食品中丙烯酰胺残留量的检测.doc

食品中丙烯酰胺残留量的检测丙烯酰胺，又名2-丙烯酰胺，CAS号76-06-1，分子量71.09，熔点84.5，沸点192.6。其聚合物聚丙烯酰胺主要用于市政供水处理中的絮凝剂和纸浆加工，也用作工业废水处理时去除悬浮固体，实验室用于进行凝胶电泳。丙烯酰胺可通过未破损的皮肤粘膜肺和消化道吸收入人体,分布于体液中丙烯酰胺可引起动物致畸致癌，一些实验已发现丙烯酰胺能导致哺乳动物细胞基因变异和染色体异常长期监测表明，它可致使雄性小鼠阴囊甲状腺肾上腺和雌性鼠乳腺甲状腺子宫产生肿瘤，丙烯酰胺可引起人体神经损害甚至使人瘫痪， 1994 年国际癌症研究协会认为丙烯酰胺可能使人致癌。欧仕益 食品中的丙烯酰胺问题研究进展，食品科技，No. 7. 2003， P64-65欧仕益等对食品中的丙烯酰胺的产生做了综述。食品中丙烯酰胺的产生：丙烯酰胺主要产生于高温加工食品中，食品在120下加工即会产生丙烯酰胺。对300 种食品的检测结果表明，大部分炸薯条和炸薯片、中部分面包、可可粉、杏仁、咖啡、饼干等中检测出了相当高浓度的丙烯酰胺。目前认为，丙烯酰胺主要通过美拉德反应产生，但对其详细机制还不是十分清楚。Mottram 等提出了以下反应机制，即氨基酸与还原糖反应产生二羰基化合物，后者与氨基酸经过几步反应产生丙烯醛，丙烯醛氧化产生丙烯酸，丙烯酸和氨或氨基酸反应形成丙烯酰胺。根据国外近年的研究，可初步得出以下结论：1.氨基酸在高温下热裂解其裂解，产物与还原糖反应产生丙烯酰胺；2.美拉德反应的初始反应产物，N-葡萄糖苷在丙烯酰胺的形成过程中起重要作用；3.a- 二羰基化合物与氨基酸反应释放出丙烯酰胺；4.Sterecker 降解反应有利于丙烯酰胺形成，因为该反应释放出一些醛类；5.自由基可能也影响丙烯酰胺的形成；6.丙烯酰胺形成的机制可能不止一种。3 影响丙烯酰胺形成的因素加工温度、时间、羰基化合物、氨基酸种类、食品含水量等都影响丙烯酰胺的形成。3.1 温度加工温度需在120 以上才能产生丙烯酰胺。Mottram 等采用等摩尔(0.1mol)的天冬酰胺和葡萄糖在100mL 0.5mol/L(pH=5.5)加热反应发现120时开始产生，丙烯酰胺随着温度的升高，丙烯酰胺产生量增加，至170 左右达到最高而后下降，185 时检测不到丙烯酰胺。3.2 时间加热时间对丙烯酰胺也有较大影响。Stadler 等将葡萄糖与天冬酰胺、谷氨酰胺和蛋氨酸在180 下共热560min 发现3 种氨基酸产生丙烯酰胺的情形表现不同，天冬酰胺产生量最高，但5min 后随反应时间的增加而下降；谷氨酰胺在10min 时达到最高，而后保持不变；蛋氨酸在30min 前随加热时间延长而增加，而后达到一个平稳水平。3.3 羰基化合物将葡萄糖、果糖、乳糖与天冬酰胺共热都产生较多丙烯酰胺， 似乎说明还原糖的种类对丙烯酰胺产生无重大影响。也有研究发现脂肪氧化产生的羰基化合物也能促进丙烯酰胺的形成。3.4 氨基酸羰基类化合物和氨基酸单独存在时加热不产生丙烯酰胺，只有当两者同时存在时加热才有丙烯酰胺形成。氨基酸中，以天冬酰胺最易与羰基化合物反应形成丙烯酰胺，其与葡萄糖共热产生的丙烯酰胺量高出谷氨酰胺和蛋氨酸的数百倍到1000多倍，这也就是为什么油炸土豆片丙烯酰胺含量高的主要原因(表1)。 因此，对表1 中天冬氨酸含量高的食物，在加工时要避免温度过高。3.5 食品含水量含水量较高有利于反应物和产物的流动，产生的丙烯酰胺量也多，但不是含水量越高越利于丙烯酰胺的产生，因为水过多使反应物被稀释，反应速度下降。动物实验和对从事丙烯酰胺生产的工人的流行病学调查都证明了这一点，从事丙烯酰胺生产和使用丙烯酰胺的人员都要进行严格的防护。另外，如果人体暴露于丙烯酰胺，会导致DNA损伤。动物实验表明，丙烯酰胺具有致癌性，国际肿瘤研究机构IARC将其归入2A类致癌物（对人体具有潜在致癌性）。过去，由于丙烯酰胺用于水处理的净化剂，人们的关注点也仅仅限于人工合成的丙烯酰胺在饮用水中的残留问题。为此，WHO规定了饮用水中丙烯酰胺的残留限量的推荐标准为0.5 g/l，欧盟在1998新的饮用水法规中规定丙烯酰胺的浓度不得超过0.1 g/l，澳大利亚和新西兰饮用水标准为0.2 g/l。