Western+实验操作程序.doc

Western blot 实验操作程序一、储存液的配制：1. )1.5M Tris-HCl（PH8.8）：100mlTris 18.15g去离子水 50 ml缓慢加浓盐酸调PH至8.8（约4 ml），冷却至室温后再加去离子水至100 ml.2.) 0.5M Tris-HCl（PH6.8）：100ml Tris 6.05g去离子水 50 ml缓慢加浓盐酸调PH至6.8（约8ml），冷却至室温后再加去离子水至100 ml.3. )10%SDS（W/V）：100mlSDS 10g去离子水 100 ml溶解后，室温下保存。4.)50%（v/v）甘油：100ml100%甘油 50 ml去离子水 50 ml 混匀后，室温下保存。5. )1%溴酚蓝：10 ml溴酚蓝 100mg去离子水 10ml搅拌至完全溶解，经过滤后使用6. )丽春红S(Ponceau S)储存液：100 ml丽春红S 2g三氯乙酸 30g磺基水杨酸 30g去离子水 100ml混匀后，室温下保存。7. )10转膜液：1000 ml甘氨酸 90gTris 19.3g加去离子水至1000 ml，PH在8.3-8.4左右.二、工作液的配制：1. 组织（或细胞）裂解液：3 ml 或 5 ml 试剂初始浓度终浓度3 ml5 mlNaCl 1 mol/L0.1 mol/L300l500lTris-HCl1mol/L0.01mol/L 30l50lEDTA0.5mol/L0.001mol/L 6l 10lAprotinin1mg/ml 0.001mg/ml3l 5lPMSF 10mg/ml0.01mg/ml30l50lTritonX-100 3%1%1 ml1.6ml去离子水1.64ml2.8mlPMSF（苯甲基磺酰氟）：可抑制蛋白酶的降解作用，有较强的毒性，可严重损害呼吸道黏膜、眼睛及皮肤，使用时需戴手套操作。它在水溶液中不稳定，使用时需新鲜配制（可先配成10 mg/ml的储存液，需用异丙醇溶解）。Aprotinin（抑肽酶）：可抑制组织裂解后释放出的蛋白酶对蛋白质的降解作用。2. 5变性loading:10 ml1M Tris-HCl（PH6.8）0.6 ml60mM50%甘油5ml25%10%SDS2ml2%1%溴酚蓝1 ml0.1%去离子水0.9ml混匀，在4oC下可保存数月。3. 丙烯酰胺储存液（30%）：100 ml 丙烯酰胺 29 g 双丙烯酰胺 1g去离子水 100 ml丙烯酰胺和双丙烯酰胺单体均具有强神经毒性，其作用具有累加性，配制时必须戴手套，防止皮肤接触。搅拌至完全溶解，在4oC下可保存数月。4. 4分离胶缓冲液：100 ml2M Tris-HCl（PH6.8） 75 ml 1.5M10%SDS 4ml 0.4%去离子水 21ml 混匀后可在4oC下保存数月，配分离胶时使用，注意用时不需再稀释,直接用4的缓冲液即可5. 4堆积胶缓冲液: 100 ml1M Tris-HCl（PH6.8） 50 ml 0.5M10%SDS 4ml 0.4%去离子水 46ml 混匀后可在40C保存数月，配堆积胶时使用，注意用时不需再稀释,直接用4的缓冲液即可6. 10%过硫酸胺(APS)：5 ml过硫酸胺 0.5g去离子水 5ml分装后，保存于-200C7. 电泳缓冲液:1000 mlTris 3g 25 mM甘氨酸 14.4g 192 mMSDS 1g 0.1%加去离子水至1000 ml，PH在8.3左右。8. 考马斯亮蓝染色液: 1000 ml考马斯亮蓝R-250 1.0g甲醇 450 ml冰醋酸 100 ml去离子水 450 ml需过滤后使用，可用来染蛋白质.9. 考马斯亮蓝凝胶脱色液: 1000 ml甲醇 100 ml冰醋酸 100 ml去离子水 800 ml可使染色的凝胶脱色,以减低背景。10. 丽春红S工作液： 100 ml丽春红S储存液 10 ml去离子水 90 ml可用来染蛋白质.11. 