体内药物分析1.doc

体内药分翻译体内药分翻译 年级 年级 20102010 级级 专业 专业 药物分析药物分析 学号 学号 201040047201040047 姓名 姓名 付云飞付云飞 LC MS MSLC MS MS 法对人血浆中唑类抗真菌药物的监测法对人血浆中唑类抗真菌药物的监测 J W C Alffenaar A M A Wessels K van Hateren B Greijdanus J G W Kosterink D R A Uges Department of Hospital and Clinical Pharmacy University Medical Center Groningen University of Groningen PO Box 30 001 9700 RB Groningen The Netherlands 摘要 摘要 微生物 真菌会侵袭免疫系统受损的病人 唑类抗真菌药物可用于预防和治疗这一 类的感染 因此在过去的几年里对唑类药物监测的关注度逐步增加 并且要根据个 体间差异 药物的相互作用 血药中毒浓度和治疗的成功性来制定唑类药物的监测 频率 因此快速精确的分析方法是很必要的 这种方法是用沉淀蛋白法处理血浆样 品 再利用 LC MS MS 进行监测血药浓度 并已根据食品药品监督管理居生物样品鉴 定方法的指导原则进行了方法的确证 对临床范围内的人血清中四种常用的唑类药 物的定量下限的监测可得到很好的准确度和重现性 对于日间和日内的准确度和重 现性的考察也得到了很好的结果 快速 敏感 精确的 LC MS MS 法已经建立起来 并且应用于人血浆中伏立康唑 氟康唑 伊曲康唑 泊沙康唑的监测 这种新的方 法很适合于临床药物代谢动力学的研究及常规日常的检测中 关键词 关键词 LC MS MS 治疗性药物的监测 药物代谢动力学 唑类抗真菌药物 常规 1 1 前言 前言 侵入式真菌感染针对免疫系统受损的病人 唑类抗真菌药物 如伏立康唑 氟康唑 伊曲康唑 泊沙康唑 在预防和治疗这类真菌感染拥有了很坚固的地位 伏立康唑用于预防和治疗念珠菌病 同时氟康唑用于治疗曲霉菌病的感染及抗伏立 康唑的念珠菌感染 伊曲康唑和泊沙康唑均用于对抗曲菌酶念珠菌并且课用于真菌 感染的预防 泊沙康唑还可用于治疗接合菌病或是曲霉菌病的补救治疗 从唑类抗真菌药物的药物代谢研究中可以发现其中存在着很大的个体内和个体 间的差异性 这种差异性可以部分的解释为非线性药物代谢 生物利用度差异 药 物之间的相互作用 及细胞色素 P450 的多态性 直到观察性研究表明血浆内唑类药 物的浓度与效力和毒性之间的关系 才使得这种差异所造成的临床影响被人们所认 识 对于这种唑类药物的治疗性监控因此而得以保证 在过去的很多年里 对于唑 类药物的治疗性的监控在逐步的形成 并且现在已经达到了在监控下病人的剂量可 以迅速改变的程度 对于血浆范围内的唑类抗真菌药物的监测 需要一种普遍的可 用于高通量样本的分析方法 因此我们的目标是研究出一种简单 快速 灵敏的 LC MS MS 法 并且无须固相萃取用来分析人血浆中四种不同唑类药物 这种方法采 用在含有内标物质的人血清中加入蛋白沉淀剂沉淀蛋白 随后用 HPLC 分析 MS MS 检测唑类药物的过度离子及内标物质 2 2 材料与方法 材料与方法 2 1 药品及试剂 氟康唑和伏立康唑 辉瑞公司 纽约 美国 泊沙康唑 先灵葆雅公司 纽约 美国 伊曲康唑和羟基伊曲康唑 扬森公司 内标物质蓝丙咪唑 罗氏公司 武尔 登 荷兰 乙腈和水为色谱纯由 BioSolve BV 公司 法尔肯斯瓦德荷兰 甲醇和其他使用的化学品为分析纯 VWR 阿姆斯特丹 荷兰 用甲醇 乙腈 4 21 v v 混合液溶解沉降剂 并向沉淀剂中加入 0 04 mg L 的蓝丙咪唑 可根据格罗宁根 大学医学中心的指导方针汇集人血清样品 2 2 LC MS MS 仪器及使用条件 LC MS MS 质谱仪 Thermo Fisher San