蛋白质化学终极版(1)

第一章蛋白质化学 第一节蛋白质的概述第二节蛋白质的分子组成第三节肽键和肽第四节蛋白质的分子结构第五节蛋白质结构与功能的关系第六节蛋白质的理化性质第七节蛋白质的分离与鉴定 一 什么是蛋白质 蛋白质 Protein 是一类生物大分子 由一条或多条肽链构成 每条肽链都由一定数量的氨基酸按一定顺序以肽键连接形成 二 蛋白质的生物学重要性 1 蛋白质是生物体重要组成成分分布广 所有器官 组织都含有蛋白质 细胞的各个部分都含有蛋白质 含量高 蛋白质是细胞内最丰富的有机分子 占人体干重的45 某些组织含量更高 例如脾 肺及横纹肌等高达80 1 作为生物催化剂 酶 2 代谢调节作用3 免疫保护作用4 物质的转运和存储5 运动与支持作用6 参与细胞间信息传递 2 蛋白质具有重要的生物学功能 3 氧化供能 第二节蛋白质的分子组成 一 蛋白质的元素组成二 蛋白质的结构单位三 蛋白质的辅基 一 蛋白质的元素组成 C 50 H 7 O 23 N 16 S 0 3 Others P Cu Fe Zn Mn Co Se I 主要元素 通过样品含氮量计算蛋白质含量的公式 蛋白质含量 样品含氮量 6 25 N是蛋白质的特征性元素 蛋白质中氮的含量都相当接近 一般在15 17 平均为16 这是凯氏定氮法测定蛋白质含量的计算基础 式中6 25即16 的倒数 为1克N所代表的蛋白质的量 克 二 氨基酸的结构单位 蛋白质的结构单位为氨基酸自然界中的氨基酸有300余种用于合成蛋白质的20种氨基酸称为标准氨基酸 氨基酸的结构 氨基酸的结构碳原子编号 20种氨基酸的英文名称 缩写符号及分类如下 甘氨酸glycineGlyG5 97 丙氨酸alanineAlaA6 00 缬氨酸valineValV5 96 亮氨酸leucineLeuL5 98 异亮氨酸isoleucineIleI6 02 苯丙氨酸phenylalaninePheF5 48 脯氨酸prolineProP6 30 非极性疏水性氨基酸 目录 色氨酸tryptophanTrpW5 89 丝氨酸serineSerS5 68 酪氨酸tyrosineTyrY5 66 半胱氨酸cysteineCysC5 07 蛋氨酸methionineMetM5 74 天冬酰胺asparagineAsnN5 41 谷氨酰胺glutamineGlnQ5 65 苏氨酸threonineThrT5 60 2 极性中性氨基酸 目录 天冬氨酸asparticacidAspD2 97 谷氨酸glutamicacidGluE3 22 赖氨酸lysineLysK9 74 精氨酸arginineArgR10 76 组氨酸histidineHisH7 59 3 酸性氨基酸 4 碱性氨基酸 目录 蛋白质中常见氨基酸的结构 甘氨酸Glycine 脂肪族氨基酸 氨基乙酸 氨基酸的结构 脂肪族氨基酸 甘氨酸Glycine丙氨酸Alanine 氨基丙酸 氨基酸的结构 甘氨酸Glycine丙氨酸Alanine缬氨酸Valine 脂肪族氨基酸 氨基异戊酸 氨基酸的结构 甘氨酸Glycine丙氨酸Alanine缬氨酸Valine亮氨酸Leucine 脂肪族氨基酸 氨基异己酸 氨基酸的结构 甘氨酸Glycine丙氨酸Alanine缬氨酸Valine亮氨酸Leucine异亮氨酸Ileucine 脂肪族氨基酸 氨基 甲基戊酸 氨基酸的结构 甘氨酸Glycine丙氨酸Alanine缬氨酸Valine亮氨酸Leucine异亮氨酸Ileucine脯氨酸Proline甲硫氨酸Methionine 含硫氨基酸 氨基 甲硫基丁酸 氨基酸的结构 甘氨酸Glycine丙氨酸Alanine缬氨酸Valine亮氨酸Leucine异亮氨酸Ileucine脯氨酸Proline 亚氨基酸 吡咯烷基 羧酸 氨基酸的结构 甘氨酸Glycine丙氨酸Alanine缬氨酸Valine亮氨酸Leucine异亮氨酸Ileucine脯氨酸Proline甲硫氨酸Methionine半胱氨酸Cysteine 含硫氨基酸 氨基 巯基丙酸 氨基酸的结构 芳香族氨基酸 苯丙氨酸Phenylalanine 氨基 苯基丙酸 氨基酸的结构 芳香族氨基酸 苯丙氨酸Phenylalanine酪氨酸Tyrosine 氨基 对羟苯基丙酸 氨基酸的结构 芳香族氨基酸 苯丙氨酸Phenylalanine酪氨酸Tyrosine色氨酸TryptophanTrp 氨基 吲哚基丙酸 氨基酸的结构 碱性氨基酸 精氨酸Arginine 氨基 胍基戊酸 氨基酸的结构 碱性氨基酸 精氨酸Arginine赖氨酸Lysine 二氨基己酸 氨基酸的结构 碱性氨基酸 精氨酸Arginine赖氨酸Lysine组氨酸Histidine 氨基 咪唑基丙酸 氨基酸的结构 天冬氨酸Aspartate 酸性氨基酸 氨基丁二酸 氨基酸的结构 天冬氨酸Aspartate谷氨酸Glutamate 酸性氨基酸 氨基戊二酸 氨基酸的结构 丝氨酸Serine 含羟基氨基酸 氨基 羟基丙酸 氨基酸的结构 丝氨酸Serine苏氨酸Threonine 含羟基氨基酸 氨基 