植物抗寒基因工程研究进展.doc

植物抗寒基因工程研究进展温度是影响植物分布、产量及品质的重要环境因素,提高植物抗寒性对农业生产具有重要的意义.近年来,随着基因工程的发展,对植物的抗寒机理进行了深入的研究,并克隆了许多与抗寒相关的基因.本文从膜稳定性、抗氧化酶活性、抗冻蛋白、低温信号转录因子和渗透调节物质等方面对植物耐冷性基因工程研究进展进行了分析、归纳与总结,旨在为植物抗寒机理研究及植物抗寒育种提供参考.关键词:植物抗寒性,基因工程,抗寒育种植物生长发育过程中,温度作为一个重要的环境因子对其生长、生殖和分布起着关键的作用.低温不仅在很大程度上限制植物的种植范围,同时还会造成减产和品质下降,严重时甚至绝收.全球每年因低温伤害造成的农作物损失高达数千亿元1,因此,植物抗寒性研究及抗寒育种一直是植物学研究领域的热点之一.目前选育耐低温植物品种主要采用常规杂交育种的方法,即利用抗冷性品种与各种生态类型的不抗冷品种杂交,通过混合轮回选择,获得抗冷品种.经过长期研究,育种工作者已育成了不少抗寒新品种,对避免和减少冷害损失起到了重要作用.但是利用常规育种方法存在抗冷性资源不足、选择周期长、费用高等局限性,严重影响育种目标的实现,很难满足生产上对抗寒品种的迫切需要.现代生物技术的迅猛发展为最终解决植物的抗寒性展现了良好的前景.利用现代分子生物学技术,人们已从植物中克隆出众多参与植株耐低温能力形成的基因,研究和分析这些基因的功能,对于揭示植物抗寒的分子基础,加速植物抗寒育种具有重要意义.本文就近年来国内外在植物抗寒基因工程方面的研究进展进行了分析与归纳,旨在为人们进一步认识和利用植物抗寒相关基因提供参考.1膜稳定性相关基因生物膜是植物细胞及细胞器与周围环境间的一个界面结构,它能够接受和传递环境信息,对环境胁迫做出反应.同时,生物膜对保持植物正常生命活动也具有重要的作用2.研究表明,生物膜是低温冷害作用的首要部位,而且低温伤害的原初反应发生在生物膜系统类脂分子的相变上3.早在20世纪70年代,Lyons4就提出“膜相变的寒害假说,认为植物正常生理活动需要液晶相的膜状态,在遭受低温伤害时生物膜首先发生膜脂的物相变化,这时膜脂从液晶相变为凝胶相,膜脂上的脂肪酸链由无序排列变为有序排列,膜结合酶的活力降低,且膜上出现孔道或龟裂,使膜的通透性增大,膜内可溶性物质大量向膜外渗透,破坏了细胞内外的离子平衡.同时膜结合酶结构改变,酶促反应速度失去平衡,导致植物细胞生理代谢变化和功能紊乱,从而使植物细胞受到伤害.许多研究表明,膜脂中的类脂和脂肪酸成分的不饱和度明显影响膜脂的相变温度.一般认为,膜脂不饱和脂肪酸含量增高,膜脂相变温度会降低,增加了膜的流动性,从而使植物的抗寒性相应提高.反之,冷敏感植物的膜脂相变可能是由于膜脂脂肪酸的不饱和程度较低,低温下膜脂由液晶相向凝胶相转变,造成细胞膜膜相分离,从而引起细胞代谢紊乱527.近年来,应用基因工程技术导入脂肪酸去饱和代谢关键酶基因,通过降低脂肪酸的饱和度以提高植物抗寒性的研究,已经取得了突破性的进展8,9.日本国立基础生物化学研究所首先利用脂肪酸去饱和酶基因进行了植物抗寒性的分子改良.1993年,High等10筛选了一个膜脂不饱和脂肪酸突变蓝藻(SynechocystisPCC6803)菌株fad12,并克隆了12去饱和酶基因desA,研究表明desA基因的表达是由于低温首先降低了膜脂的流动性,刺激desA的转录,使膜脂不饱和度增加,从而增加膜脂的流动性.Los等11发现,蓝细菌在低温胁迫过程中,desA基因的表达水平在1h内就增加10倍,抗寒性得到提高.Kodama等12将从拟南芥中克隆的叶绿体23脂肪酸去饱和酶基因(FAD7)导入烟草中进行表达,转基因烟草中十六碳三烯酸和十八碳三烯酸含量提高,其前体物质相应减少,在l低温下表现出明显的抗寒性.Ariizumi等13将FAD7基因导入水稻中,获得的转基因植株不仅增强了抗寒性,而且也提高了低温下的光合速率和生长速率.