我国1989年规定车间空气中丙烯酰胺最高容许浓度为0.3mgm3（GB 115251989）。2002年4月，瑞典科学家研究表明高温加热诸如马铃薯和小麦等食品，就会生成302000 g/kg丙烯酰胺。这一结果立刻在世界上引起了轩然大波, 迫使科学家重新认识丙烯酰胺的残留问题，为此WHO和FAO食品添加剂专家委员会应Codex委员会36次会议的要求，于2002年6月2527召集23位著名科学家对丙烯酰胺的毒性、形成机理重新进行了评估，综合这些科学家的意见，WHO在“食品中丙烯酰胺对健康的影响”报告中明确指出，丙烯酰胺对人体健康的潜在威胁不容忽视，并呼吁世界科技工作者对食品中丙烯酰胺的形成机理和毒理作用等进行深入的研究。随着人们对丙烯酰胺研究的深入，JECFA于2005年2月817日在意大利罗马召开了第64次联席会议，本次会议召集了15个国家的35为专家，对丙烯酰胺问题再次进行了评估。本次报告通过对丙烯酰胺在动物体和人体的吸收、发布、代谢以及毒理学数据等的评估，再次强调：丙烯酰胺对神经系统有明显的伤害作用，是人共知的神经毒害物质，尽管其致癌和其他毒理学机理还没有研究清楚，动物实验也再次表明丙烯酰胺具有致癌作用和对生殖毒害作用。报告还证实了瑞典科学家的发现，即含有高淀粉、低蛋白的植物源性食品当烘烤和油炸（一般温度大于120）时，即能产生丙烯酰胺。主要的食品是土豆条、油炸薯片和咖啡等。报告推荐了降低食品中丙烯酰胺含量的方法，提醒生产企业要继续努力降低食品中的丙烯酰胺，并要求国家食品安全部门催促生产企业提高生产技术，降低食品中的丙烯酰胺含量，特别是生产土豆条、油炸薯片、咖啡、饼干、面包的企业烘烤食品中含有大量丙烯酰胺的新发现，成为了公众关注的一个新的热点。食品中丙烯酰胺检测文献报道不多，主要采用气相色谱-质谱法（GC-MS）和质谱/质谱法（MS/MS）。瑞典国家食品局采用的是GC-MS法，以及新建立的MS/MS方法作进一步的确证，方法的检测限随样品基体不同有些不同，检测限为10 - 30mg/kg。英国国家食品标准局采用的是GC-MS法，它是基于文献方法“聚丙烯酰胺凝胶培养磨菇中的丙烯酰胺测定”（Journal of Agricultural & Food Chemistry, 1993, 41, 1261-1263）。美国FDA实验室于2002年7月23日在互联网上公布了食品中丙烯酰胺的检测标准草案，供大家讨论，其测定步骤是：采用OASIS HLB和Bond Elut固相萃取柱净化、浓缩，提取液经液相色谱分离，以正离子模式MS/MS测定，检测限可达到50mg/kg。 国内有饮用水中丙烯酰胺测定的标准GB 11936-89国内对于烘烤食品中丙烯酰胺检测没有现行的检验标准和食品标准，也没有相关的检测文献报道，。近来GC-MS和MS/MS技术，特别是MS/MS技术得到了极大的重视和发展。GC-MS和MS/MS技术在检测和鉴别残留物方面，最近国际分析科学刊物“Analyst”发表了一篇论文“LC-MS/MS法测定烘烤食品中丙烯酰胺的研究”（Analyst，2002，No7）。瑞典国家食品局和美国FDA采用的都是LC-MS/MS方法作为确证的方法。中文名称：丙烯酰胺;英文名称：acrylamide CAS#：76-06-1;相对分子质量：71.09 分子式：CH2CHCONH2基本物理化学性质：见表1表1 丙稀酰胺的溶解度（30）溶剂溶解度g/100ml溶剂溶解度g/100ml乙氰丙酮苯乙二醇丁醚氯仿1，2二氯乙烷N,N二甲基甲酰胺39.563.10.346312.661.50119124二氧杂环乙烷乙醇乙酸乙酯正庚烷甲醇吡啶水3006815561.9215.50.038丙烯酰胺的分析需要进行衍生化，衍生化体系主要是利用溴和丙烯酰胺分子中的碳碳双键加成。溴和烯烃的加成原理，通常认为是亲电加成，反应机制是两步的，是通过环状溴正离子（或称环状溴鎓离子）。即：另外，烯烃与溴在不同介质下进行反应，会有如下不同结果：上述三个反应中均有BrCH2CH2Br生成，但产物比例不同，体系中各种负离子浓度对加成产物有较大的影响。