羟基丁酸 氨基酸的结构 天冬酰胺Asparagine 含酰胺氨基酸 氨基酸的结构 天冬酰胺Asparagine谷酰胺Glutamine 含酰胺氨基酸 R基团结构R基团的酸碱性人体内能否自己合成分解产物的进一步转化是否用于合成蛋白质 或有无遗传密码 R基团结构与极性 氨基酸的分类 习惯分类方法 芳香族氨基酸 Trp Tyr Phe含羟基氨基酸 Ser Thr Tyr含硫氨基酸 Cys Met杂环族氨基酸 His杂环族亚氨基酸 Pro支链氨基酸 Val Leu Ile 脂肪族芳香族杂环氨基酸 R基团结构 酸性氨基酸碱性氨基酸中性氨基酸 R基团的酸碱性 必需氨基酸非必需氨基酸 人体内能否自己合成 生糖氨基酸生酮氨基酸生糖兼生酮氨基酸 分解产物的进一步转化 标准 或编码 氨基酸非标准 或编码 氨基酸 是否用于合成蛋白质 或有无遗传密码 含非极性疏水R基团的氨基酸含极性不带电荷R基团的氨基酸含带正电荷R基团的氨基酸含带负电荷R基团的氨基酸芳香族R基氨基酸 R基团结构与极性 非极性疏水性氨基酸 2 极性中性氨基酸 3 碱性氨基酸 4 酸性氨基酸 5 芳香族R基氨基酸 6 N 甲基赖氨酸4 羟脯氨酸5 羟赖氨酸硒代半胱氨酸 羧基谷氨酸鸟氨酸瓜氨酸锁链素 非标准氨基酸 4 羟脯氨酸是脯氨酸的衍生物 存在于结缔组织纤维状蛋白 胶原蛋白中 5 羟赖氨酸是赖氨酸的衍生物 存在于结缔组织纤维状蛋白 胶原蛋白中 硒代半胱氨酸是丝氨酸的转化产物 目前只在少数几种蛋白质中发现此种氨基酸 羧基谷氨酸是谷氨酸的衍生物 存在于凝血蛋白 纤维蛋白原及其他一些具有结合钙功能的蛋白质中 鸟氨酸和瓜氨酸是精氨酸合成和鸟氨酸循环的关键中间物 鸟氨酸 瓜氨酸 锁链素由四个赖氨酸缩合形成 存在于弹性蛋白 非蛋白氨基酸 广泛存在于各种细胞和组织中 呈游离或结合态 但并不存在蛋白质中的一类氨基酸 大部分也是蛋白质氨基酸的衍生物 H2N CH2 CH2 COOHH2N CH2 CH2 CH2 COOH 丙氨酸 氨基丁酸 非蛋白氨基酸存在的意义 1 作为细菌细胞壁中肽聚糖的组分 D GluD Ala2 作为一些重要代谢物的前体或中间体 丙氨酸 VB3 鸟氨酸 Orn 胍氨酸 Cit 尿素 3 作为神经传导的化学物质 氨基丁酸4 有些氨基酸只作为一种N素的转运和贮藏载体 刀豆氨酸 5 调节生长作用6 杀虫防御作用绝大部分非蛋白氨基酸的功能不清楚 氨基酸的理化性质 一般物理性质氨基酸的旋光性和光吸收氨基酸的两性性质和等电点 二 氨基酸的理化性质 1 一般物理性质 1 形态 均为白色结晶或粉末 不同氨基酸的晶型结构不同 2 溶解性 一般都溶于水 不溶或微溶于醇 不溶于丙酮 在稀酸和稀碱中溶解性好 3 熔点 氨基酸的熔点一般都比较高 一般都大于200 超过熔点以上氨基酸分解产生胺和二氧化碳 4 旋光性 除甘氨酸外的氨基酸均有旋光性 5 光吸收 氨基酸在可见光范围内无光吸收 在近紫外区含苯环氨基酸有光的吸收 旋光性 2 氨基酸的旋光性和光吸收 20种氨基酸 除甘氨酸外 其它氨基酸的 碳原子均为不对称碳原子 可以有立体异构 有旋光性 氨基酸的构型也是与甘油醛构型比较而确定的 从蛋白质酶促水解得到的 氨基酸 都属于L 型 但在生物体中 如细菌 也含有D 型氨基酸 比旋光度是氨基酸的重要物理常数之一 是鉴别各种氨基酸的重要依据 氨基酸的旋光性和光吸收 L型氨基酸与D型氨基酸 L aminoacid D aminoacid L型和D型的由来甘油醛的旋光性 左旋甘油醛的构型 右旋甘油醛的构型 按原子序数法确定了L型和D型氨基酸 但现在L和D已经不代表氨基酸的旋光性 只代表氨基酸的绝对构型 氨基酸的光吸收 构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收 但在远紫外区 220nm 均有光吸收 在近紫外区 220 300nm 只有酪氨酸 苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力 可以通过测定280nm处的紫外吸收值的方法对蛋白溶液进行定量 氨基酸的光吸收 3 氨基酸的两性性质和等电点 1 氨基酸是兼性离子质子受体和质子供体 所谓兼性离子是指在同一分子上带有能释放质子的正离子基团和能接受质子的负离子基团 兼性离子本身既是酸又是碱 因此它既可以和酸反应 也可以和碱反应 实验证明 氨基酸在水溶液中或在晶体状态时 都以兼性离子形式存在 氨基酸在结晶形态或在水溶液中 并不是以游离的羧基或氨基形式存在 而是解离成兼性离子 在兼性离子中 氨基是以质子化 NH3 形式存在 羧基是以离解状态 COO 存在 在不同的pH条件下 两性离子的状态也随之发生变化 PH1710净电荷 10 1正离子兼性离子负离子 2 氨基酸的pK值和氨基酸解离的关系 K1 H3N CH2COO H H3N CH2COOH K2 H2NCH2COO H H3N CH2COO PH PK1 lg H3N CH2COO H3N CH2COOH PH PK lg 质子受体 质子供体 PH PK1 H3N CH2COOH