除了FAD7基因外,Gibson等14从拟南芥中分离得到另一个受低温诱导的脂肪酸去饱和酶基因FAD8,编码合成叶绿体23去饱和酶,它与FAD7基因具有75%的核苷酸同源组成,两者的叶绿体23去饱和酶能够彼此功能互补,共同催化膜脂中脂肪酸的去饱和.此外,John等15又从蓝细菌和高等植物中克隆了分别编码6、9以及23酰基酯去饱和酶的基因desD、desC和desB,这些基因均具有冷调节特性.Ovkova等16将从蓝细菌中克隆的9去饱和酶基因des9转入烟草后,转基因烟草叶片中不饱和脂肪酸的含量和植株低温耐受性均有很大的提高.Kwon等17克隆了辣椒(Capsicum)叶绿体23脂肪酸去饱和酶基因,而且在辣椒基因组中存在一个小的基因家族,该基因在叶片中表达而在根中不表达,当叶片受到伤害时转录量迅速提高,并且随后亚麻酸的含量提高.脂酰甘油(PG)具有较多的饱和脂肪酸,是决定膜脂相变的主要因素.而甘油232磷酸酰基转移酶(GPAT)又是PG生物合成过程中的第一个酰基酯化酶,对决定植物膜PG的不饱和度起关键作用18.目前已获得多种植物GPAT基因的cDNA或基因组DNA片段.1992年Murata等19将冷敏植物南瓜的GPAT酶基因转至烟草,植株膜脂脂肪酸饱和度增加,相反转移抗冷植物拟南芥的酰基转移酶基因,能够使烟草内囊体PG的脂肪酸组成趋向不饱和,烟草植株抗寒性大大提高.Wolter等20将GPAT基因导入烟草和拟南芥,结果改变了其体内磷脂酰基甘油的脂肪酸组成,提高了其不饱和度,增强了抗寒性.Ariizumi等13将拟南芥和菠菜的AGPAT和SGPAT基因分别转化水稻,T1代植株叶片内磷脂酰甘油的顺式不饱和脂肪酸含量均明显高于野生型;同时转基因植株的鲜重也明显高于对照.Yokio等21将拟南芥的GPAT基因导入水稻中,结果提高了叶片叶绿体膜上PG的不饱和脂肪酸含量,从而增强了水稻的抗寒性.由以上论述可见,利用生物技术的方法改变植物体内脂肪酸代谢途径,增加不饱和脂肪酸含量,可提高植物的抗寒性.2抗氧化酶活性基因大量研究表明,植物在低温胁迫过程中,对O2的利用能力降低,多余的O2则在代谢过程中被转化成对植物有毒害作用的活性氧(ROS),打破体内活性氧平衡,从而引发或加剧膜脂过氧化作用,降低膜脂的不饱和度,并可引起膜蛋白的聚合及变性,导致膜脂流动性降低,膜通透性增强,生物膜受损22.一定范围的低温胁迫下,植物可以动员其自身抗氧化防御系统清除自由基,调节膜透性及增加膜的结构和功能稳定性,减少细胞伤害.但是这种自身保护具有一定的限度,超出某一范围即会成为不可逆的伤害,最终致使整株死亡.植物抗氧化防御系统由包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和谷胱甘肽还原酶(GR)等组成23,24.低温胁迫下这些物质协同作用以去除植物体内的活性氧自由基,其中尤以SOD最为重要,它是植物体内第一个清除活性氧的关键抗氧化酶25.近年来,利用基因工程技术通过转入抗氧化酶基因来提高植物抗寒性已成为研究的热点.McKersie等26将烟草中克隆的Mn2SOD的cDNA置于35S启动子下转化到苜蓿的线粒体和叶绿体等细胞器中,提高和增强了转基因植株中超氧化物歧化酶的含量和活性,并经大田试验发现大大提高了转基因植株越冬存活率,同时还增强了对除草剂二苯乙醚的抗性,除草剂对植株的生长抑制明显减轻.低温造成烟草株高、叶片数和生物量显著下降27.Gupta等28将豌豆的Cu/Zn2SOD基因导入烟草中,发现转基因植株的叶绿体中SOD基因超量表达,同时也提高了APX的活性,从而增加了烟草抵抗低温引起光抑制的能力,提高了转基因植株对冻害的耐受力.Allen等29将SOD基因转入烟草中,增强了烟草的抗氧化能力;将其转入棉花,也增强了转基因棉花植株对低温逆境的抗性.Samis等30将Mn2SOD基因导入紫花苜蓿,不仅提高了转基因植物的膜稳定性,同时还增加了植物的生物量.