植物花青素基因的克隆及应用.doc

植物花青素基因的克隆及应用文献综述3包满珠(华中农业大学林学系,武汉430070)提要评述了近十年来有关植物花青素的基因克隆研究进展及其应用前景。植物花青素代谢途径及其主要酶类的作用之研究已较为成熟,一大批调控植物花色的结构基因与调节基因已被克隆。利用外源基因导入、反义基因及共抑制原理已培育出了新色系观赏植物品种。用基因工程的方法培育蓝色月季的工作正在进行。利用结构基因和调节基因为创造新花色、植物体彩化、植物生长发育及研究植物的花青素代谢等开辟了广阔前景。关键词花青素;结构基因;调节基因;克隆;应用色彩是观赏植物最重要的特征之一。传统的杂交育种及定向选择在色彩育种中做出了重大贡献。但是,传统育种有其局限性,在改变某一性状的目标育种中,难免伴随着其它性状的改变,从而使育种周期较长,效率较低。基因工程为修饰和改良植物性状提供了巨大的潜力和优越性,因而在近十年来一直是国际上研究的热点。通过世界各国科技工作者的努力,在观赏植物花色、植物体形态、花态、花香及延长瓶插寿命等方面取得了重要进展1 、30 、31。现就其中花青素代谢的结构基因与调节基因的克隆进展及其应用前景作一评述。1 植物花青素基因的克隆对花色素苷合成的遗传学研究起始于孟德尔对豌豆花色的遗传研究。早期的研究是将基因位点与易于观察的色彩变异联系起来进行。近60 年来,对花色素代谢的遗传学和生物化学进行了全面而深入的研究。在花色素苷及其它类黄酮物质的结构确定之后,才将单一基因与相应的花色素苷对应起来。目前的研究主要围绕着花色素苷基因的突变进行。玉米、金鱼草、矮牵牛等是研究植物花色素苷代谢途径并分离基因的重要物种。本世纪80 年代末90 年代初,对植物的花色素苷代谢途径研究已较为成熟16。影响花色素苷代谢的基因分为结构基因和调节基因。结构基因直接编码花色素苷代谢生物合成酶类,调节基因控制结构基因表达的强度和程式。目前已有一些结构基因和调节基因被分离和克隆出来。1. 1 结构基因克隆利用蛋白质纯化、转座子标签、PCR 及鉴别筛选(differential screening) 等手段已从矮牵牛、玉米、金鱼草中分离并克隆了许多结构基因,其中从矮牵牛中分离的最多20。世界上第一例类黄酮生物合成基因是1983年采用鉴别筛选与杂交筛选相结合的方法从 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 欧芹中分离出来的22,两年之后,以欧芹CHS 基因为探针进一步分离出了矮牵牛CHS 基因38。1987 年CHI 基因首先从法国豌豆(French bean) 中利用抗体技术分离出来27,一年之后从矮牵牛中用抗血清方法分离出来43。1991 年利用鉴别筛选和基因图谱相结合的方法从金鱼草中分离出了F3H 基因25,之后采用酶纯化方法从矮牵牛中分离出了该基因3,1993 年又以矮牵牛F3H 基因为探针从香石竹、翠菊和紫罗兰中分离出了F3H 基因4。1993 年,利用PCR 扩增技术从矮牵牛中分离出了F35H 基因18。1985 年采用转座子标签技术从玉米和金鱼草中分离出了DFR 基因33,1989 年以金鱼草DFR 基因为探针分离出了矮牵牛DFR 基因2。1990 年采用转座子标签技术从玉米中分离出了ANS 基因28,之后又先后从金鱼草和矮牵牛中分离出此基因25 、44。3GT 基因是1984 年采用转座子标签技术从玉米中分离而来12 、14,1991 年以此基因为探针又从金鱼草中分离出3GT 基因25。AMT基因也已于1993 年被克隆37。1. 2 调节基因克隆调节基因克隆主要采用转座子标签技术,在已有基因分离的基础上,后来的分离工作大多以已有的基因为探针来进行。目前已从玉米、金鱼草、矮牵牛的不同位点分离出了一些不同的基因20。目前克隆的此类基因多数来自玉米。自1988 年首次分离出了R 基因以来11,又先后分离出R 族的其它基因S、Sn 和Lc24 、36 、40。