H3N CH2COO PH PK1 H3N CH2COOH H3N CH2COO PH PK1 H3N CH2COOH H3N CH2COO PH PK2 PH PK2 PH PK2时呢 3 电泳及等电点 带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极移动的现象称为电泳 等电点 pI isoelectricpoint 使分子处于兼性离子状态 在电场中不迁移 分子的净电荷为零 时溶液的pH值 每一种氨基酸都有特定的pI 这是由于各种氨基酸分子上所含有的氨基 羧基等基团的数目以及各种基团的解离程度不同所造成的 一般一氨基一羧基的氨基酸等电点在pH6左右 这是由于羧基的解离程度大于氨基 故PI偏酸 碱性氨基酸pI在pH10左右 酸性氨基酸的pI在pH3左右 氨基酸水溶液中其解离度与溶液的PH有关 向氨基酸溶液中加酸时 羧基接受质子 使氨基酸带正电 加碱时 氨基释放质子 与OH 中和 使氨基酸带负电 当溶液的pH pI时 氨基酸以两性离子存在当溶液的pH pI时 氨基酸溶液中正离子占优势当溶液的pH pI时 氨基酸溶液中负离子占优势 4 氨基酸的酸碱滴定 氨基酸等电点的计算 侧链不含离解基团的中性氨基酸 其等电点是它的pK1和pK2的算术平均值 pI pK1 pK2 2 氨基酸等电点的计算 同样 对于侧链含有可解离基团的氨基酸 其pI值也决定于两性离子两边的pK值的算术平均值 酸性氨基酸 pI pK1 pKR COO 2碱性氨基酸 pI pK2 pKR NH2 2 氨基的化学反应 与亚硝酸的反应VanSlyke定氮 与甲醛的反应氨基滴定 与酰化试剂的反应氨基保护基 与2 4 二硝基氟苯 FDNB 的反应测序 与Edman试剂 PITC苯异硫氢酸酯 测序 与二甲基氨基萘磺酰氯 DNS Cl 的反应测序 4 氨基酸的化学性质 氨基酸的化学性质 与亚硝酸反应 用途 范斯来克法定量测定氨基酸的基本反应 氨基参与的反应 氨基参与醛类物质的反应 生成西佛碱的反应 用途 是多种酶促反应的中间过程 氨基参与甲醛的反应 与甲醛发生羟甲基化反应 用途 可以用来直接测定氨基酸的浓度 羟甲基氨基酸 二羟甲基氨基酸 氨基酸的化学性质 氨基参与的反应 烃基化反应 用途 是鉴定多肽N 端氨基酸的重要方法 二硝基氟苯 DNFB 法 氨基参与的反应 烃基化反应 用途 是鉴定多肽N 端氨基酸的重要方法 Sanger法 2 4 二硝基氟苯在碱性条件下 能够与肽链N 端的游离氨基作用 生成二硝基苯衍生物 DNP 在酸性条件下水解 得到黄色DNP 氨基酸 该产物能够用乙醚抽提分离 不同的DNP 氨基酸可以用色谱法进行鉴定 Edman氨基酸顺序分析法 苯异硫氰酸酯PITC法 实际上也是一种N 端分析法 此法的特点是能够不断重复循环 将肽链N 端氨基酸残基逐一进行标记和解离 烃基化反应 氨基参与的反应 氨基参与的反应 酰化反应 用途 是鉴定多肽N 端氨基酸的重要方法 丹磺酰氯法 氨基参与的反应 酰化反应 用途 是鉴定多肽N 端氨基酸的重要方法 在碱性条件下 丹磺酰氯 二甲氨基萘磺酰氯DNS Cl 可以与N 端氨基酸的游离氨基作用 得到丹磺酰 氨基酸 DNS AA 此法的优点是丹磺酰 氨基酸有很强的荧光性质 检测灵敏度可以达到1 10 9mol 酰氯 苄氧酰氯 Cbz Cl 对甲苯磺酰氯 Tos Cl 叔丁氧酰氯 Boc Cl 酸酐 邻苯二甲酸酐 R 酰基 氨基参与的反应 用途 用于保护氨基以及肽链的合成 酰化反应 氨基酸在生物体内经氨基酸氧化酶催化即可脱去 氨基而转变为酮酸 氧化脱氨基作用 氨基参与的反应 脱氨基反应 用途 酶催化的反应 a AA NaOH 氨基酸钠盐 氨基酸的碱金属盐能溶于水 重金属盐不溶于水 b HclAA EtOH 氨基酸乙酯的盐酸盐当AA的COOH变成甲酯 乙酯或钠盐后 COOH的化学反应性能被掩蔽或者说COOH被保护NH2的化学性能得到了加强or活化 易与酰基结合 为什么AA的酰基化和烃基化在碱性溶液中进行 羧基参与的反应 成盐成酯反应 形成酰卤的反应 用途 这是使氨基酸羧基活化的一个重要反应 羧基参与的反应 叠氮化反应 用途 常作为多肽合成活性中间体 活化羧基 羧基参与的反应 脱羧反应 用途 酶催化的反应 羧基参与的反应 与茚三酮反应 用途 常用于氨基酸的定性或定量分析 氨基和羧基共同参与的反应 茚三酮 水合茚三酮 还原型茚三酮 成肽反应 用途 是多肽和蛋白质生物合成的基本反应 氨基和 羧基共同参与的反应 侧链基团的化学性质 巯基 SH 的性质 作用 与金属离子的螯合性质可用于体内解毒 侧链基团的化学性质 巯基 SH 的性质 作用 氧化还原反应可使蛋白质分子中二硫键形成或断裂 胱氨酸 半胱氨酸 侧链基团的化学性质 巯基 SH 的性质 作用 氧化还原反应可使蛋白质分子中二硫键断裂 二硫苏糖醇 DTT 也可以用来打开胱氨酸上的二硫键 磺基丙氨酸 胱氨酸 6HCOOOH 6HCOOH 侧链基团的化学性质 巯基 SH 的性质 与碘乙酸的反应 作用 5 氨基酸的应用 A 医药工业氨基酸输液必需氨基酸 