真空脱气 溶剂通过脱气器中的脱气膜 相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去 气泡会影响检测 3 高压泵 对输液泵的要求 密封性好 输液流量稳定无脉动 可调范围宽 耐腐蚀 输液泵种类 恒压型和恒流型 恒压泵 类似于风箱 可迅速获得高压 适于柱的匀浆填充 但因泵腔体积大 在往复推动时 会引起脉动 且输出流量随色谱系统阻力 主要是柱填充物 变化而变化 现已较少使用 恒流型 溶剂流量恒定 与柱填充情况无关 使用较多 有机械注射式和机械往复式两种 应用最多的是机械往复式恒流泵 每分钟往复25 100次 因此脉动小 对流量变化敏感的检测器也会有噪声干扰 此时可连接一脉动阻尼器 4 梯度淋洗装置 外梯度 利用两台高压输液泵 将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室 混合后进入色谱柱 内梯度 一台高压泵 通过比例调节阀 将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合 2 进样系统与gc相比 hplc柱要短得多 因此由于柱本身所产生的峰形展宽相对要小些 即hplc的展宽多因一些柱外因素引起 这些因素包括 进样系统 连接管道及检测器的死体积 进样装置包括两种 1 隔膜注射进样 使用微量注射器进样 装置简单 死体积小 但进样量小且重现性差 2 高压进样阀 目前最常用的为六通阀 由于进样量可由样品管控制 因此进样准确 重复性好 如图 3 色谱柱 色谱柱是实现分离的核心部件 要求柱效高 柱容量大和性能稳定 柱性能与柱结构 填料特性 填充质量和使用条件有关 色谱填料 经过制备处理后 用于填充色谱柱的物质颗粒 通常是5 10mm粒径的球形颗粒 色谱柱管 内部抛光的不锈钢管 典型的液相色谱分析柱尺寸是内径4 6mm 长250mm 色谱柱 也称固定相 是将色谱填料填充到色谱柱管中所构成的 4 检测器液相色谱检测器包括紫外吸收 荧光发射 示差折光和安培检测器等 1 紫外检测器和光电二极管阵列其检测原理和uv vis方法一样 只是此时所采用的吸收池为微量吸收池 通常其光程为2 10mm 体积约为1 10 l hplc分析中 约有80 的物质可以在254nm或280nm处产生紫外吸收 因此该类检测器应用很广 在选择测量波长时注意 溶剂必须能让所选择的光透过 即所选波长不能小于溶剂的最低使用波长 光电倍增管 快速扫描 光电二极管阵列 pda 检测所获得的三维色谱 光谱图 光电二极管阵列检测器 2 示差折光检测器原理 利用两束相同角度的光照射溶剂相和样品 溶剂相 利用二者对光的折射率不同 其中一束 通常是通过样品 溶剂相 光因为发生偏转造成两束光的强度差发生变化 将此差示信号放大并记录 该信号代表样品的浓度 为通用型检测器 灵敏度为10 7g ml 但对温度变化敏感 且不适于梯度淋洗 偏转式 反射式和干涉型三种 3 电导检测器电导检测器主要用于离子色谱的检测 其原理是基于待测物在一些介质中电离后所产生的电导 电阻的倒数 变化来测量电离物质的含量 电导检测器的主要部件是电导池 其响应受温度影响较大 因此需要将电导池置于恒温箱中 另外 当ph 7时 该检测器不够灵敏 其它检测器还包括 ms ir evaporativelightscatteringdetector 光散射 等 第三节hplc固定相和流动相简介一 固定相hplc通常是按照固定相载体或固定液的不同来分类的 1 按承受压力分刚性固体 sio2为基质 耐压为7 0 108 1 0 109pa 可制成直径 形状和孔隙深度不同的颗粒 主要用于吸附 分配和键合色谱 硬胶 以聚合物为基质 常用苯乙烯与二乙烯苯交联而成 耐压上限为3 5 108pa 主要用于离子交换和尺寸排阻色谱 2 按孔隙深度分表面多孔型 以实心玻璃珠为基体 在基体表面覆盖一层多孔活性材料 如硅胶 氧化铝 离子交换剂 分子筛 聚酰胺等 表面多孔型固定相的颗粒大 易装柱 多孔层厚度小且孔浅 渗透性好 出峰快 但交换容量小 适于常规分离分析 全多孔型 全部由硅胶或氧化铝微粒聚集而成 因颗粒极细 因而孔径小 传质快 柱效高 特别适于复杂混合物的分离 与gc流动相不同 hplc流动相为溶剂 它既有运载作用 又和固定相一样 参予对组分的竞争 因此溶剂的选择对分离十分重要 1 理想的溶剂应有下列特性 1 对待测物具一定极性和良好的选择性 2 使用uv检测器时 溶剂截止波长要小于测量波长 为什么 使用折光指数检测器时 溶剂的折光率要与待测物的折光率有较大差别 3 高纯度 否则基线不稳或产生杂峰 同时可使截止波长增加 4 化学稳定性好 5 适宜的粘度 粘度过高 柱压增加 过低 易产生气泡 6 毒性小 安全性好 二 液相色谱的流动相 2 流动相特性 1 液相色谱的流动相又称为 淋洗液 洗脱剂 流动相组成改变 极性改变 可显著改变组分分离状况 2 亲水性固定液常采用疏水性流动相 即流动相的极性小于固定相的极性 称为正相液液色谱法 极性柱也称正相柱 3 若流动相的极性大于固定液的极性 则称为反相液液色谱 非极性柱也称为反相柱 组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反 3 流动相类别 按流动相组成分 单组分和多组分 按极性分 极性 弱极性 非极性 按使用方式分 固定组成淋洗和梯度淋洗 常用溶剂 己烷 四氯化碳 甲苯 乙酸乙酯 乙醇 乙腈 水 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性 以改进分离或调整出峰时间 4 流动相选择 在选择溶剂时 溶剂的极性是选择的重要依据 采用正相液 