化学发光免疫法检测AFP的空白限-检出限和定量检测限的建立与(精)

临床检验杂志2010年11月第28卷第6期Chin J Clin Lab Sci Nov 2010 Vol 28 No 6 469 764X 2010 06 469 03文章编号 1001 质量管理研究 化学发光免疫法检测AFP 的空白限 检出限和定量检测限的建立与评价 温冬梅 张秀明 王伟佳 黄福达 何娟 肖礼红 欧阳能良 吴剑杨 李曼 庞嘉 琳 中山大学附属中山医院检 验医学中心 广东中山 摘要 目的 建立并评价化学发光免疫法检测甲胎蛋白 AFP 的空白限 LoB 检出限 LoD 和定量检测限 LoQ 方法 参 A 文件 考CLSI EP17 将AFP 空白样品和系列低浓度样品在Bayer Centaur 240化学发光免疫检测系统上进行检测 依据数据LoD 和LoQ 采用相应的统计学方法 确定血清AFP 的LoB 同时用传统方法建立AFP 的检测低限 LLD 生物检的分布规律 测限 BLD 和功能灵敏度 FS 结果 A 方案建立的LoB 为0 80ng ml LoD 为2 60ng ml LoQ 为3 30ng ml 应用EP17 应用两种方法建立的LoB 和LLD 均低于 BLD 为2 20ng ml FS 为2 20ng ml 结论用常规方法建立的LLD 为1 00ng ml Bayer Centaur 240化学发光免疫系统检测AFP 的分析灵敏度得到验证确认 实验室在验证仪仪器说明书声明的灵敏度性能 器声明的LoB 时 应同时建立检测系统的LoD 和LoQ 以便为临床提供更为可靠的检验结果 两种评价方案均具有实用性 国内实验室可 视具体情况选择不同的评价方案 关键词 甲胎蛋白 方法学评价 分析灵敏度中图 分类号 R446 文献标识码 A 1 根据 医疗机构临床实验室管理办法 和医 时取不同浓度的低浓度样品各1支 待溶解混匀后与常规标本同等条件下进行 测定 1 5 常规方法 4 5 参照文献 确定AFP 的LLD BLD 和FS 空白样品作10次批内重复测定 低浓度样品作日间重复测定 共10d 记录光强度值 RLUs 1 6 EP17 A 方法 A 文件 3 确定AFP 参照EP17 LoD 和LoQ 空白样品进行60次测定 的LoB 每日1批 每批重复检测12次 共5d 记录浓度值 6个浓度的低浓度样品作日间重复测定 每日2批 每批共5d 记录浓度值 相隔时间 2h 1 7 统计方法 LLD BLD 和FS 的统计方法参照文献空白限 LoB 按国际标准化组织 ISO 的 1 7 1 4 5 1 7 2 建议 设定 类错误和 类错误水平均为5 5 若空白值呈正态分布 按下式计算空白限 LoB B 1 645 B 式中 B 和 B 分别为空白样品检测值的均值和标准差 若空白值呈非正态分布 则用非参数方法 估计第95百分位数 Pct B 的N B 100 0 5 即 LoB Pct B 100 即 LoB 在 值 0 95 N B 0 5 位置的结果 位置的结果 在 注 式中N B 是重复检测的次数 是百分位数 1 7 3 检出限 LoD 若低浓度样品检测结果呈 学实验室认可的要求 2 临床实验室必须对检测系 统的主要分析性能进行验证确认或分析评价 证实其能够满足预期的质量要求 后才能用于常规检测 分析灵敏度是检测系统的主要性能指标之一 本文参考美国 临床和实验室标准化协会 CLSI 发布的 检出限和定量检测限的确定方案 建立化学发光免疫法检测AFP 的空白限 LoB 检出限 LoD 和定量检测限 LoQ 并与传统方法比较 现报道如下 11 1 材料与方法检测系统 Bayer Centaur 240化学发光免疫 4 5 3 建立的检测低 限 LLD 生物检测限 BLD 和功能灵敏度 FS 进行 分析仪及原装试剂 校准品 批号为CD54L CD54H 和质控品 批号为和 1 21 3 空白样品低浓度样品 用Bayer 原装配套AFP 稀释液作用Bayer 原装配套AFP 稀释液 为空白样品 对AFP 浓度为5 50ng ml的新鲜血清作系列稀释 配制成一系列低浓度的AFP 样品 其理论浓度 ng ml 分别为0 空白 1 10 1 65 2 20 3 30 4 40 5 50 介于预期检测限浓度1 4倍 1 4 样品保存 将配制好的系列低浓度样品分装 于带盖一次性试管内于 20 冰箱保存 每次测定 基金项目 广东省医学科研基金项目 