苏氨酸 缬氨酸 亮氨酸 异亮氨酸 赖氨酸 色氨酸 苯丙氨酸 蛋氨酸半必需氨基酸 精氨酸 组氨酸是幼儿所必需的 治疗药剂 精氨酸 对治疗高氨血症 肝机能障碍等疾病颇有效果 天冬氨酸 钾镁盐可用于恢复疲劳 治疗低钾症心脏病 肝病 糖尿病等 半胱氨酸 能促进毛发的生长 可用于治疗秃发症 甲酯盐酸盐可用于治疗支气管炎等 组氨酸 可扩张血管 降低血压 用于心绞痛 心功能不全等疾病的治疗 B 食品工业 营养强化剂 谷氨酸单钠盐 味精 天冬氨酸钠 可用于清凉饮料 能增加清凉感并使香味浓厚爽口 天冬氨酰苯丙氨酸甲酯 甜味素 APM C 农业 杀虫剂 刀豆氨酸 5 羟色氨酸可使南方毛虫拒食而死 半胱氨酸可杀死黄瓜蝇 甘氨酸乙酯衍生的二硫代磷酸盐具有较强的杀蚜虫和杀螨效果 杀菌剂 N 月桂酰缬氨酸可作为治疗稻瘟病 1 4环己二烯丙氨酸能抑制黑穗病毒 稻瘟病等 除草剂 如N 3 4二氮丙氨酸 硫代氨基酸酯等 D 化妆品工业 氨基酸能调节皮肤pH的变动 对细菌有防护作用 也可作为皮肤 毛发的营养成分 增加皮肤 毛发的光泽 防止皮肤干燥的自然保湿因子的主要成分是甘氨酸 羟基丁氨酸 丙氨酸 天冬氨酸 丝氨酸等游离氨基酸 在化妆品中添加天冬氨酸或其衍生物以及一些维生素 可防止皮肤老化 E 化学工业 维生素B6 可采用丙氨酸或天冬氨酸为原料合成 叶酸 需要用谷氨酸为原料合成 氨基酸表面活性剂 酰基谷氨酸钠 十六烷基 L 赖氨酰 L 赖氨酸甲酯二盐酸 月桂酰 L 精氨酸乙酯盐酸等具有较强的抗菌杀菌活性 且无刺激性 聚合氨基酸 聚谷氨酸甲酯可用于作为合成皮革的表面处理剂 聚天冬氨酸或聚谷氨酸的二烷基酯与磷酸高级烷基酯结合得到的化合物可作为可塑剂 稳定剂等 蛋白质的辅基是指蛋白质所含的非氨基酸成分 完全由氨基酸构成的蛋白质称为单纯蛋白质 含有非氨基酸成分 辅基 的蛋白质称为结合蛋白质 三 蛋白质的辅基 脂蛋白糖蛋白金属蛋白 结合蛋白质 第三节肽键和肽 一 肽键与肽平面二 肽 一 肽键与肽平面 肽键 peptidebond 存在于在蛋白质和肽分子中 是由一个氨基酸的 羧基与另一个氨基酸的 氨基脱水缩合形成的化学键 肽单元 peptideunit 肽键结构的四个原子与两个C 构成一个肽单元 C CO NH C 在肽单元中 羰基的 键电子对与N的孤电子对存在部分共享 C N键的键长 0 132nm 介于单键 0 147nm 和双键 0 124nm 之间 具有部分双键性质 不能自由旋转 肽单元的6个原子位于同一平面 叫酰胺平面或肽键平面 肽平面 它是蛋白质构象的基本结构单位 在肽平面上 两个C 处于反式位置 两侧的C N和C C 键是可以自由旋转的单键 肽平面围绕 碳原子的单键旋转 使多肽链形成各种形式的主链构象和侧链构象 即蛋白质的空间结构 肽平面 肽单元 H H H H 二 肽 肽是由两个或多个氨基酸通过肽键连接而成的分子 氨基酸缩合成肽之后 氨基酸本身就不完整了 称为氨基酸残基 由两个氨基酸构成的肽是二肽 通常把由2 10个氨基酸的称为寡肽 由更多氨基酸构成的肽称为多肽 多肽化学结构呈链状 所以也称多肽链 肽是氨基酸的链状缩合物 多肽链上由 N C C 交替构成的长链 称为主链 也称骨架 氨基酸残基的R基团 相对很短 称为侧链 主链的一端含有游离的 氨基 称为氨基末端或N 末端 另一端含游离的 羧基 称为羧基末端或C 末端 肽链有方向性 通常把N端 氨基端 看成是肽链的头 这与多肽链的合成方向一致 多肽链的合成开始于氨基端 结束于C端 羧基端 肽链结构 H 丙 苷 半 丙 丝 OH或H Ala Gly Cys Ala Ser OH 肽链的基本结构 习惯写法 N末端 C末端 牛核糖核酸酶 分子量小于10kDa的是多肽 不包括寡肽 10kDa以上为蛋白质 胰岛素例外 1个多肽只有1条肽链 而许多蛋白质含不止1条肽链 多肽的生物学作用可能与其空间结构无关 而改变蛋白质的空间结构可能会改变其活性 许多蛋白质含辅基成分 而多肽一般不含辅基成分 蛋白质是大分子肽 20种标准氨基酸的算数平均分子量是138 在多数蛋白质中小的氨基酸含量更高 几何平均分子量约为128 每形成1个肽键就要脱去1分子水 蛋白质分子中氨基酸残基的平均分子量就是128 18 110 对于多肽和单纯蛋白质 可以用110去除它的分子量而估计所含氨基酸残基数 多肽和单纯蛋白质所含氨基酸残基数的推断 三 生物活性肽 生物活性肽是指具有特殊生理功能的肽类物质 抗氧化剂 谷胱甘肽 GSH 谷氨酸 半胱氨酸 甘氨酸 还原型谷胱甘肽 GSH 是一个特殊的三肽 其N 端的谷氨酸以 羧基与半胱氨酸氨基结合形成肽键 SH为活性基团 为酸性肽 GSH因含有巯基而成为生物体内一个非常重要的抗氧化剂 还原剂 GSH过氧化物酶 GSH还原酶 NADPH H NADP 主要功能 体内许多激素属寡肽或多肽 催产素是一个九肽 在分娩时刺激子宫肌肉收缩 并加速乳汁的分泌 加压素与催产素相比只差两个氨基酸 它通过促进肾脏对水的重吸收维持体液渗透压的相对稳定 L Leu D Phe L Pro L Val L OrnL Orn L