此外,APX和谷氨酰胺合成酶与植物的抗寒性也有关系.Sato等31报道,热激处理水稻幼苗后可诱导APXa基因的表达,使APX活性升高,从而提高水稻幼苗的抗寒性.Liorente等32从水稻基因组中克隆了与POD活性有关的冷诱导基因RCI3,该基因不仅对低温有很高的耐受性,而且对水分和盐胁迫也有很好的耐受性.说明利用基因工程手段将抗氧化酶基因转入植物中,清除植物在低温胁迫过程中产生的对植物有毒害作用的活性氧物质,能够提高植物的抗寒性.3抗冻蛋白基因抗冻蛋白(antifreezeprotein,AFP)是一类具有热滞效应和冰晶生长抑制效应的蛋白质,能以非线性形式降低水溶液的冰点,但对熔点影响甚微,从而导致水溶液的熔点和冰点之间出现差值,它们在受低温环境胁迫时能使有机体抵御冰冻环境33.抗冻蛋白最早是在极地海鱼中发现的,在鱼类和昆虫类中研究比较深入,目前已有将这类基因转入植物的报道.黄永芬等34采用花粉管通道法及子房注射法将美洲拟鲽afp基因导入番茄,田间抗寒性实验表明,在春季平均气温低于正常年份4.4的条件下,转基因植株生长优于对照,致死温度也比对照降低了2.对植物AFP的研究较晚,1992年,加拿大Griffith等35首次报道从经过低温锻炼可忍受细胞外结冰的冬黑麦中发现了植物内源性AFP,标志着植物抗冻蛋白研究的开始,随后已从多种植物中获得具有热滞效应的AFP36.1997年Wallis等37将植物凝集素基因和AFP基因共同构建到植物转化载体pKY2LX35S中,之后在转化马铃薯中发现,在-2条件下,非转基因马铃薯叶片的电渗值比转基因马铃薯叶片的高2倍多,而且非转基因植株遭受到了严重的冻害.Worrall等33从冷诱导的胡萝卜中纯化出一种分子量为36kD的AFP,并克隆了它的基因,之后将AFP基因导入烟草,所获得的转基因烟草提取物能抑制冰晶生长,而且转基因植株的抗冻性明显高于对照.1999年,Meyer等38采用CaMV35S启动子,用农杆菌介导胡萝卜AFP基因重组子转化拟南芥,转基因植物提取液有明显的抗冻活性,能够修饰冰晶形态,表明抗冻活性与AFP基因转录水平呈正相关.2001年,尹明安等39克隆了胡萝卜AFP基因,并构建了其植物表达载体,为进一步利用其转化番茄、甜椒等作物奠定了实验基础.Huang等40将树状抗冻基因DAFP21转入拟南芥,转基因植株的抗冻性和对照植株相比提高了0.63.3.王艳等41将准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白基因MPAFP149转入烟草中,-1处理48h,发现转基因烟草的相对电导率和表型明显优于野生型烟草.室温恢复试验验证表明,转基因烟草可存活并恢复生长,而野生型烟草受到了不可逆的低温冻害.抗冻蛋白的发现为植物抗寒性研究提供了一条新的途径,这类蛋白质具有高度的亲水性和热稳定性,能够保护植物细胞免受低温伤害.但是目前从植物中分离克隆并能够用于转化的植物抗冻蛋白基因并不多,因此今后关于植物抗冻蛋白基因的分离克隆将是植物抗寒基因工程研究的一个热点.4低温信号转录因子植物在遭受低温胁迫时,从感受低温信号到发生一系列生理生化反应和调节基因表达,进而产生抗寒能力,存在一个复杂的信号网络传导系统,CBF(CRT/DRE2bindingfactor)转录因子调控的信号传导途径是其中的一个传导系统,其传导途径为:CBF转录因子CRT/DRE基序COR基因表达植物抗寒性增加,即转录活性因子CBF结合到CRT/DRE基序上,诱导了COR基因表达,从而提高了植物的抗寒性42.1997年,Stocking等43首次从拟南芥中分离鉴定出一种编码转录因子的cDNA,这种转录因子能识别COR基因中的CRT/DRE元件并与之结合,故命名为CBF1(CRT/DREbindingfactor1),即CRT/DRE结合因子.将CBF1蛋白基因转入未经冷驯化的拟南芥中,大量表达后能诱导冷诱导基因在常温下表达,增强了拟南芥的抗寒能力.