由前面丙烯酰胺的性质知道，较低的pH值对其保持稳定性是有利的，综合考虑衍生化体系中负离子和pH值两种因素，最终选择如下方案：通过KBr提高溶液中Br负离子的浓度；通过HBr来调节pH值比利用硫酸或盐酸调节pH值更加有效。食品中丙烯酰胺残留量检验方法用水提取试样中的丙烯酰胺，石墨化碳黑层析柱净化，溴水衍生，气相色谱-质谱仪（GC-MS）检测，内标法定量。 石墨化碳黑柱： 准确称取已粉碎的样品20 g（精确至1 mg）于三角瓶中，加水100 ml，加13C3同位素丙烯酰胺内标，振荡30 min，取上清液25 ml于离心管中，加入正己烷 20 ml，振荡10 min，离心（3000 rpm）5 min，弃去正己烷层。将水相进行高速冷冻离心30 min（12000 r/min， 4），上清液用玻璃棉过滤，过石墨化碳黑固相萃取柱(美国Supelco 公司)分别用5 ml甲醇和5 ml水活化，再用20 ml纯净水淋洗，收集过柱和淋洗后的溶液用于衍生化。净化后的溶液加溴化钾7.5 g，用HBr调pH值至13，再加溴水8 ml衍生，在 4条件下过夜。滴加硫代硫酸钠溶液(0.2 M)至黄色消失以除去残余的溴。将溶液转移到分液漏斗中，加乙酸乙酯 40 ml，振荡，静置分层，弃去水层。乙酸乙酯过无水硫酸钠后，浓缩至1 mL，供气相色谱-质谱测定。测定条件:色谱柱: HP-5 30 m 0.25 mm (内径) 0.25m（膜厚）。柱度: 65 (1 min)15 /min280 （15 min）。进样口温度: 280 。离子源温: 230 。传输线温度: 280 。离子源:EI源。测定方式：选择离子监测方式。选择监测离子（m/z）：108、150、152、110、153、155。载气: 氦气，纯度 99.999%，流速1.0 mL/min。进样方式: 无分流进样。进样量: 1 L。 丙烯酰胺标准品衍生物气相色谱-质谱总离子流图(TIC)图A2. 丙烯酰胺衍生物标准品气相色谱-质谱图图A23 丙烯酰胺和其同位素的质谱图（SIM）FDA发布食品中丙烯酰胺的定量检测方法(摘译自WWW.FDA.GOV)称1克碾碎的样品放到15ml带盖的聚丙烯锥形管中，加入10ml0.1%蚁酸，再加入200 L 的 1ng/L内标液(13C3标记的丙烯酰胺,在0.1%蚁酸中)。在搅拌器中混合20分钟（说明：不要加热、超声波降解或剧烈混合，因为这样会产生大量细颗粒充满SPE柱）。离心管在 9000r/min, 30 min，迅速取出 5 mL 上清液过滤和经OASIS HLB 6cc固相提取柱，200毫克填充物SPE (说明：当取出水溶液时，避免上部油层和底部固体层)。将 5 mL样品放置大旋转过滤管中，0.45 m PVDF (Alltech #2534)， 9000转/分 30 分钟离心，如果过滤受阻，在管中插入新的过滤器, 在新的过滤器中倒入未过滤的液体继续离心，直至大部分液体通过了过滤器。用5 mL甲醇，随后通过 5 mL 水预洗SPE柱。使用SPE柱排除甲醇和水 (说明：相当数量的 SPE柱在建立该方法时已经测试过，所有SPE柱具有不同的对被分析物的保持力和提取特性。不要在这一步骤未经测试用其它SPE吸附剂代替)。用2 mL试验提取物加入SPE 柱，让提取物完全通过吸附物质，然后用 1 mL水冲洗。2 mL提取液从SPE 柱提取丙烯酰胺 (10%甲醇：90%水：0.1%蚁酸)。 (说明：在任何SPE步骤不要使用真空加速提取方法)。通过0.45 m，10000r/min离心,过滤 500 L 甲醇SPE 提取液。液体色谱/质谱分析条件: C18高压液相柱(2x250 mm),用3微米粒子填充(Phenomonex, Torrance, CA)（说明：如果峰值消退或保留丢失，可用50：50甲醇：水溶液获得再生，随后通过流动相平衡） 流动相：0.1% 醋酸水溶液，0.5 %甲醇。流速：200 L/min。注射体积：20 L。柱温：26 C。离子化模型：ASE+。探针温度：2