Val L Pro D Phe L Leu短杆菌肽S 环十肽 由细菌分泌的多肽 有时也都含有D 氨基酸和一些不常见氨基酸 如鸟氨酸 Ornithine 缩写为Orn 鹅膏蕈碱 amanitin 鹅膏蕈碱是从毒蕈中分离得到的一个环状八肽 可抑制真核生物RNA聚合酶II 从而抑制真核生物RNA的合成 神经肽 如脑啡肽 enkephalin 甲硫氨酸脑啡肽Tyr Gly Gly phe Met 亮氨酸脑啡肽Tyr Gly Gly phe Leu 功能 镇痛 第四节蛋白质的分子结构 一 蛋白质的一级结构二 蛋白质的二级结构三 蛋白质的三级结构四 蛋白质的四级结构五 维持蛋白质构象的化学键 一级结构二级结构三级结构四级结构 蛋白质结构示意图 二级结构 三级结构和四级结构称为蛋白质的空间结构或构象 蛋白质在给定条件下的构象通常是最稳定的构象 也是它参与生命活动的构象 以这种构象存在的蛋白质称为天然蛋白质 蛋白质的一级结构是指蛋白质分子中多肽链的氨基酸排列顺序 sequence 它决定蛋白质分子的二级和三级等高级结构 一 蛋白质的一级结构 肽键二硫键 主要化学键 胰岛素的一级结构 牛胰岛素是第一个阐明一级结构的蛋白质 也是第一个人工合成的蛋白质 它含A B两条肽链 A链有21个氨基酸残基 B链有30个氨基酸残基 含6个半胱氨酸 构成3个二硫键 其中2个在A B链之间 A链内还有1个二硫键 insulin 氨基酸序列是蛋白质生物学活性的分子基础一级结构是空间结构的基础 包含了形成特定空间结构所需的全部信息蛋白质氨基酸序列的改变是众多遗传病的物质基础研究氨基酸序列的相似性可以阐明物种之间的进化关系 研究一级结构的意义 蛋白质的二级结构是指多肽链中主链 mainchain 原子在各局部的空间排列 spacialarrangement 分布状况 不涉及各R侧链 sidechain 的空间排布 二 蛋白质的二级结构 稳定因素 氢键 在蛋白质多肽链上 氨基酸通过肽键连接 肽键是一个刚性平面结构 是肽链卷曲折叠的基本单位 由于肽键平面相对旋转的角度不同 多肽链可以形成 螺旋 helix 折叠 pleatedsheet 转角 turn 和无规卷曲 randomcoil 等几种二级结构 还可以在此基础上进一步形成超二级结构 1950年美国Pauling等人在研究纤维状蛋白质时 提出了 螺旋 后来发现在球状蛋白质分子中也存在 螺旋 螺旋 蛋白质多肽链像螺旋一样盘曲上升 每3 6个氨基酸残基螺旋上升一圈 每圈螺旋的高度为0 54nm 每个氨基酸残基沿轴上升0 15nm 螺旋上升时 每个残基沿轴旋转100 在同一肽链内相邻的螺圈之间形成氢链 螺旋的稳定性主要靠氢键来维持 螺旋有右手螺旋和左手螺旋之分 天然蛋白质绝大部分是右手螺旋 到目前为止仅在嗜热菌蛋白酶中发现了一段左手螺旋 螺旋结构的要点 右手螺旋 左手螺旋 蛋白质分子中的 螺旋 螺旋的结构模型 也是pauling等人提出来的 它是与 螺旋完全不同的一种结构 折叠 折叠主链骨架以一定的折叠形式形成一个折叠的片层 在两条相邻的肽链之间形成氢链 折叠有平行和反平行的两种形式 每一个氨基酸在主轴上所占的距离 平行的是0 325nm 反平行的是0 35nm 折叠特点 折叠 折叠平行和反平行的两种形式 同向 折叠 反向 折叠 转角 肽链内形成180 回折 含4个氨基酸残基 第一个氨基酸残基与第四个形成氢键 第二个氨基酸残基常为Pro 转角 无规卷曲 无规卷曲是指没有规律性的肽链结构 许多蛋白质的功能部位常常埋伏在这里 环 这是最近发现普通存在于球状蛋白质中的一种新的二级结构 这种结构的形状象希腊字 所以称 环 环这种结构总是出现在蛋白质分子的表面 而且以亲水残基为主 这种结构与生物功能有关 另外在分子识别中可能起重要作用 1973年Rossmann提出了超二级结构概念超二级结构又称为模体 motif 也译为基序 它是指二级结构的基本结构单位 螺旋 折叠等 相互聚集 形成有规律的二级结构的聚集体 已知的超二级结构主要有 x 曲折和 折叠筒等 超二级结构 是两个 螺旋互相缠绕 形成一个左手超螺旋 是两段平行的 折叠通过一段连接链x连接而形成的结构 x Rossmann折叠 如x为 螺旋则为 最常见的为两个 聚集体连在一起形 结构 称Rossmann折叠 如 为 折叠 则为 如x为无规卷曲 则为 c 是三条或三条以上反平行的 折叠通过短链 如 转角相连 曲折 meander 由多条 折叠链所构成的 折叠片 再卷成一个园筒状的结构 折叠筒 sheatbarrel 锌指结构 锌指结构指的是在很多蛋白中存在的一类具有指状结构的结构域 这些具有锌指结构的蛋白大多都是与基因表达的调控有关的功能蛋白 锌指结构的共同特征是通过肽链中氨基酸残基的特征集团与Zn2 的结合来稳定一种很短的 可自我折叠成 手指 形状的的多肽空间构型 此为Cys2His2的锌手指之结构 由 螺旋和反式的 折叠所组成 锌离子 绿色 是由两个组氨酸残基和两个半胱氨酸残基所调节 蛋白质的三级结构是指一条完整的蛋白质多肽链中彼此远离的一些氨基酸残基通过非共价键及少量共价键如二硫键结合 