2009A 中山市科技计划项目 20091A03 8 1976年生 作者简介 温冬梅 女 副主任技师 学士 主要从事临床生物化学检 验和实验室管理工作 E mail zxm0760 163 com 通讯作者 张秀明 主任技师 硕士研究生导师 470 临床检验杂志2010年11月第28卷第6期Chin J Clin Lab Sci Nov 2010 Vol 28 No 6 正态分布 计算多个低浓度样品的综合标准差 SDs SD s 1SD 1 n 2SD 2 n 3SD 3 n m SD m n 1 n 2 n 3 n m 和第58个观察值的均数 将60个空白检测值由小第57和第58位置均为0 8到大 排序 见表2 ng ml 故LoB 0 8ng ml 表2 秩号 n 2 n m 代表不同低浓度样品的自由度 式中n 1 LoD LoB C SD S C 是标准正态分布第95百分C 1 645 1 1 4f f 是SDs 位数值的校正因子 的自由度 若低浓度样品检测结果不呈正态分布 或不能按非参数方法估计LoD 计算公式转化为正态分布 如下 LoD LoB D S D S 是低浓度样品测定中位数和第5个百分位数值的间距 1 7 4 定量检测限 LoQ 依据临床要求和室间 质量评价的允许误差 设定本实验室AFP 的总误差在不考虑分析偏差的条件下 总误差目标为20 2CV 如果低浓度样品的CV 1 2总误差 则LoQ LoD 22 1 结果 检测低限 LLD 批次 60个空白值中最高的10个值 ng ml 空白值0 50 60 60 60 8 秩号 空白值0 80 80 80 81 0 2 5检出限 LoD 低浓度样品测定结果见表3 60个低浓度样品检测结果呈非正态分布 使用非参D S 数程序估计LoD 即 LoD LoB D S 是低浓度样品测定值中位数和低浓度样品的第5个百分位数值的间距 低浓度 样品中位数 3 20 第5百分位数的值 60 0 05 0 5 第3 5秩号的值 1 40 D S 故LoD LoB 3 20 1 40 1 80 D S 0 80 1 80 2 60ng ml 表3 1 101 601 701 302 102 302 501 401 202 601 50 低浓度AFP 样品测定结果 ng ml 1 651 802 101 602 801 801 902 901 402 201 90 2 202 703 002 502 803 202 902 501 802 503 30 3 303 503 904 103 904 403 903 203 203 703 70 4 904 205 104 804 604 904 604 304 305 204 90 5 506 205 505 505 705 905 805 205 905 905 50 空白样品10次重复测定光 A 空白为1997 9 强度值 RLUs 的均值珔标准差 s 为 126 按99 7 的可信限 空白样品RLUs 的3s 为378 5 50ng ml检测限样本的RLUs 为2088 RLUs 为378时相当于 LLD 378 2088 5 50 1 00ng ml 所以本法的LLD 为1 00ng ml 2 2 生物检测限 BLD 2 20ng ml实验样品的 RLUs 减3s 后RLUs 为384 刚大于378 故本法的生物检测限为2 20ng ml 结果见表1 表1 低浓度样品AFP ng ml 测定的RLUs 结果及生物检测限 1 10 RLUs X A 空白s CV x 3s 珋 9 27 1 5165 2 3384 3 2885 4 71342 5 31754 2 6定量检测限 LoQ 本实验室依据临床需求 及权威机构规定的分析质量要求设定化学发光免疫法检测AFP 的总误差目标为20 在不考虑分析偏允许总误差 TEa 2CV 即CV 1 差的情况下 2TEa AFP 浓度在3 30ng ml时检测的日间CV 为9 56 刚好小于10 符合质量目标要求 因此LoQ 3 30ng ml 结果见表4 表4 化学发光法测定低浓度AFP 样品 ng ml 的日间CV 1 10 x ng ml 珋 s ng ml CV 1 820 4926 78 1 652 040 4622 48 2 202 720 4115 05 3 303 750 369 56 4 904 670 306 50 5 505 710 274 