1转移缓冲液： 1000 ml10转移缓冲液 100 ml甲醇 200 ml去离子水 700ml可回收利用三、操作步骤：1. 组织（或细胞）的裂解：取所需的组织，如：脑、脊髓或其他组织，操作时动作要快且最好在冰上进行。将其转移到已清洗干净并烘干后的匀浆器中，加裂解液进行匀浆（裂解液的量根据组织块的大小确定），匀浆时需将匀浆器置于碎冰块中，且匀浆时间不能太长（约3-5分钟，或匀浆器抽拉30-40次），抽拉时动作要慢，以减少气泡的产生。若要裂解细胞，所加的裂解液量不能太多，以免蛋白质浓度太低，不易检测。若取培养基收集蛋白质，则不须裂解2. 离心：先启动离心机预冷，将温度降至4，将裂解后的溶液转移至小管中，（根据溶液的量选取大小合适的小管），速度要快，以免蛋白质降解，将小管平衡好之后，放入离心机中离心，转速30005000转/分为宜，离心时间15分钟左右。3. 蛋白质的变性处理：将离心后的小管取出，吸取上清，转移至另一小管中，吸取时要小心，不要将沉淀吸出，向小管中按4：1的比例加变性loading ，将盖子盖好，用胶带缠紧，将小管插入到一塑料泡沫上，以防止小管沉底，放入沸水中变性，注意：小管中的液体不能太多，以免加热后管子爆开，可将盖子用胶带缠紧，须等水沸腾后将小管放入，不然会影响变性效果，变性时间为510分钟离心后立即变性，防止蛋白质的进一步降解。变性后的样品置于4oC，可多次使用。4.灌胶前的准备：用前须将灌胶用的玻璃板洗干净，烘干，操作时避免用手接触灌胶面，将两侧的隔条上涂抹一层薄薄的凡士林，不要涂得太宽，以免凡士林进入灌胶面，小心将两块玻璃板叠在一起，插入到橡胶框中，将长玻璃板向外倾斜放置，在其底部加10%的琼脂糖凝胶封底（用前将琼脂糖在微波炉中加热至融化，加热时间不能太长，以免沸腾太厉害，污染微波炉），加琼脂糖的目的是防止液体渗漏，待琼脂糖凝固后，将玻璃板及橡胶框轻轻置于电泳槽中，旋紧螺栓，也可再加琼脂糖封边封底，在两玻璃板之间加双蒸水，观察有无液体渗露，若有则需重新封底。5. 灌注分离胶：（根据我室的灌胶设备，配10ml即可）灌胶前需根据要检测的组织及蛋白质种类的不同，选用不同浓度的凝胶，常用浓度为10% 丙烯酰胺溶液（30.8%）3.4ml4分离胶缓冲液（PH8.8）2.5 ml去离子水4.1 ml10%过硫酸胺(APS)30ulTEMED5-8ul其中过硫酸胺提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基，而TEMED通过催化过硫酸胺形成自由基而加速丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合。灌胶之前在电泳槽上确定要灌的分离胶的最上液面到达的位置，即将梳子插入到两玻璃板之间，梳子下端下方1cm左右处即为分离胶的最上液面，将上述液体充分混匀后，快速加入到两玻璃板之间，加液体时可沿一侧壁加入，以免产生气泡，待分离胶加至所需液面水平时，停止加分离胶，向其中加去离子水，其作用一方面防止分离胶氧化，另一方面可将分离胶的液面压平。APS和TEMED的量不能太多，以免凝固太快，形成的凝胶不均匀，以30-45分钟凝固为宜。6. 灌堆积胶：4ml待分离胶完全凝固后，将水倒出，再向其中加堆积胶，其配方为：丙烯酰胺溶液（30.8%） 0.67ml4堆积胶缓冲液(PH6.8) 1 ml去离子水 2.3ml10%过硫酸胺(APS) 15ulTEMED 5ul堆积胶的作用为使分散的样品在进入分离胶之前聚集成一条细线，使起跑位置基本一致，待堆积胶灌至离最上方0.5cm时，插入梳子，再将液体加满，因堆积胶凝固后会有小部分回缩，需在其上方多加一些，以免形成的加样孔不够长，影响上样量，堆积胶凝固后，将梳子轻轻拔出，拔出时两侧用力要均匀，以免损伤加样孔，若两加样孔之间的凝胶条有倾斜，需将其轻轻扶直，最好将设备置于4oC过夜备用，因过夜后凝胶的聚合会更好一些，有利于跑胶。7. 电泳：将电泳槽中加入电泳缓冲液，电泳缓冲液的液面须高于凝胶的最上端，且注意电极的方向（长玻璃板侧对红面，电泳仪的电极与电泳槽的电极相互对应即可），将电源打开，观察电流的大小，若电泳缓冲液反复使用次数太多，电流太小，则需更换电泳缓冲液。