使多肽链在二级结构基础上进一步折叠形成特定的空间结构 描述的是构成蛋白质多肽链的所有原子的空间排布 三 蛋白质的三级结构 疏水键离子键氢键和VanderWaals力等 稳定因素 蛋白质的三级结构 1963年Kendrew等通过鲸肌红蛋白的x 射线衍射分析 测得了肌红蛋白的三级结构 空间结构 肌红蛋白的三级结构 1 肌红蛋白是由一条多肽链折叠盘绕成近似球状的构象 2 主链的80 左右是右手螺旋 其余为无规卷曲 一条多肽链共有8个螺旋区 A B C D E F G H 7个非螺旋区 二个在末端 中间有五个 3 氨基酸残基的亲水基团几乎全部分布在分子的表面 而疏水基团几乎全部在分子的内部 4 血红素辅基垂直地伸出分子表面 通过一个His残基和分子内部相连 肌红蛋白的三级结构特点 大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或数个球状或纤维状的区域 折叠得较为紧密 各行其功能 称为结构域 结构域 domain 结构域 Domain 类型 螺旋域 折叠域 域 域无规则卷曲 回折域无规则卷曲 螺旋域 纤维蛋白分子的结构域 Triosephosphateisomerase磷酸丙糖异构酶 结构域 结构域1 结构域2 折叠 转角 二硫键 螺旋 卵溶菌酶的三级结构中的两个结构域 蚯蚓血红蛋白四个 螺旋组成的结构域 螺旋域 折叠域 免疫球蛋白VL 折叠结构域 结构域 Domain 有一些蛋白质由几条甚至几十条肽链构成 彼此没有共价键连接 每一条肽链都形成相对独立的三级结构 称为该蛋白质的一个亚基 该蛋白称为多亚基蛋白 也叫多聚体蛋白 含亚基少的又称为低聚体 多亚基蛋白的亚基按特定的空间排布结合在一起 构成该蛋白质的四级结构 四 蛋白质的四级结构 血红蛋白四级结构 血红蛋白四级结构 血红蛋白四级结构 五 维持蛋白质构象的化学键 肽键二硫键氢键疏水作用离子键范德华力 第四节蛋白质结构与功能的关系 一 蛋白质一级结构与功能的关系二 蛋白质构象与功能的关系 一 蛋白质一级结构与功能的关系 蛋白质的一级结构决定其构象 每一种蛋白质分子都有自己特定的氨基酸组成和排列顺序即一级结构 蛋白质的一级结构包含了指导其形成天然构象所需的全部信息 牛核糖核酸酶的一级结构 天然状态 有催化活性 尿素 巯基乙醇 去除尿素 巯基乙醇 非折叠状态 无活性 同源蛋白质存在序列同源现象 不同种属来源的一些蛋白质的氨基酸序列非常相似 构象也相似 功能也一致 这些蛋白质称为同源蛋白质 同源蛋白质氨基酸序列的这种相似性称为序列同源现象 在同源蛋白质氨基酸序列中 有许多位置的氨基酸是相同的 这些氨基酸称为不变残基 不变残基大多是维持蛋白质构象和活性所必需的氨基酸 相比之下 其他位置的氨基酸差异较大 这些氨基酸称为可变残基 同源蛋白质 直系同源 orthologous 指的是不同物种之间的同源性 例如蛋白质的同源性 DNA序列的同源性 Orthologs是指来自于不同物种的由垂直家系 物种形成 进化而来的蛋白 并且典型的保留与原始蛋白有相同的功能 旁系同源 Paralogs 是那些在一定物种中的来源于基因复制的蛋白 可能会进化出新的与原来有关的功能 蛋白质同源家庭的分析对于确立物种之间的亲缘关系和预测新蛋白质序列的功能有重要意义 同源蛋白质 homolog 进一步划分为直系同源 ortholog 和旁系同源 paralog 前者指不同物种中具有相同功能和共同起源的基因 后者则指在同一物种内具有不同功能 但也有共同起源的基因 例如同是起源于珠蛋白的 珠蛋白 珠蛋白和肌红蛋白 改变蛋白质的一级结构可以直接影响其功能 基因突变可以改变蛋白质的一级结构 从而改变蛋白质的生物活性甚至生理功能而导致疾病 由基因突变造成蛋白质结构或合成量异常而导致的疾病称为分子病 镰状细胞贫血是由血红蛋白分子结构异常而导致的分子病 镰状细胞贫血 Glu在生理pH值下带负电荷R基aa 而Val是非极性R基aa 就使得HbS分子表面的电荷发生改变 引起等电点改变 溶解度降低 使之不正常地聚集成纤维状血红蛋白 致使红细胞变形成镰刀状 损害细胞膜 使其极易被脾脏清除 发生溶血性贫血 正常红细胞 镰状红细胞 二 蛋白质的构象与功能的关系 不同蛋白质的构象不同 理化性质和生理功能也就不同蛋白质在不改变一级结构的前提下 通过变构就可以改变活性 若蛋白质的折叠发生错误 尽管其一级结构不变 但蛋白质的构象发生改变 仍可影响其功能 严重时可导致疾病发生 这类疾病称为蛋白质构象病 蛋白质构象病 有些蛋白质错误折叠后相互聚集 常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀 产生毒性而致病 表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变 蛋白质构象病的机理 疾病主要包括 人纹状体脊髓变性病老年痴呆症亨停顿舞蹈病疯牛病 疯牛病 疯牛病是由朊病毒蛋白 prionprotein PrP 引起的一组人和动物神经退行性病变 软病毒是一类只有蛋白质而没有核酸的病原体 