除此之外,又先后分离出其它调节基因B、C1 、Pl 和Vpl 等基因5 、7 、8 、26 、34 、35。1992 年Goodrich 等从金鱼草中采用转座子标签技术分离出了Del 基因17,1994 年Quatt rocchio 等从矮牵牛中分离出An2 、An4 两个基因37。有趣的是R、Sn、Lc 和B 基因之序列相似,C1 和Pl 基因也属同源;Del 基因与玉米R 族基因序列高度相似;An2 基因之序列又与玉米的C1 和Pl 基因高度相似。由此可见,不同物种中花青素的生物合成由相似的因子介导。2 结构基因与调节基因在植物花色育种上的应用2. 1 直接导入外源结构基因以改变花色对于单基因控制的花色,如果某物种或品种本身缺乏该基因,可直接导入外源结构基因改变其花色。世界上第一例基因工程改变矮牵牛花色的实验便采用此法29。将玉米DFR基因导入矮牵牛RL01 突变体后,使二氢堪非醇还原,从而提供了天竺葵色素生物合成的中间产物,使花色变为淡砖红色,创造了矮牵牛的新花色系列。荷兰S &G 种子公司将玉米DFR 基因导入矮牵牛之后,将转基因植株自交,培育出了鲜橙色矮牵牛30。用同样的原理,将非洲菊和月季DFR 基因转入矮牵牛,得到了与此相似的植物花色变异39。2. 2 利用反义基因和共抑制原理改变植物花色反义基因方法是将某一基因反向插入植物表达载体,然后导入植物体内,这种“错误”的DNA 转录成RNA 之后,与内源的互补mRNA 结合,使mRNA 不能合成蛋白质,进而形成花色的突变。1988 年荷兰自由大学在世界上首先采用此法获得了矮牵牛花色变异新品种。他们将编码CHS 的结构基因反向导入矮牵牛植株之后,使转基因植株表现出不同程式的花色变异42。Courtney2Gutterson 等采用此法使菊花园艺品种花色得到一定程度变异9。Elomaa 等将反义CHS 导入非洲菊之后,也使非洲菊的花瓣不能正常着色13。280园艺学报24 卷 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 1990 年美国和荷兰的科学家发现,当植物体内导入的结构基因不止一个拷贝时,往往引起转基因植株内源基因的抑制32。Napoli 等32、Van der krol 等42、Jorgenson21及VanBlokland 等41的研究表明,当CHS 有多拷贝导入植物体内时,植株的内源CHS 便局部或全部不能表达,从而形成白色花或图案变化十分丰富的彩瓣花。Van der Krol 等42同时研究了DFR 基因的这种共抑制现象。Courtney2Gutterson 等9利用共抑制原理将菊花CHS 基因导入菊花园艺品种之后,色彩也有了类似的变异。由此可见,共抑制原理在花色的基因工程中具有重要意义。2. 3 导入调节基因使植物内源基因活化而改变花色当植物体内本身含有花色素代谢的结构基因,由于组织特异性或缺乏调节基因表达产物的激活而不表达时,可通过导入调节基因并使其适当表达而改变植物花色。Lloyd 等23将玉米调节基因C1 和R 导入烟草和拟南芥之后,使两个物种的白色花冠都不同程度地着色变粉。Quatt rocchio 等37将一系列花青素代谢的调节基因转入矮牵牛之后,得到红色的愈伤组织、粉红色花冠。包满珠等将C1 和Lc 基因转入矮牵牛之后,部分转基因植株的花冠筒由白色变为粉色。可见,利用调节基因也能改变植物的花色。2. 4 多基因控制花色的综合调控在众多的观赏植物中,蓝色花普遍偏少。尤其是常用切花香石竹、郁金香、月季等都缺乏蓝色花系。日本大阪Suntory 有限公司和澳大利亚Calgene Pacific 股份有限公司目前正联手进行蓝色月季花的分子育种19。要育成蓝色月季花需要同时具备三个条件:即翠雀素的合成,黄酮醇共染剂和较高的pH 值30。最近,Holton、Chuck 等在分离蓝色基因中取得了重要进展6 、19 、20。