卵巢上皮性癌组织中p15、p16基因突变及其临床意义.doc

卵巢上皮性癌组织中p15、p16基因突变及其临床意义中华妇产科杂志 2000年第7期第35卷 论著摘要作者：李红霞江森李文军单位：李红霞（现在北京铁路总医院妇产科）；江森（250021 济南，山东医科大学附属医院妇产科）；李文军（重庆第三军医大学妇产科）p15、p16基因是近年来发现和分离的两个抑癌基因。研究表明，p15、p16基因突变与人类肿瘤的发生有关，在多种原发性肿瘤及其肿瘤细胞系中均存在p15、p16基因纯合性缺失与点突变1。本研究旨在通过检测卵巢上皮性癌（OEC）中p15、p16基因纯合性缺失与点突变，探讨其在OEC发生、发展中的作用，并评价其可否作为肿瘤标记物应用于OEC的诊断、监测及预后的判断。一、资料与方法1.研究对象：43例OEC、11例卵巢良性上皮性瘤及4例卵巢交界性上皮性瘤取自山东医科大学附属医院、山东省立医院及解放军第九医院妇产科19951997年住院的手术患者。OEC患者平均年龄53岁（2974岁）；病理类型包括，浆液性囊腺癌23例、粘液性囊腺癌12例、未分类癌6例及子宫内膜样癌2例；按国际妇产科联盟1988年手术病理分期，早期（期）12例、晚期（期）31例；按世界卫生组织标准，病理分级为G1G2级32例、G3级11例；同时伴有腹膜、邻近器官或淋巴结等转移者29例。患者均为初次手术，术前均未予化学治疗（化疗）和放射治疗（放疗）。卵巢良性上皮性瘤患者平均年龄46 岁（2972岁），其中浆液性囊腺瘤6例，粘液性囊腺瘤5例。卵巢交界性上皮瘤患者平均年龄34岁（2159岁），其中浆液性及粘液性肿瘤各2例。2.方法：（1）标本制备及DNA提取：取患者肿瘤及瘤旁组织（有转移者同时取转移灶组织）共145份，以组织包埋剂包埋，立即置于液氮中速冻，然后转移至-80冰箱中保存。使用时先制成5 m厚的冰冻切片，行显微分离肿瘤组织，对照苏木素伊红染色，于光学显微镜下观察，选择肿瘤细胞富集区（肿瘤细胞与间质细胞比例70%），以手术刀片分离、刮取肿瘤细胞并提取DNA。（2）p15、p16基因纯合性缺失和点突变的检测及判断标准2：采用多聚酶链反应及琼脂糖凝胶电泳方法检测p15、p16基因纯合性缺失，以多聚酶链反应单链构象多态性分析(PCR-SSCP)检测p15、p16基因点突变。判断标准：p15、p16基因纯合性缺失的标准为肿瘤组织p15（或16）与正常组织p15（或16）的比值0.25 ；PCR-SSCP分析p15、p16基因点突变， 则是与自体正常组织对比,肿瘤组织出现异常迁移带者表示有基因点突变。3.统计学处理：采用SAS软件作2检验（四格表确切概率法）及相关分析。二、结果1. 卵巢良性、交界性上皮性肿瘤及OEC癌旁组织中p15、p16基因纯合性缺失和点突变的检测：卵巢良性、交界性上皮性肿瘤及OEC癌旁组织中未检测到p15、p16基因纯合性缺失和点突变，OEC组织中p15基因纯合性缺失率为46.5%（20/43），与良性肿瘤比较，差异有显著性（P0.01）。OEC组织中p15基因纯合性缺失包括E1、E2共同缺失4例，占缺失总数的20.0%;仅E1缺失10例;仅E2缺失者6例。PCR-SSCP检测未发现p15基因点突变。OEC组织中p16基因纯合性缺失率及点突变率分别为16.0%（7/43）及7.0%（3/43），其中E1缺失者5例，E1、E2、E3完全缺失者1例，E2、E3共同缺失者1例。p16基因发生点突变的3例均位于E2，且表现为杂合性。p16基因的纯合性缺失及点突变率，OEC组织与良性、交界性肿瘤组织比较，差异均无显著性(P0.05)。OEC组织中p15、p16基因总变异率（包括纯合性缺失率及点突变率）为70.0%。