朊病毒蛋白 PrP 是存在于正常哺乳动物脑内组织细胞膜上的一种糖蛋白 正常的PrP富含 螺旋 称为PrPC PrPC在某种未知蛋白质的作用下可转变成为 折叠的PrPSc 从而致病 第五节蛋白质的理化性质 一 一般性质二 大分子特性 紫外吸收特征呈色反应两性解离与等电点 一 一般性质 蛋白质溶液是胶体溶液沉降与沉降系数变性与复性 二 大分子特性 第六节蛋白质的分离与鉴定 蛋白质沉淀离心技术电泳技术层析技术透析技术 肽键 二硫键 氢键是蛋白质分子结构中含量最多 对稳定结构起主要作用的非共价键 氢键的本质是带部分正电荷的共价H与O N F的孤电子对的作用力 沿特定方向才会形成强的氢键 一个孤电子对只能形成一个氢键 一个氢只能形成一个氢键 纯水系统的氢键是最稳定的 室温下每个水分子约形成3 4个氢键水结冰后每个水分子形成4个氢键 离子键数量不多 但是最强的非共价键 主要存在于蛋白质分子结构的外部 少量存在于分子结构内部的离子键对蛋白质功能至关重要 疏水键又称疏水性相互作用 是指疏水性分子或基团为减少与水的接触面积而彼此聚集的一种相对作用力 疏水键对稳定蛋白质构象非常重要 蛋白质内部主要聚集了疏水性氨基酸残基 范德华力是任何两个原子保持范德华半径距离时都存在的一种作用力 纤维状蛋白质和球状蛋白质 纤维状蛋白质是动物体的支架和外保护成分 其二级结构比较单一 如指甲和毛发的主要成分是 角蛋白 角蛋白由大量二级结构为 螺旋的肽链经过多级缠绕形成 坚韧而富有弹性 这与其保护功能一致 球状蛋白质主要是酶和调控蛋白 其构象中包含各种二级结构 由它们形成的结构域常常是酶的活性中心 或者是调控蛋白的蛋白质 蛋白质 蛋白质 DNA结合位点 角蛋白 keratin 纤维状蛋白质的构象 血红蛋白变构 松弛构象 relaxed 紧张构象 tense 血红蛋白的两种构象 血液中氧合血红蛋白的解离曲线 O2H 或CO22 3 二磷酸甘油酸 2 3 DPG 血红蛋白的变构效应剂 血液H 浓度或PCO2增高时 Hb与O2的亲和力降低 血液H 浓度或PCO2降低时 Hb与O2的亲和力增大 H 或PCO2对Hb与O2的亲和力的影响称为Bohr效应 Bohr效应 许多蛋白质通过与其他分子可逆结合发挥作用 与之结合的分子叫配体 蛋白质与配体结合的部位叫结合位点 配体的结合常导致蛋白质构象改变 称为蛋白质的变构效应 此类蛋白质称为变构蛋白 配体则称为调节剂 变构剂或效应剂 促进变构蛋白功能的调节剂是激活剂 抑制其功能的是抑制剂 蛋白质变构的结果是在构象上结合位点与配体更适合 结合更紧密 蛋白质与配体之间的这种结构适应称为诱导契合 与同一蛋白质分子结合的几个配体之间因变构效应而产生的相互影响称为协同效应 如果是促进结合 称为正协同效应 反之为负协同效应 同类配体之间的协同效应称为同促效应 异类配体之间的协同效应称为异促效应 配体结合是蛋白质功能的化学基础 紫外线吸收特征 构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收 但因为存在肽键结构在远紫外区 220nm 均有光吸收 在近紫外区 220 300nm 组成天然蛋白质分子的20种氨基酸中 只有酪氨酸 苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力 其吸收峰在280nm左右 以色氨酸吸收最强 可利用此性质采用紫外分分光度法测定蛋白质的含量 氨基酸的紫外吸收 双缩脲反应Folin 酚试剂呈色反应茚三酮反应 呈色反应 当蛋白质溶液处于某一pH时 蛋白质解离成正 负离子的趋势相等 即成为兼性离子 净电荷为零 此时溶液的pH称为蛋白质的等电点 蛋白质的等电点 蛋白质的两性解离 蛋白质分子的直径已经达到胶体颗粒大小的范围 1 100nm 所以其水溶液是一种比较稳定的胶体溶液 蛋白质溶液是胶体溶液 电荷与水化膜是主要两个稳定因素 生理pH下的蛋白质绝大多数带负电荷 同性电荷使蛋白质分子互相排斥 不易形成可以沉淀的大颗粒 蛋白质多肽链中的极性氨基酸残基大都处于分子表面 它们可以与水形成氢键 从而在分子表面包裹了一层结合水 在蛋白质分子之间起到了隔离作用 电荷与水化膜 沉降 蛋白质颗粒的密度比水大 在溶液中有在重力作用下沉降的趋势 但水分子对蛋白质颗粒的不断碰撞使之产生布朗运动 足以抵消重力沉降趋势 使蛋白质维持均相溶液状态 通过超高速离心技术制造重力场 增加其相对重力 则蛋白质颗粒就会克服布朗运动 沿相对重力场方向沉降 沉降速度与分子量及分子形状相关 对于特定蛋白质颗粒 其沉降速度与离心加速度 相对重力 之比为一常数 称之为沉降系数 s 沉降系数 蛋白质在某些理化因素作用下 其特定的空间构象破坏而导致理化性质改变及生物活性丧失 这种现象称为蛋白质的变性作用 是二硫键和非共价键的破坏而引起的空间结构的改变 不涉及一级结构的改变 蛋白质变性 物理因素化学因素 变性因素 蛋白质的凝固 将pH值接近等电点的蛋白质溶液加热 可以使蛋白质形成较坚固的凝块 该凝块不溶于强酸和强碱 这种现象称为蛋白质凝固 