柱离心法纯化质粒DNA及凝胶电泳.doc

柱离心法纯化质粒DNA及凝胶电泳一、实验目的 掌握碱裂解法提取质粒的原理 了解实验中所使用的试剂的作用二、基本原理质粒的分离是利用质粒DNA与染色体DNA在变性与复性中的差异来达到的目的。当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，由于染色体DNA与质粒DNA拓朴构型不同,染色体DNA双螺旋结构解开，而共价闭环质粒DNA的氢键虽被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕仍会紧密地结合在一起。当加入中和液后, 溶液pH调恢复至中性，在高盐浓度的情况下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构并与蛋白质-SDS复合物等形成沉淀；不同的是，质粒DNA复性迅速而准确，保持可溶状态而留在上清中。这样，通过离心可沉淀大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质。除去沉淀后上清中的质粒可用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离,鉴定DNA,RNA分子混合物的方法,这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物,利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应,达到分离混合物的目的.DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电,在电场中向阳极移动.在一定的电场强度下, DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比.不同构型的DNA分子的迁移速度不同.在质粒DNA分子样品,其中有三种构型的分子:共价闭合环状的超螺旋分子(cccDNA),开环分子(ocDNA),和线形DNA分子(IDNA).这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNAIDNAocDNA 。当用低浓度的荧光嵌入染料goldview染色,在紫外光下可以检出DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置.三、材料与试剂 1、E.coli 2、试剂：P1，P2，P3，去蛋白液PE,漂洗液WB,洗脱bufferEB; 琼脂糖，1x TAE（用50x TAE1:50稀释），goldview染料四、实验器材 1、20l 、200l、1000l移液枪各一把 2、微波炉 3、凝胶电泳槽 4、凝胶成像系统 5、枪头、1.5mlEP管若干五、实验步骤 （1）提取质粒DNA 1、培养细菌 2、收集菌体：取1.5ml培养液2次至Ep管中，9000rpm，离心1min，弃上清。将细菌沉淀悬浮于250l预冷溶液P1中，强裂振荡混匀，室温放置2min。3、变性：加入250l溶液P2，盖严管盖轻柔颠倒6-10次以混匀内容物。此时溶液变粘稠澄清。4、复性：加入400l溶液P3，温和振荡数次室温放置5min后13000rpm 离心10分5、取上清800l移至吸附柱，盖上收集管盖子，13000rpm 离心1min。6、弃滤液，向吸附柱内加入500l去蛋白液PE，13000rpm 离心1min。7、弃收集管中液体，向吸附柱内加入500l漂洗液WB，13000rpm 离心1min。此步骤需重复一次。8、再次盗取收集管中滤液，将吸附柱放回收集管中13000rpm 离心2min.9、将吸附柱放入新的EP管内，静置2min，想吸附柱内加入100l洗脱bufferEB，打开盖子室温放置2min后，13000rpm 离心1min，得离心管液体，即为所提取的质粒DNA.（2）质粒DNA琼脂糖凝胶电泳 1、取50TBE缓冲液2mL加水至100mL,配制成1TBE稀释缓冲液,待用。 2、胶液的制备：称取0.8g琼脂糖,置于200mL锥形瓶中,加入800mL 1TBE稀释缓冲液,放入微波炉里加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为1%琼脂糖凝胶液.加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液.3、胶板的制备:将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏紧密封住.将封好的胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子。向冷却至50-60的琼脂糖胶液中加入4l goldview染液，小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层.待胶完全凝固后拨出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向电泳槽内加入缓冲液至液面恰好没过胶板上表面.。4、加样:取10L DNA样品与2L 指示剂溴酚蓝混匀,用移液枪小心加入样品槽中。每加完一个样品要更换tip头,以防止互相污染,注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿、 5、电泳:加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源.控制电压保持在100V，电泳30-40min。.6、观察和拍照:在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的电泳胶板。六、实验结果及分析 电泳结果如下图：最后两道为实验结果。第三条带亮度最大带最宽，说明含量最多，第二条带亮度最浅条带最窄，说明含量最低，三中条带比较清晰的分离出来。根据原理可知，从下至上的条带依次为：cccDNA, ocDNA, LDNA.琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度.当分离的DNA片段越小时，琼脂糖的浓度应越大。在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定: 1, DNA的分子大小2, 琼脂糖浓度3, DNA分子的构象 4, 电源电压 5,嵌入染料的存在 6, 离子强度影响 实验室中常用EB作为染料着色DNA，EB是强诱变剂并有中等毒性,配制和使用时都应戴手套,并且不要把EB洒到桌面或地面上.凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理