共染剂的存在可以加深蓝色。De Vlaming 等10在矮牵牛中确定了花瓣细胞内控制pH 值的6 个基因ph1ph6 ,Chuck 等6将ph6 基因进行了克隆。由此看来,用基因工程的方法培育蓝花观赏植物已有了可行性。3 花色素代谢相关基因的其它应用3. 1 利用调节基因改变植物体色彩如前所述,调节基因的导入不但使花冠色彩发生变化,而且使幼叶及其它组织也发生色彩变化37,为植物的叶色、果色甚至枝条色彩的改变提供了技术可行性。在综合运用结构基因和调节基因的基础上,选用具有器官特异性的启动子,完全可能在未来实现植物体彩色化。3. 2 利用结构基因与调节基因研究植物花色素代谢途径及植物发育通过遗传转化的方法,根据所转移的结构基因与调节基因,可以分析推测某一物种的花色素代谢途径,揭示某一花色的缺失是植物体内根本没有此合成途径或内源基因不能活化所致。调节基因的导入在一定程度上影响植物的其它性状21,从而从一个侧面研究植物的发育。3. 3 利用花青素基因研究基因间的互作原理花青素代谢调控基因表达的结果使植物细胞内花色素积累,在外观上表现出色彩的变化。因其易于观察,可用其研究植物基因的表达及相互作用,尤其是研究基因共抑制、转基因静息(silence) 等转基因植株可能出现的重大问题15 、41。3 期包满珠:植物花青素基因的克隆及应用文献综述281 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 3. 4 调节基因是最为方便的植物遗传转化报告基因在众多的植物遗传转化报告基因中,花青素代谢调节基因是最方便的一种。将其导入植物细胞之后,细胞会变成红色,用一般的解剖镜甚至肉眼即可观测,无需进行组织化学测试而杀死植物组织。目前,这些基因已被广泛应用到单子叶植物遗传转化条件的优化上。4 展望有关花青素代谢相关基因的分离和克隆一直是研究的热点。虽有一大批基因被成功地克隆,但许多重要的基因如ATT 基因5GT 基因尚未分离。目前,利用物种的遗传突变体和遗传图谱,通过遗传互补和基因抑制可以有效地鉴定基因功能。PCR 技术的应用和已分离基因作为探针的应用都在一定程度上加速了基因分离的进程。将来有关花青素代谢的调控基因会更加完备。目前的研究主要集中于花青素,而对类胡萝卜素等其它色素的研究相对较少,使黄色系的观赏植物新品种培育受到限制。在深入研究花青素代谢调控的同时,未来的研究势必要向其它色素代谢的分子调控方面发展。现代观赏植物绝大多数具有良好的组织培养体系,加之其中许多是双子叶植物,遗传转化相对较为容易。利用花色素代谢的结构基因和调节基因,对观赏植物的色彩改良具有十分广泛的前景。而且,随着对这些基因功能的进一步研究,其应用的范围也将会进一步研究拓宽。参考文献1 傅荣昭、马江生、曹光诚、李文彬、崔勇如,1995 ,观赏植物色香形基因工程研究进展。园艺学报,22 (4) :3813852 Beld ,M. ,Martin ,C. ,Huits ,H. ,et al ,1989 ,Flavonoid synthesis in Pet unia hybri da :Partial characterization of dihydr2oflavonol24 reductase genes. Plant Mol. Biol. ,13 :4915023 Britsch ,L. ,Ruhnau2Brich ,B. and Forkmann , G. ,1992 ,Molecular cloning ,sequence analysis ,and in vitrol expression offlavanone 32hydroxylase from Pet unia hybri da. J . Biol. 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