Jose USA 三倍四级管 LC MS MS 配有 FinniganTM Surveyor 液相泵 FinniganTM Surveyor 自动进样器 设置温度为 20 分析柱为 C18 柱 5um 2 1mm 50mm HyPURITY AQUASTAR Interscience Breda The Netherlands 进样量为 5uL 的上清液 柱温 20 流动相了为水溶液 缓冲溶液 10g L 醋酸铵 醋酸 35mg L 和三氟乙酸酐液 2mL L 水 水和乙腈 流速为 0 3mL min 按照一下梯度运行 时间 0 2 分钟 5 缓冲液 95 0 水 0 95 乙腈 时间 2 3 分钟 5 缓冲液 95 乙腈 时间 3 0 3 1 分钟 5 缓冲液 95 水 时间 3 1 3 6 分钟 5 缓冲液 95 水 FinniganTM TSQ Quantum 三级四极杆串联质 谱联用仪 配有电喷雾离子化源 ESI 检测方式 正离子检测 在扫描宽度为 0 5m z 时测得的参数如下 氟康唑为 m z 307 2 219 9 碰撞能量 20 伏特 伏 立康唑为 m z 350 0 281 1 碰撞能量 17 伏特 泊沙康唑 m z 701 3 683 2 碰撞能量 32 伏特 伊曲康唑为 m z705 2 392 0 碰撞能量 36 伏特 羟基伊曲康唑为 m z 721 2 408 0 碰撞能量 42 伏特 蓝丙咪唑为 m z306 2 到 m z 218 0 碰撞能量 39 伏特 离子源喷雾电压为 3500V 鞘气压力为 35Arb 辅 助气压力为 5Arb 毛细管的温度为 350 应用 Xcalibur 软件 版本 1 4 SR1 Thermo Fisher San Jose USA 对所有的化合物进行峰高分析 2 3 标准储备液及血浆样品制备 每种化合物分别准备两种储备液 A1 和 B1 用于制备标准溶液和 QC 样本 并分别稀 释 A1 和 B1 得到工作储备液 A2 和 B2 见表 用人血清稀释 A1 和 A2 来制备标准溶 液 见表 用合并的人血浆 B1 和 B2 制备 QC 样本 QC 样本和标准溶液在 0 配制 20 保存 考察冻融稳定性的 QC 样本需在分析的第一天用 B1 和 B2 新鲜配制 2 4 样品的制备过程 将 100uL 血清样品 空白血清 标准溶液 QC 样本或病人血清 10uL 伏立康 唑和氟康唑 和 750uL 含内标物质的血浆蛋白沉淀剂 涡旋 1min 20 下储存 30min 促进蛋白质的沉降 高速离心 11000r p m 5min 取上清 5ul 进样 2 5 方法学验证 根据食品药品监督管理局生物分析方法 方法学确证包括选择性 线性 精密度 准确性 提取回收率和稳定性 因此 每天都要建立一个标准曲线 并且 QC 的每个浓 度的样品要测 5 个样本 分析六个不同的人的空白血清样本 每个测定三个样本 三 天的 QC 样本测定确定准确度和精密度 采用单向方差分析 2 6 临床实验 在大学医学中心每周进行 3 次伏立康唑血清水平监测 由于儿童的个体差异性更明 显 在采用伏立康唑抗真菌时需要特别的监控 伊曲康唑更适合预防曲霉菌 常规的 伊曲康唑的监测是用来监测结膜炎病人对于药物的吸收情况 当血清内药物浓度低于 1mg L 时 需增加剂量来进行监测 泊沙康唑用来预防高危病人的感染或是作为感染 的补救手段 需要控制高危病人的高脂肪食物的摄取 这样食物对危重病人是不适合 的 2 7 质量控制过程 我们实验室参加了国际质量控制协会 对于抗菌药物治疗监测及临床毒理学评价 KKGT 有助于优化了我们的临床治疗对唑类药物监测 误差的方法分析及建议用药 剂量 3 3 结果 结果 3 1 方法的建立 氟康唑和伏立康唑可引起很高的探测器响应 为避免超载 决定采取 10uL 血清样 本 校准标准 质量控制样品或病人的样本 进行这两种化合物的分析 3 2 方法的专属性 