凝固实际上是蛋白质变性后进一步发展的不可逆结果 某些蛋白质的变性是可逆的 如果消除造成蛋白质变性的因素 使其重新处于维持天然构象时的生理条件下 则会自发恢复天然构象 生物学活性也完全恢复 该过程称为蛋白质复性 renaturation 蛋白质复性 核酸酶变性 核酸酶复性 核酸酶变性与复性 加热加压超声波紫外线 物理因素 胍 脲 有机溶剂强酸强碱 SDS 巯基乙醇 重金属离子生物碱试剂 化学因素 透析 dialysis 利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法 超滤法 应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜 达到浓缩蛋白质溶液的目的 透析及超滤法 将蛋白质溶液放在半透膜的囊内 置于流动的适当的缓冲液中 小分子杂质从囊中透出 而蛋白质保留在囊内从而将蛋白质纯化 这种处理称为透析 透析 透析 dialysis 超滤透析 利用超滤膜在压力下使大分子滞留 而小分子及溶剂滤过的方法叫超滤透析 超滤 透析疗法 透析疗法是利用半渗透膜来去除血液中的代谢废物和多余水分并维持酸碱平衡的一种治疗方法 透析疗法 血液透析腹膜透析 蛋白质分子聚集 从溶液中析出的现象称为蛋白质沉淀 蛋白质沉淀 水化膜 溶液中蛋白质的沉淀 蛋白质胶体颗粒的沉淀 盐析法低温有机溶剂沉淀法重金属盐沉淀法生物碱试剂及某些酸类沉淀蛋白质 蛋白质沉淀方法 蛋白质变性 沉淀和凝固之间的关系 蛋白质变性导致构象破坏 活性丧失 但不一定沉淀 蛋白质沉淀是胶体溶液稳定因素被破坏的结果 构象不一定改变 活性也不一定丧失 所以不一定变性 蛋白质凝固是变性的特殊类型 是变性蛋白质进一步形成较坚固的凝块 离心技术 离心技术是利用物体高速旋转时产生强大的离心力 使置于旋转体中的悬浮颗粒发生沉降或漂浮 从而使某些颗粒达到浓缩或与其他颗粒分离之目的 常用离心机类型 一般低速离心机的最高转速不超过6000rpm 高速离心机在25000rpm以下 超速离心机的最高速度达30000rpm以上 常用离心方法 差速离心法 differentialvelocitycentrifugation 速率区带离心法 ratezonalcentrifugation 等密度离心法 isopyniccentrifugation 差速离心法 差速离心法利用不同的粒子在离心力场中沉降的差别 在同一离心条件下 沉降速度不同 通过不断增加相对离心力 使一个非均匀混合液内的大小 形状不同的粒子分步沉淀 操作过程中一般是在离心后倾倒的办法把上清液与沉淀分开 然后将上清液加高转速离心 分离出第二部分沉淀 如此往复加高转速 逐级分离出所需要的物质 差速离心的分辨率不高 沉淀系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开 常用于其他分离手段之前的粗制品提取 速率区带离心法 速率区带离心法是离心前在离心管内先装入密度梯度介质 如蔗糖 甘油 KBr CsCl等 待分离的样品铺在梯度液的顶部 离心管底部或梯度层中间 同梯度液一起离心 离心后在近旋转轴处的介质密度最小 离旋转轴最远处介质的密度最大 但最大介质密度必须小于样品中粒于的最小密度 这种方法是根据分离的粒子其在梯度液中沉降速度的不同 使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带 达到彼此分离的目的 梯度液在离心过程中以及离心完毕后 取样时起着支持介质和稳定剂的作用 避免因机械振动而引起已分层的粒子再混合 该离心法的离心时间要严格控制 即有足够的时间使各种粒子在介质梯度中形成区带 又要控制在任意一个粒子达到沉淀前 如果离心时间过长 所有的样品可全部到达离心管底部 离心时间不足 样品还没有分离 由于此法是一种不完全的沉降 沉降受物质本身大小的影响较大 一般是应用在物质大小相异而密度相同的情况 速率区带离心法 等密度离心法 等密度离心法是在离心前预先配制介质的密度梯度 此种密度梯度液包含了被分离样品中所有粒子的密度 待分离的样品铺在梯度液或和梯度液先混合 离心开始后 当梯度液由于离心力的作用逐渐形成底浓而管顶稀的密度梯度 与此同时原来分布均匀粒子也发生重新分布 当管底介质的密度大于粒子的密度 粒子上浮 在弯顶处粒子密度大于介质密度时 则粒子沉降 最后粒子进入到一个它本身的密度位置即粒子密度等于介质密变 此时dr dt为零粒子不再移动 粒子形成纯组分的区带 与样品粒子的密度有关 而与粒子的大小和其他参数无关 因此只要转速 温度不变 则延长离心时间也不能改变这些粒子的成带位置 电泳技术 带电颗粒在电场作用下 向着与其电性相反的电极移动 称为电泳 electrophoresis EP 利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术 1937年瑞典学者A W K 蒂塞利乌斯设计制造了移动界面电泳仪 分离了马血清白蛋白的3种球蛋白 创建了电泳技术 常用电泳方法 凝胶电泳薄膜电泳毛细