荧光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的含量.doc

荧光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的含量实验目的1、学习荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的分析原理；2、掌握荧光分光光度计的操作技术和测定多维葡萄糖粉中维生素B2的方法。实验原理光源单色器吸收池 If=2.303I0bc单色器检测器维生素B2（又叫核黄素，VB2）是橘黄色无臭的针状结晶，其结构式为： 维生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。维生素B2溶液在430440 nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，荧光峰在535 nm。维生素B2在pH=67的溶液中荧光强度最大，在pH=11的碱性溶液中荧光消失，所以可以用荧光光度法测维生素B2的含量。多维葡萄糖中含有维生素B1、B2、C、D2及葡萄糖，其中维生素C和葡萄糖在水溶液中不发荧光，维生素B1本身无荧光，在碱性溶液中用铁氰化钾氧化后才产生荧光，维生素D2用二氯乙酸处理后才有荧光，他们都不干扰维生素B2的测定。维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素，光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多，故测维生素B2的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。试剂与仪器970CRT荧光光度计5 ml吸量管1只，2 ml吸量管1只， 50 ml容量瓶6只, 100 ml容量瓶1只10.0g/ml维生素B2标准溶液，冰乙酸， 多维葡萄糖粉试样.实验步骤（一）、970CRT荧光光度计基本操作：1. 打开氙灯，再打开主机，然后打开计算机启动工作站并初始化仪器，预热30min2. 仪器初始化完毕后，在工作界面上选择测量项目，设置适当的仪器参数：设置激发波长为440nm，发射波长为540 nm，灵敏度2，入射缝宽和出射缝宽均为10nm。3. 样品测定1）、标准系列溶液的配制及标准溶液荧光强度的测定： 在6个干净的50 ml容量瓶中，分别吸取0.50、1.00、1.50，2.00，2.50和3.00维生素B2标准溶液，各加入2.00 ml冰乙酸，稀释至刻度，摇匀。得到不同浓度的溶液分别是：0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6ug/ml的维生素B2溶液，从稀到浓测量系列标准溶液的荧光强度。2）、未知试样的测定:称取0.7481g多维葡萄糖粉试样,用少量水溶解后转入50 ml容量瓶中，加2.00 ml冰乙酸，稀释至刻度，摇匀。用测定标准系列时相同的条件，平行测量其荧光强度3次4、退出主程序，关闭计算机，先关主机，最后关氙灯。数据处理1. 用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线。荧光强度(I)浓度(g/ml)123平均值3.36703.38803.42503.39330.18.45508.49208.48608.47760.213.349013.439013.488013.42530.318.563018.641018.691018.63160.423.440023.438023.485023.45430.528.240028.305028.419028.32130.6 2、未知样品浓度的测定 根据待测液的荧光强度，从标准工作曲线上求得其浓度，计算出试样中含量。编号123平均值If25.43025.57725.55125.519C/ug.ml-10.5400.5430.5420.542维生素B2百分含量 =（0.542*50.00）/(0.7481*106)*100%=0.00362%注意事项1.使用970CRT时，要按照仪器使用规定使用，不可随意操作2.使用石英比色皿时，要注意勿用手直接触摸比色皿表面，因握住棱。思考题1. 试解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因?答：荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度，可成倍提高荧光强度。同时，提高仪器灵敏度，也可提高荧光光度法的灵敏度。而对于吸收光度法，无论是提高激发光强度提高仪器灵敏度还是提高仪器灵敏度，入射光和出射光同时增大，其灵敏度不变。因此，荧光光度法较吸收光度法灵敏度高2. 维生素B2在pH67时荧光最强，本实验为何在酸