通过六个合并的人血清样本与定量下限样本的分析比较进行选择性方法的评价 分 析人血清合并样本时 唑类药物的保留时间内没有峰 能与内源物质峰分开 无金属离子 抑制 并且直接注射储备原液 储备原液包含内标物质和四种药物之一 3 3 线性 精确度和准确性 标准曲线用 1 X 权重因子进行校正 其中药物的浓度范围为 氟康唑 0 5 200 mg L 伏立康唑 0 05 10 mg L 伊曲康唑和羟基伊曲康唑 0 1 5 mg L 泊沙康唑 0 1 10 mg L 精密度和准确性的结果见表 2 标准曲线的批件差异见表 3 3 4 提取回收率 用高 中 低 QC 样本各 5 份测得的峰高与用甲醇 乙腈 4 21 v v 配制的同样浓 度的控制样本测得的结果进行比较 计算出提取回收率 高 中 低 QC 样本及内标物 质提取回收率结果见表 4 3 5 稳定性和稀释完整性 经过 2 3 个冻融循环 4 放置 36h 室温放置 36h 及在自动进样器进行样品准 备的高中低 QC 样本与新配制的高中低 QC 样本分别进行分析比较 结果见表 5 3 6 临床实验 这种对于唑类抗真菌药物监测的分析方法已经在我们医院使用了两年 我们发现 患有血液肿瘤的患者体内的肝药酶浓度是服用危险剂量的伏立康唑的正常受试者的 3 5 倍 说明伏立康唑的半衰期被极度的延长 因此治疗三天后的血药浓度监测是非常 必要的 从而防止伏立康唑引起的中毒的不良反应 唑类药物之间的相互作用是很常见的 药物相互作用的临床管理指导方针能有助 于指导唑类抗真菌治疗药物的监测 然而危重病人药物相互作用的程度比健康受试者 高很多 我们发现 与健康受试者比较 增加药物的剂量没能足够补充苯妥英的代谢 这结果说明需要对血液肿瘤患者进行白消安引起的癫痫发作的预防 对于儿童来说 当需要通过增加剂量来提高血清水平的监测结果时 血清水平药 物剂量的指导原则是很有用的 通过对泊沙康唑的常规监测可以发现 由于奥美拉唑会提高胃肠道的 值从而 降低生物利用度 因此与奥美拉唑合用时会大幅减低泊沙康唑在血清内的浓度 3 7 质量控制程序 在 2008 年 我们对于所有使用这种分析方法分析的样本都通过程序规章制度所制 定的要求 低浓度样本与真实值比较的平均值为 101 四分位数间距为 94 8 101 高浓度样本与真实值比较的平均值为 98 四分位数间距为 92 3 101 3 4 4 讨论 讨论 我们建立了用于唑类抗真菌药物日常监测分析通用的方法 其样品制备不费时且 更纯净 并且采用了 LC MS MS 配置进行测定 我们的分析方法是用先蛋白沉淀剂沉淀 血清蛋白 再用 LC MS MS 进行测定 并且按照食品药品监督管理局的指导方针进行方 法的确证 再定量限内 所有的血清样本都得到了很好的准确度和重现性 对于日间 及日内的样本分析也得到了很好的准确度和重现性 这种方法很适合于临床药代动力 学研究及常规监测 据我们所知 这是第一个用于所有唑类化合物的分析方法 对于人血清中唑类药物文献中有报道过用液相萃取或固相萃取来处理样本 再用 HPLC UV 或 HPLC fluorescence 方法进行检测 但这种方法缺少灵敏度及选择性 并且制备很费时 对于唑类药物大样本数高通量分析 采用一种快速通用的分析方法 是很必要的 串联质谱比单质谱检测灵敏性要高及选择性要好 液相萃取及固相萃取 费用高且制备费时 在线固相萃取能提高灵敏度但对于不同类型的抗真菌药物缺乏通 用性 因此很少用于常规监测 当稳定系统需要花费很多时间时 可以通过更换柱子 或改变流动相来优化分析方法 只采用沉淀蛋白法没采用其他的纯净方法很少被报道 已报道的分析方法也不能包含全部的唑类药物 并且一些仅局限于泊沙康唑在鼠血浆 的分析或是缺少样本制备的方法 我们的分析方法是无需液相萃取及固相萃取 仅需 沉淀蛋白的一种快速 简单及易使用的分析方法 使用这一种分析方法可以进行四种 唑类药物的日常监测 并且无需更换柱子及流动相 能够使样本的制备及结果测定在 同一天内完成 药师及医师便可以对药物的疗效及