后来人们发现拟南芥CBF1基因属于一个包括CBF1、CBF2、CBF3、CBF4、CBF5和CBF6基因在内的CBF基因家族44246,该基因家族成员均具有提高植物抗寒性的功能.甄伟等47将CBF1基因转入烟草和油菜基因组中,对转化的烟草和油菜抗寒性的检测结果显示,转基因油菜的抗寒性有明显提高,转基因烟草的抗寒性也有一定提高.Hsieh等48将拟南芥的CBF1转入番茄,转基因番茄叶片中的过氧化氢酶的活性比对照显著提高,H2O2含量比对照明显降低,转基因植株的抗寒性得到显著改善.韦善君等49将玉米泛素启动子(Pubi)调控的CBF1基因转化烟草,发现CBF1组成型表达增强了转基因烟草的抗寒性.金建凤等50将CBF1基因转入水稻中,发现低温处理后转基因植株体内脯氨酸含量比野生型明显增加,植株的抗寒性也明显增强.金万梅等51利用根癌农杆菌介导的方法将拟南芥CBF1基因导入草莓中,提高了草莓对低温胁迫的抵抗力.拟南芥CBF3基因的过量表达也能够提高植株耐低温胁迫的能力,并且导致许多与低温胁迫有关的生理生化变化,影响脯氨酸和糖的代谢52.Song等53成功地将外源CBF3基因转入水稻,提高了转基因植株对逆境胁迫的抗性.Haake等46CBF4基因转入拟南芥中,并利用35S组成型启动子使其过量表达,结果使CBF4转基因拟南芥的抗寒性和抗旱性都大大提高.植物抗寒性是由多基因控制的性状,往往需要一系列相关基因的共同表达才能提高植物的抗寒性.目前虽然还不知道利用基因工程手段将低温信号转录因子基因转入植物中诱导了哪些基因的表达,但是在植物抗寒育种中转入该类基因比转入单个抗寒基因的应用前景更为广阔.5渗透调节基因在渗透胁迫过程中,植物体内会产生一些具有保水作用的渗透调节物质来降低植物体内的水势,从而维持体内的水分平衡.这类渗透调节物质有脯氨酸、甜菜碱、可溶性糖和醇类物质等.低温胁迫时,植物通过诱导渗透调节物质的生物合成酶基因的大量表达,以增加这类物质的积累,维持渗透压的平衡,从而避免低温伤害.脯氨酸是水溶性很大的氨基酸,具有较强的水合能力.在植物受到低温胁迫时,脯氨酸的增加有助于细胞的持水,防止水分散失,起到渗透调节作用.Nanijo54将脯氨酸脱氢酶(脯氨酸降解关键酶)反义基因AtproDH的cDNA转入拟南芥,很好地抑制了脯氨酸脱氢酶的产量,提高了胞内脯氨酸水平,增强了植物对低温和高盐的耐受性.甜菜碱是另一类常见的渗透调节物质,其化学性质与脯氨酸相似,它一方面通过与蛋白质的相互作用保护生物大分子在高电解质浓度下不变性,另一方面又可以作为渗透平衡物维持细胞的膨压55.Pilon2Smits等56将从细菌(Arrhobacterpasceus)中克隆的胆碱氧化酶COX基因(甜菜碱合成途径中的重要代谢酶)转入拟南芥、烟草和油菜中,获得了高甜菜碱水平的转基因植株.同时,Pilon2Smits等还发现转化植株甜菜碱的积累有助于种子吸胀萌发及幼苗早期生长对低温的忍耐.Su等57将从细菌中克隆到的COX基因转入到水稻后,发现提高了转基因水稻叶片中甜菜碱的浓度,转基因植株对盐和低温有较强的忍耐性.Kumar等58将甜菜碱醛脱氢酶BADH基因(甜菜碱合成途径中的另一重要代谢酶)转入胡萝卜后,发现转基因植株对低温和盐胁迫的能力明显增强.果聚糖是一种多聚果糖分子,因其良好的水溶性而具有调节渗透压的功能59.Huang等60将杆菌(Bacillussubtilis)编码果聚糖的基因SacB转入烟草,结果转基因烟草表现出比对照更强的抗渗透胁迫能力;王关林等61将从枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)中分离克隆的果聚糖合酶基因SacB导入番茄中,抗冻实验结果证明,转果聚糖合酶基因的番茄具有良好的抗寒性.随着分子生物学的发展,许多与渗透调节物质代谢有关的基因被克隆,将这些基因导入植物中,增加这类渗透调节物质在转基因植物中的含量,以提高