79 2 3功能灵敏度 FS 以日间CV 为20 时对应 2 20ng ml浓度低浓度样品具有的平均浓度为FS 的实验样品日间CV 为19 3 最接近20 故FS 为2 20ng ml 结果见表1 2 4 空白限 LoB 空白样品的检测结果呈非正 态分布 故用非参数程序估计LoB 即估计第95百LoB N B 100 0 5 分位数 Pct B 的值 60 95 100 0 5 57 5位置的结果 即第57 松柏 3讨论 Petersen Gregori Casals 国内外相关报道中 郑 4 8 等分别对化学发光免疫检测系统检测不同 临床检验杂志2010年11月第28卷第6期Chin J Clin Lab Sci Nov 2010 Vol 28 No 6 471 BLD 和FS 进行确定或验证 项目的LLD 本实验以AFP 为例对LLD BLD 和FS 的研究结果与文献 4 5 报道的结果基本一致 证实了厂商声明的性能 A 方案建立的LoB 本实验结果显示 用EP17 为0 8ng ml 低于仪器说明书声明的灵敏度1 3ng ml LoD 为2 60ng ml LoQ 为3 30ng ml 即该检测系统在符合质量要求下能可靠地检出AFP 的最低实际浓度为3 30ng ml 本实验室用该检测系统检测AFP 结果报告时 若AFP 结果低于0 8 分析物未检出 ng ml 则报告浓度小于0 8ng ml 若AFP 检测结果高于0 8ng ml小于2 60ng ml 有分析物检出 则报告但不能准确定量 浓度小于2 60ng ml 若AFP 检测结果高于3 30ng ml 则直接报告检测结果 临床医生可放心使用浓度高于3 30ng ml的AFP 结果 两种灵敏度评价方法主要有以下区别 9 能符合临床的质量需求 5 目前所有的试剂厂商在试剂说明书中只提供了按 常规方法检测得出的检测低限 没有提供必须满足实验室质量要求的定量检测限以 及在接近定量检测限处的不确定度 厂商A 文件对检测系统所有检验项目的检若参照EP17 实验数据的收集和测低限和定量检测限进行确定 统计学处理科学严谨 可以方便临床实验室通过简单的程序对其建立的检测限 值及不确定度进行验证和确认 A 文件建立LoD 和LoQ 是综上所述 用EP17 评价化学发光免疫检测系统灵敏度性能的标准方法 可更好地为临床提供准确可靠 的AFP 低浓度结果 为临床诊断 治疗监测提供重要信息 但成本较高 常规方法操作简便 成本较低 若数据呈正态分布 也具有较高的应用价值 国内实验室可视具体情况 选择不同的评价方案 4 参考文献 1 常规方法确定化学发光免疫检测系统检测AFP 的LLD BLD 和FS 的空白样品检测数为10次 低浓度A 方案要求确定LoD 的样品检测数为10次 EP17 最小检测数为60次 样品重复检测的次数多 估计的LoD 不确定度较小 结果更可靠 2 参照常规方法确定化学发光免疫检测系统检测AFP 的LLD BLD FS 均使用光强度值 RLUs 来计算 但目前实验室部份仪器存在局限性 即只能报告分析物的浓度 而没有原 始的分析信号 所以常规方法不适用于实验室对所有仪器的灵敏度进行评价 参照E P17 A 文件进行化学发光免疫分析系统检测AFP LoD 和LoQ 的LoB 直接使用检测出的分析物浓度进行计算 符合实验室的实际情况 统计分析输入检 测数据时简便易行 3 常规方法对灵敏度性能评价均假设实验数据呈正态分布 使 用参数的程序进行估计 但实际中大部份实验数据均呈非正态分布 EP17 A 方案可以弥补常规方法的不足 可根据实验LoD 数据分布选择参数或以非参数程序确定LoB 4 常规方法确定生物检测限只是考虑了样品单次检测的信号有95 或99 的可能 性 这样的低值结A 方案考虑果有很大误差 影响了临床应用 EP17 了分析物在低水平处的偏倚与不精密度 以检验的充分保证了低浓度检测结果允许 误差来估计LoQ 1 2006 02 07 中国卫生部 医疗机构临床实验室管理办法 Z 2 ISO DIS15189 2 2007 医学实验室 质量和能力的要求 S 2007 中国国家实验室国家认可委员会 3 EP17 A Protocols for Determination of Limits of Detection and Lim its of Quantitation Approved Guideline S NCCLS 2004 1 39 4