液分配色谱分离时 首先选择中等极性溶剂 若组分的保留时间太短 降低溶剂极性 反之增加 也可在低极性溶剂中 逐渐增加其中的极性溶剂 使保留时间缩短 常用溶剂的极性顺序 水 最大 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷 氯仿 溴乙烷 苯 四氯化碳 二硫化碳 环己烷 己烷 煤油 最小 5 选择流动相时应注意的几个问题 1 尽量使用高纯度试剂作流动相 防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加 2 避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子 如使固定液溶解流失 酸性溶剂破坏氧化铝固定相等 3 试样在流动相中应有适宜的溶解度 防止产生沉淀并在柱中沉积 4 流动相同时还应满足检测器的要求 当使用紫外检测器时 流动相不应有紫外吸收 三 化学键合相色谱法 cbpc 采用化学键合相的液相色谱称为化学键合相色谱法 简称键合相色谱 由于键合固定相非常稳定 在使用中不易流失 适用于梯度淋洗 特别适用于分离容量因子k值范围宽的样品 由于键合到载体表面的官能团可以是各种极性的 因此它适用于种类繁多样品的分离 1 键合固定相类型用来制备键合固定相的载体 几乎都用硅胶 利用硅胶表面的硅醇基 si一oh 与有机物可成键 即可得到各种性能的固定相 一般可分三类 1 疏水基团如不同链长的烷烃 c8和c18 和苯基等 2 极性基团如氨丙基 氰乙基 醚和醇等 3 离子交换基团如作为阴离子交换基团的胺基 季铵盐 作为阳离子交换基团的磺酸等 2 正相和反相键合色谱法 正相色谱法采用极性固定相 如聚乙二醇 氨基与腈基键合相 流动相为相对非极性的疏水性溶剂 烷烃类如正已烷 环已烷 常加入乙醇 异丙醇 四氢呋喃 三氯甲烷等以调节组分的保留时间 常用于分离中等极性和极性较强的化合物 如酚类 胺类 羰基类及氨基酸类等 反相色谱法一般用非极性固定相 如c18 c8 流动相为水或缓冲液 常加入甲醇 乙腈 异丙醇 丙酮 四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间 适用于分离非极性和极性较弱的化合物 rpc在现代液相色谱中应用最为广泛 据统计 它占整个hplc应用的80 左右 随着柱填料的快速发展 反相色谱法的应用范围逐渐扩大 现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析 为控制样品在分析过程的解离 常用缓冲液控制流动相的ph值 但需要注意的是 c18和c8使用的ph值通常为2 5 7 5 2 8 太高的ph值会使硅胶溶解 太低的ph值会使键合的烷基脱落 有报告新商品柱可在ph1 5 10范围操作 离子交换色谱法固定相是离子交换树脂 常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架 在表面未端芳环上接上羧基 磺酸基 称阳离子交换树脂 或季氨基 阴离子交换树脂 被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换 根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离 缓冲液常用作离子交换色谱的流动相 被分离组分在离子交换柱中的保留时间除跟组分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外 它还受流动相的ph值和离子强度影响 ph值可改变化合物的解离程度 进而影响其与固定相的作用 流动相的盐浓度大 则离子强度高 不利于样品的解离 导致样品较快流出 离子交换色谱法主要用于分析有机酸 氨基酸 多肽及核酸 正相色谱法与反相色谱法比较表 从上表可看出 当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线 如氨基键合固定相 离子色谱法 ic 由于离子交换色谱法在无机离子的分析和应用受到限制 因而派生出离子色谱法为了解决这一问题 1975年small等人提出一种能同时测定多种无机和有机离子的新技术 他们在离子交换分离柱后加一根抑制柱 抑制柱中装填与分离柱电荷相反的离子交换树脂 通过分离柱后的样品再经过抑制柱 使具有高背景电导的流动相转变成低背景电导的流动相 从而用电导检测器可直接检测各种离子的含量 这种色谱技术称为离子色谱 若样品为阳离子 用无机酸作流动相 抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换剂 当试样经阳离子交换剂的分离往后 随流动相进入抑制柱 在抑制柱中发生两个重要反应 r oh h cl r cl十h2or 一oh m cl m oh r cl 由反应可见 经抑制柱后 一方面将大量酸转变为电导很小的水 消除了流动相本底电导的影响 同时 又将样品阳离子m 转变成相应的碱 由于oh 离子的淌度为cl 离子的2 6倍 提高了所测阳离子电导的检测灵敏度 对于阴离子样品也有相似的作用机理 该法的不足之处在于 抑制柱要定期再生 谱峰在经过抑制柱后会展宽 降低分离度 因此有人提出了使用电导率很低的溶液 如苯甲酸盐稀溶液 作流动相 在分离柱后加一个抑制柱的离子色谱亦称为抑制型离子色谱或称双柱离子色谱 由于抑制柱要定期再生 而且谱带在通过抑制柱后会加宽 降低了分离度 后来 frits等人提出采用抑制柱的离子色谱体系 而采用了电导率极低的溶液 例如1 10 4 5 10 4mol dm 3苯甲酸盐或邻苯二甲酸盐的稀溶液作流动相 称为非抑制型离子色谱或