在p16基因突变（包括纯合性缺失与点突变）的10例中，9例同时存在p15基因的纯合性缺失；而在p16基因正常的33例中，仅有1例有p15基因的纯合性缺失，两者比较，差异有显著性（P0.01）。p15、p16基因突变之间存在正相关性（r=0.48）。2. p15、p16基因突变与临床病理：病理分级G3级中p15基因的纯合性缺失率为63.6%，较G1、G2级的40.0%有升高趋势，但两者比较,差异无显著性(P0.05)。p15、p16基因变异多发生于浆液性囊腺癌，与其他类型OEC比较，差异也无显著性(P0.05)。见表1。肿瘤转移灶组织中p15、 p16基因纯合性缺失率分别为64.0%及38.5%,与原发灶比较，差异无显著性(P0.05)。表1p15、p16 基因突变与临床病理参数的关系类别总例数 p15基因缺失P值p16基因突变P值例数 百分率（%）例数 百分率（%）手术病理分期早期12 5 41.7216.6晚期31 15 48.40.058 18.6 0.05病理分级G1G2级32 1340.6 7 21.9G3级11 7 63.60.053 27.3 0.05 淋巴结转移有 29 1241.37 24.1无 14 857.10.053 21.40.05病理类型浆液性囊腺癌 23 13 56.5 6 26.0粘液性囊腺癌 123 25.0 3 25.0未分类癌 6 4 4/6*1 1/6*子宫内膜样癌2 0 0/2*0.050 0/2*0.05*例数少于10，不计百分率三、讨论1.p15、p16基因突变与OEC形成和发展的关系：本研究结果显示，OEC组织中p15、p16基因总突变率高达70.0%，且p15、p16基因突变之间存在正相关，提示，p15、p16基因突变是OEC形成中的一个普遍现象，两者共同参与了OEC发生、发展。本研究发现，p15基因变异的形式为纯合性缺失而非点突变，表明纯合性缺失为该基因失活的主要方式，与其他作者的报道一致3。值得注意的是，本组资料中的3例p16基因点突变均为杂合性，其他作者亦有类似报道，提示，p16的1个等位基因是因突变而失活，而另外1个等位基因失活可能是由于其他机理，如甲基化作用、杂合性缺失；或如p53基因一样，p16亦为显性基因，其中1个等位基因突变，即引起细胞周期正常演进的紊乱4，其确切机理尚有待于进一步的探讨。2.p15、p16基因突变的临床意义：本研究结果显示，在卵巢良性及交界性上皮性肿瘤中未检测到p15、p16基因纯合性缺失和点突变，提示，p15、p16基因变异是恶性肿瘤的特征性改变，有望作为肿瘤标记物用于OEC的诊断及与良性肿瘤的鉴别诊断中。因p15、p16基因突变率在患者各预后影响因素如临床分期、病理分级以及有无肿瘤转移等之间的差异无显著性，故其价值尚有待于进一步探讨。参考文献1，Fujita M, Enomoto T, Haba T, et al. Alteration of p16 gene and p15 genes in human epihtelial ovarian tumors. Int J Cancer,1997, 74:148-155.2，Wong YF, Chung TK, Cheung TH, et al. P16INK4A and p15INK4B alterations in primary gynecologic malignancy. Gynecol Oncol，1997, 65:319-324.3，Roesler JM, Livignston EH, Strivatsan E, et al. Deletion of p15(MTS2) in head ang neck squamous cell carcinomas. J Surg Res, 1998, 77:50-54.4，Pinyol M, Francese C, Bea S, et al. P16INK4A gene