之后将电源关闭，向加样孔中加入已变性的样品，根据蛋白质的浓度确定上样量，或预先将样品按不同的上样量加入到加样孔中，根据电泳后的条带确定上样量，若是细胞样品，或蛋白质的浓度太低，则需将样品浓缩。在胶的一侧加一marker，marker的用量约2-5ul，以确定蛋白质条带的分子量的大小，marker与样品之间最好隔一加样孔，以利于切割，电泳时，以小电流为好，我室的经验是电压调至100V，电流约5mA左右，同时需将电泳槽放入冷水中，因电泳时有热产生，会影响跑胶，导致中间的样品速度较快而两边的样品速度较慢，跑出的条带不在一条直线上，待溴酚蓝指示剂完全进入琼脂糖凝胶中，停止电泳。8. 考马斯亮蓝染色及脱色：将两玻璃板轻轻分开，使凝胶在一块玻璃板上，去掉分离胶两侧的琼脂糖及堆积胶，将凝胶小心从玻璃板上取下，置于考马斯亮蓝染色液中，过夜，次日将考马斯亮蓝染色液回收，将染色后的凝胶放入内有考马斯亮蓝脱色液的平皿中脱色，可在脱色摇床上摇动以加快脱色，中间换两次脱色液，待背景基本无色时即可，脱色时间不能太长，以免蛋白质条带颜色过浅，将凝胶取出，用保鲜膜包好，置于4oC冰箱中保存或照相。9. 转膜将海绵、滤纸和硝酸纤维素膜在转膜液中浸湿备用。摊开转膜夹，先根据需要转膜的凝胶大小确定滤纸及膜的大小，滤纸和膜应比凝胶稍小，将其中一海绵置于转膜夹黑面上方，其上放一层厚的滤纸或4层薄滤纸，将凝胶放在滤纸上，它的上方再放膜及滤纸，最上方放另一块海绵，将转膜夹夹好，注意：膜与凝胶之间不能有气泡，因有气泡的部位蛋白质不能转到膜上去，且凝胶两侧的海绵和滤纸不能接触，否则会产生短路，使转膜的效果差，将夹子放入转膜槽内，接通电源，注意电极的方向不能接反，转膜所需的电流为40mA，过夜或200mA左右，1.5-2小时。10. 丽春红染色：转膜后关闭电源，将膜小心取出，同时可将转膜后的凝胶放入考马斯亮蓝染色液中进一步染色，观察转膜的情况，将取出的膜用丽春红染色，染色几分钟即可，染色时间不宜太长，以看到清楚的条带为宜，用双蒸水漂洗膜，洗去丽春红。11. 封闭：将漂洗后的膜装入大小适中的塑料袋中，向其中加封闭液（3%BSA+5%脱脂奶粉，用0.1MPBS稀释），室温下1小时。12. 加一抗：将膜取出，置于另一塑料袋中，加一抗（利用含3%BSA+5%脱脂奶粉的封闭液稀释，稀释度根据所选用的抗体确定，一般为1：1000），用封口机将膜封好，4oC冰箱中过夜。注意将袋中的气泡排除干净。13. 洗一抗：取出膜，放在平皿中，用含0.1%Triton的PBS漂洗，室温下每次10分钟，漂洗三次。14. 加二抗：将膜放在另一塑料袋中，加偶联辣根过氧化物酶（HRP）的二抗（二抗的性质根据使用的一抗来确定，用含0.1%Triton的封闭液进行稀释，稀释度为1：2000-5000），排净气泡，将膜封好，室温下作用1-1.5小时。注意二抗的浓度不能太高，以免有较强的假阳性出现。15. 洗二抗：取出膜，放在平皿中，用含0.1%Triton的PBS漂洗，室温下每次15分钟，共漂洗三次。16. 显色（利用ECL光化学发光法试剂盒）：取ECL液中的1.2 ml A液+30ulB液混匀，作用5分钟，将膜从洗涤液中取出，吸干洗涤液，正面朝上，把ECL液均匀加在膜上作用5分钟左右，吸干ECL液，将膜用保鲜膜包好，入暗室操作。17. 曝光，显影，定影：打开压片夹，将膜放在一侧，其上方放置胶片，合好压片夹，作用几分钟到几十分钟，选用不同的曝光时间，取出胶片，进行显影，定影，将胶片在室温晾干即可。18. DAB法：除了用ECL光化学发光法进行显色，也可用常规的DAB法显色，其大体步骤为：封闭：将丽春红染色漂洗后的膜装入塑料袋中，加封闭液（3%BSA+5%脱脂奶粉，用0.1MPBS稀释），室温下1小时。加一抗：将膜置于另一塑料袋中，加一抗（用封闭液稀释，稀释度根据所选用的抗体确定，一般为1：1000），4oC冰箱中过夜。洗一抗：用含0.